不同基因型別紋帶棒狀桿菌耐藥特點和生物膜形成能力分析

孫 偉， 夏 帥， 樊玉健， 馬立艷

（1.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院臨床檢驗中心，北京 100050；2.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院危急重癥中心，北京 100050；3.首都醫(yī)科大學臨床檢驗診斷學系，北京 100069）

紋帶棒狀桿菌（Corynebacterium striatum）是臨床微生物實驗室最常分離的棒狀桿菌屬細菌。由于紋帶棒狀桿菌可以寄生于人類的皮膚和黏膜表面，所以臨床標本分離到該菌時通常被認為是定植菌的污染，很少處理。近年來，隨著對棒狀桿菌屬細菌相關(guān)研究的深入和臨床實驗室檢測技術(shù)的進步，紋帶棒狀桿菌感染的報道逐漸增多，如肺炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎、傷口感染、腹膜炎、敗血癥和關(guān)節(jié)感染等[1-7]。有研究結(jié)果顯示，臨床分離的棒狀桿菌通常為多重耐藥菌（multi-drug resistance，MDR），并且可以通過環(huán)境或者醫(yī)護人員的手在患者之間傳播，與醫(yī)療服務(wù)相關(guān)的多重耐藥紋帶棒狀桿菌造成的感染不容忽視，已有的數(shù)據(jù)資料均強調(diào)，持續(xù)監(jiān)測棒狀桿菌屬細菌抗菌藥物敏感性十分必要[6-8]。但是，既往關(guān)于棒狀桿菌的多數(shù)研究樣本來源廣泛，且以痰樣本居多；研究對象豐富，通常包含棒狀桿菌屬的多個種。本研究以無菌體液和清潔中段尿樣本來源的紋帶棒狀桿菌作為研究對象，通過對36株紋帶棒狀桿菌的多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）、藥物敏感性、生物膜形成能力等進行綜合分析，考察不同基因型別的紋帶棒狀桿菌在藥物敏感性和生物膜形成能力方面的差異，為臨床診治紋帶棒狀桿菌感染提供實驗室依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2018年1月—2020年12月首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院紋帶棒狀桿菌非重復(fù)臨床分離株36株。其中，分離自清潔中段尿樣本15株，分離自其他無菌體液樣本21株。

1.2 儀器和試劑

哥倫比亞血平板（美國THERMO公司）、鈣離子調(diào)節(jié)MH肉湯（英國OXOID公司）；MOLDI-TOF MS儀及配套基質(zhì)液CHCA（法國生物梅里埃公司）；細菌基因組DNA提取試劑盒及配套聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增試劑[天根生化科技（北京）有限公司]；引物合成和測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；MTT試劑盒和無菌馬血（北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌種鑒定 按照第4版《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[9]要求培養(yǎng)并分離菌株，挑取哥倫比亞血平板上的單個可疑菌落，采用MOLDI-TOF MS儀進行鑒定，將鑒定為紋帶棒狀桿菌的菌株凍存?zhèn)溆?。質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC 8739）購自美國菌種保藏中心。

1.3.2 MLST分型 將凍存的36株紋帶棒狀桿菌復(fù)蘇，按照細菌基因組DNA提取試劑盒操作說明提取各菌株基因組DNA。參照文獻設(shè)計MLST分型引物[6，10]，采用PCR擴增16srRNA、ITS1、gyrA和ropB基因并測序。將4個基因序列結(jié)果用MEGA7.0軟件進行拼接和比對分析，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.3.3 生物膜形成能力檢測 采用MTT法檢測36株紋帶棒狀桿菌在96孔聚苯乙烯平板表面形成生物膜的能力。用胰蛋白胨大豆肉湯調(diào)節(jié)菌懸液濃度為2×108CFU/mL，200 μL/孔進行接種，同時設(shè)陰性對照孔（胰蛋白胨大豆肉湯不加菌液）和陽性對照孔[金黃色葡萄球菌（ATCC 43300）]，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，每組設(shè)3個復(fù)孔。棄上清，用磷酸鹽緩沖液（0.01 mmol/L，pH值7.2）輕柔洗板3次。重新向孔板內(nèi)依次加入胰蛋白胨大豆肉湯（90 μL/孔）和MTT試劑（10 μL/孔），37 ℃繼續(xù)孵育4 h。棄上清，向各孔依次加入110 μL Formazan溶解液，低速搖床上震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，測量490 nm處各孔吸光度值（A）。重復(fù)檢測3次。

1.3.4 體外藥物敏感性試驗 根據(jù)美國臨床實驗室標準化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準[10]，采用瓊脂稀釋法檢測36株紋帶棒狀桿菌對10種抗菌藥物（萬古霉素、利奈唑胺、利福平、慶大霉素、克林霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素、頭孢噻肟、紅霉素、青霉素）的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC 25922）和肺炎鏈球菌（ATCC 49619）購自美國菌種保藏中心。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示。計數(shù)資料以例或率表示，比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 36株紋帶棒狀桿菌臨床分布

36例紋帶棒狀桿菌感染患者中男23例、女13例，年齡（69.5±16.3）歲。患者科室分布：急診科3例、普通外科6例、消化科1例、泌尿科9例、老年醫(yī)學科11例、重癥醫(yī)學科6例。36例患者基礎(chǔ)疾?。ㄈ朐涸\斷）包括耳部感染（1例）、泌尿系感染（4例）、腎結(jié)石（4例）、呼吸系統(tǒng)疾?。?例）、糖尿?。?例）、心血管系統(tǒng)疾?。?例）、惡性腫瘤（10例）、異體腎移植（1例）、肝移植（1例）、其他（9例）。

2.2 MLST各型別菌株的系統(tǒng)進化關(guān)系

MLST結(jié)果顯示，36株紋帶棒狀桿菌共分為9個基因型別，其中ST2型（9株，25.0%）和ST6型（13株，36.1%）為優(yōu)勢基因型別，另外14株（38.9%）分別屬于7個不同的基因型別。各基因型別菌株的進化關(guān)系見圖1。

圖1 各基因型別紋帶棒狀桿菌的系統(tǒng)進化樹分析

2.3 生物膜形成能力檢測結(jié)果

MTT法檢測結(jié)果顯示，36株紋帶棒狀桿菌均能夠在聚苯乙烯表面形成生物膜，但是各菌株形成生物膜的能力不同。依據(jù)A490nm值將36株紋帶棒狀桿菌的產(chǎn)膜能力分為低產(chǎn)組（A490nm值為0～1.0）、中產(chǎn)組（A490nm值為1.0～2.0）和高產(chǎn)組（A490nm>2.0），其中高產(chǎn)組24株、中產(chǎn)組6株、低產(chǎn)組6株，各組生物膜產(chǎn)量差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。ST2基因型各菌株與ST6和其他7種基因型各菌株相比，具有更強的成膜能力（P<0.05、P<0.01）。見圖2。

圖2 36株紋帶棒狀桿菌生物膜形成能力分析

2.4 體外藥物敏感性試驗結(jié)果

根據(jù)CLSI M45[11]判讀標準，36株紋帶棒狀桿菌均為MDR。所有菌株僅對萬古霉素和利奈唑胺100%敏感；對青霉素、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、紅霉素和克林霉素的敏感率均<15%。而利福平、慶大霉素、四環(huán)素的MIC90在優(yōu)勢基因型別菌株間有顯著差異，ST2型以四環(huán)素敏感株為主，MIC90為4 μg/mL；ST6型則以慶大霉素和利福平敏感株為主，MIC90分別為4 μg/mL和1 μg/mL。見表1。

表1 不同基因型別的紋帶棒狀桿菌的藥物敏感性特點 μg/mL

3 討論

紋帶棒狀桿菌是臨床分離率最高的非白喉棒狀桿菌。多年來，由于不易區(qū)分定植和感染，非白喉棒狀桿菌的潛在致病性一直被忽視。有學者認為，不結(jié)合臨床和患者自身狀況，統(tǒng)一將MDR紋帶棒狀桿菌視為污染菌是非常嚴重的錯誤，尤其是對于有侵入性操作的慢性病患者和長期免疫功能低下的患者[12]。從紋帶棒狀桿菌相關(guān)研究的全面展開可以看出，紋帶棒狀桿菌相關(guān)的感染已經(jīng)引起了世界范圍的科研工作者和醫(yī)務(wù)人員的廣泛關(guān)注。既往棒狀桿菌相關(guān)研究的樣本類型以痰樣本居多，且研究對象通常為多種棒狀桿菌，紋帶棒狀桿菌只是其中的1種。本研究從臨床工作實際出發(fā)，收集3年間從無菌體液和清潔中段尿樣本中分離的36株棒狀桿菌，并對患者臨床資料進行分析，發(fā)現(xiàn)紋帶棒狀桿菌主要參與免疫功能低下的老年患者的感染進程，尤其是經(jīng)歷過手術(shù)或侵入性操作、長期住院、應(yīng)用廣譜抗菌藥物、患有糖尿病、惡性腫瘤或器官移植的患者。

有研究結(jié)果顯示，紋帶棒狀桿菌可以引起慢性阻塞性肺疾病，可通過醫(yī)護人員的手或者環(huán)境在患者之間傳播，雖然該菌僅在醫(yī)務(wù)人員的手部短暫停留，同一克隆卻可以在環(huán)境中或患者的呼吸道中存在數(shù)月[6]，提示在院感防控工作中也應(yīng)對紋帶棒狀桿菌給予高度重視。本研究MLST結(jié)果顯示，36株紋帶棒狀桿菌分屬于9個基因型別，其中ST6（36.1%）和ST2（25.0%）為優(yōu)勢型別。雖然本研究中各型別菌株在分離時間和空間上不具有相關(guān)性，仍應(yīng)引起臨床和院感人員的高度重視，建議做好日常手衛(wèi)生和環(huán)境、醫(yī)療器械消毒，防止紋帶棒狀桿菌相關(guān)院內(nèi)感染的發(fā)生。

生物膜是多種致病微生物的重要毒力因子，也是造成病原菌耐藥和復(fù)發(fā)感染的重要機制。臨床經(jīng)驗性治療會導(dǎo)致MDR的產(chǎn)生，生物材料或非生物材料表面生物膜的形成有利于紋帶棒狀桿菌毒力作用的維持和抗菌藥物耐藥性在醫(yī)療環(huán)境中的播散[13-16]。紋帶棒狀桿菌暴發(fā)感染的相關(guān)研究對紋帶棒狀桿菌進行了MLST分型和生物膜檢測，但是未對基因型別與生物膜的形成能力是否存在關(guān)聯(lián)展開深入分析[17-19]。本研究結(jié)果顯示，36株紋帶棒狀桿菌均為MDR，且不論何種基因型別，均具有在聚苯乙烯表面形成生物膜的能力，其中優(yōu)勢型別菌株（ST2和ST6）具有更強的生物膜形成能力，并對除萬古霉素和利奈唑胺之外的多種抗菌藥物具有更強的耐藥性，這可能與生物膜參與紋帶棒狀桿菌的耐藥有關(guān)。值得注意的是，通過對ST6（13株）和ST2（9株）菌株的成膜能力與藥物敏感性試驗結(jié)果（MIC50和MIC90）進行深入、細致的比較，發(fā)現(xiàn)這2種型別的紋帶棒狀桿菌對四環(huán)素、慶大霉素和利福平3種藥物的敏感性差異較大：ST6型菌株對四環(huán)素的MIC90為64 μg/mL（耐藥），對慶大霉素和利福平的MIC90分別為4 μg/mL（敏感）和1 μg/mL（敏感）；而ST2型菌株對四環(huán)素的MIC90為4 μg/mL（敏感），對慶大霉素和利福平的MIC90分別為16 μg/mL（耐藥）和>64 μg/mL（耐藥）。這提示ST2和ST6基因型別的菌株可能攜帶針對不同抗菌藥物的耐藥基因和/或具有其他相關(guān)耐藥機制，后續(xù)可以此為切入點進行深入研究。在臨床診療過程中，需要充分考慮到菌株基因型別差異對上述3種藥物抗菌效果產(chǎn)生的可能影響，合理選用抗菌藥物，提高療效。

目前，紋帶棒狀桿菌的相關(guān)研究主要集中于耐藥機制方面，關(guān)于侵襲性感染的紋帶棒狀桿菌的微生物學特征和致病機制的研究相對較少[20-21]。后續(xù)我們將深入開展臨床流行株的毒力因子和致病特點，以及紋帶棒狀桿菌對常用消毒劑的抗性研究。除了關(guān)注紋帶棒狀桿菌對萬古霉素的敏感性外，更要注意其多重耐藥性，加強對此類細菌耐藥性的持續(xù)監(jiān)測。對紋帶棒狀桿菌進行準確的臨床和實驗室診斷、藥物敏感性檢測，以指導(dǎo)臨床合理選用抗菌藥物，有效預(yù)防患者的不良結(jié)局。