微量元素硼對(duì)大鼠回腸顯微結(jié)構(gòu)、消化酶活性、屏障功能及抗氧化功能的影響

韓玉皎，鄧 娟，趙春芳，胡倩倩，任 曼，顧有方,2，靳二輝,2,*，李升和,2,*

（1. 安徽科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng) 233100；2.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控與健康安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 鳳陽(yáng) 233100）

硼是位于元素周期表第二周期第三主族的一種礦物元素，在自然界中不以單質(zhì)形式存在，常以無(wú)機(jī)氧化物的形式存在于海洋和礦物中，或在有機(jī)物和生物系統(tǒng)中以硼酸酯的形式存在。在工業(yè)生產(chǎn)中，硼砂、硼酸以及其他精制產(chǎn)品被廣泛用于玻璃制品、洗滌產(chǎn)品、陶瓷釉料、木材防腐劑、殺蟲(chóng)劑和肥料。近些年研究發(fā)現(xiàn)，硼是人和動(dòng)物可能的必需微量元素，其在動(dòng)物機(jī)體許多生物合成和代謝中起著重要作用，對(duì)于維持動(dòng)物和人類(lèi)正常生理功能具有重要意義。適量補(bǔ)充硼可增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫功能，促進(jìn)激素分泌和傷口愈合，有利于骨骼新陳代謝和再生，并且在一定程度上可降低前列腺癌和乳腺癌的發(fā)生率。

與許多必需微量元素一樣，硼在動(dòng)物體內(nèi)呈現(xiàn)出U型的劑量-反應(yīng)曲線。補(bǔ)充適量硼可對(duì)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生一定益處，但攝入過(guò)量硼則對(duì)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生不同程度損傷。相關(guān)研究表明，飲水中添加20 mg/L和40 mg/L硼可提高大鼠血清免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）濃度，促進(jìn)脾臟白細(xì)胞介素4（interleukin-4，IL-4）和干擾素γ（interferon γ，IFN-γ）表達(dá)，增加脾臟CD3、CD4T細(xì)胞以及增殖細(xì)胞核抗原細(xì)胞數(shù)量，而補(bǔ)充高于320 mg/L的硼則對(duì)免疫功能產(chǎn)生抑制，甚至毒性作用。Khaliq等研究發(fā)現(xiàn)，育雛期非洲鴕鳥(niǎo)養(yǎng)殖過(guò)程中飲水添加40～160 mg/L硼可促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)激素的生成和分泌，維持鴕鳥(niǎo)的正常免疫功能，而飲水添加640 mg/L硼則導(dǎo)致腎上腺膠原纖維增厚，腎間組織萎縮，腎上腺結(jié)構(gòu)損傷。董柵杉研究表明，飲水中補(bǔ)充5 mg/L硼，可顯著增加90 日齡雌性大鼠的白細(xì)胞和血小板數(shù)量，且隨著硼補(bǔ)充量的增加，白細(xì)胞和血小板數(shù)量呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。Sizmaz等研究報(bào)道日糧中添加175 mg/kg硼酸可顯著提高肉仔雞的生產(chǎn)性能和飼料轉(zhuǎn)化率，并能對(duì)抗氧化功能產(chǎn)生積極影響。同樣，飲水中添加100 mg/L硼對(duì)日齡14 d以上的固始雞生長(zhǎng)有明顯促進(jìn)作用，其平均體質(zhì)量和平均日增質(zhì)量均顯著提升，而飲水補(bǔ)充大于200 mg/L硼則導(dǎo)致生長(zhǎng)情況明顯受到抑制。

以上研究充分表明，添加不同劑量的硼對(duì)動(dòng)物機(jī)體免疫功能、激素分泌、血液生理指標(biāo)以及生產(chǎn)性能等方面均可產(chǎn)生明顯影響，但其對(duì)哺乳動(dòng)物腸道顯微結(jié)構(gòu)及屏障功能的影響的報(bào)道較少。因此，本實(shí)驗(yàn)以大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)對(duì)飲水補(bǔ)充不同劑量的硼，探究其對(duì)大鼠回腸的顯微結(jié)構(gòu)、消化酶活性、屏障功能及抗氧化功能的影響，以期為硼在人和動(dòng)物中的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

清潔級(jí)剛斷乳（體質(zhì)量（22±2）g）健康SD大鼠100 只購(gòu)自南京市江寧區(qū)的青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2017-0001）。動(dòng)物使用由安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)審查和批準(zhǔn)，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均嚴(yán)格按照省《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》和《國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的護(hù)理和使用指南》進(jìn)行。動(dòng)物飼養(yǎng)在安徽科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房的獨(dú)立通氣籠具內(nèi)，室溫控制在22～25 ℃，相對(duì)濕度控制在50%～60%，給予14 h光照10 h黑暗的光照周期，自由采食和飲水。動(dòng)物飼養(yǎng)前所有籠子、蓋子和水瓶均進(jìn)行消毒處理。

硼酸（純度≥99.5%、硼含量≥17.4%） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。總蛋白（total protein，TP）、乳糖酶、麥芽糖酶、-淀粉酶（-amylase，-AMS）、脂肪酶（lipase，LPS）、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測(cè)定試劑盒南京建成生物工程研究所；XL-Er1716分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，SIg A）測(cè)定試劑盒、XL-Er0752閉合小環(huán)蛋白（ZO-1）測(cè)定試劑盒、XL-Er0765閉鎖蛋白（Occludin）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）測(cè)定試劑盒上海鑫樂(lè)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

VM1全自動(dòng)數(shù)字切片掃描與應(yīng)用系統(tǒng) 麥克奧迪（廈門(mén)）醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司；YB-6生物組織包埋機(jī)湖北孝感亞光醫(yī)用電子技術(shù)研究所；TEC 2500病理組織漂烘儀 常州市郝思琳醫(yī)用儀器有限公司；RM2235石蠟輪轉(zhuǎn)切片機(jī) 德國(guó)Leica系統(tǒng)有限公司；Allegra X-30R冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼公司；GHP9080隔水式培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Multiskan Go全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，按照體質(zhì)量相近原則分為10 組，分別為1個(gè)對(duì)照組和9個(gè)實(shí)驗(yàn)組（每組10 只）。對(duì)照組大鼠飲用滅菌蒸餾水，實(shí)驗(yàn)I～I(xiàn)X組大鼠分別飲用添加5、10、20、40、80、160、320、480 mg/L和640 mg/L硼的蒸餾水，實(shí)驗(yàn)期60 d。

1.3.2 樣品采集與處理

所有大鼠禁食不禁水過(guò)夜，乙醚麻醉，心臟采血并放血致死，立即采集回腸?；啬c組織分為3 份，一份固定在質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛-磷酸緩沖固定液中，用于蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色；一份固定在卡諾固定液中用于阿利辛藍(lán)-過(guò)碘酸雪夫氏（periodic acid Schiff and alcian blue stain，AB-PAS）染色；另一份液氮冷凍后保存于-80 ℃，用于消化酶活力、SIg A表達(dá)量、緊密連接蛋白表達(dá)量及抗氧化功能測(cè)定。

1.3.3 動(dòng)物進(jìn)食狀況觀察和體質(zhì)量測(cè)定

實(shí)驗(yàn)期內(nèi)，每天觀察大鼠采食和精神活動(dòng)情況，每周定時(shí)采用電子天平空腹測(cè)定每只大鼠體質(zhì)量，連續(xù)測(cè)定至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。計(jì)算大鼠每周體質(zhì)量增加情況，同時(shí)觀察每組大鼠采食和精神活動(dòng)狀況，每次觀察時(shí)間10～20 min，記錄大鼠采食變化和精神狀態(tài)。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)本團(tuán)隊(duì)前期研究。

1.3.4 HE染色

HE染色方法參照J(rèn)in Erhui等的方法進(jìn)行操作?；啬c經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛-磷酸緩沖固定液充分固定后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明、石蠟包埋，石蠟輪轉(zhuǎn)切片機(jī)切片（厚5 μm），每10 張切片取1 片用于HE染色。染色結(jié)果使用全自動(dòng)數(shù)字切片掃描與應(yīng)用系統(tǒng)進(jìn)行觀察并拍照。每張回腸切片選取5 根完整的腸絨毛。采用IPP6.0軟件測(cè)量并統(tǒng)計(jì)腸絨毛高度和隱窩深度，同時(shí)計(jì)算絨毛高度/隱窩深度（vomeronasal height/crypt depth，V/C）比值。

1.3.5 AB-PAS染色

大鼠回腸經(jīng)卡諾固定液固定充分后，再經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，石蠟輪轉(zhuǎn)切片機(jī)切片（厚5 μm），每10 張切片取1 片用于AB-PAS染色。回腸切片脫蠟至水，阿利辛藍(lán)浸泡5 min，自來(lái)水沖洗5 min，1%過(guò)碘酸水溶液氧化5 min，蒸餾水洗滌，放入Schiff試劑，37 ℃染色15 min，亞硫酸鈉溶液洗滌3 次（每次3 min），流水沖洗10 min，上行分化，最后使用中性樹(shù)膠封片。染色結(jié)果使用全自動(dòng)數(shù)字切片掃描與應(yīng)用系統(tǒng)進(jìn)行觀察并拍照。每張回腸切片選擇5個(gè)完整腸絨毛借助IPP 6.0版軟件統(tǒng)計(jì)每100個(gè)腸上皮細(xì)胞中杯狀細(xì)胞（goblet cell，GC）和上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞（intraepit helial lymphocyte，IEL）數(shù)量。

1.3.6 消化酶活力測(cè)定

大鼠回腸組織經(jīng)室溫解凍后，在冰浴中勻漿，制備10%組織勻漿，3 000 r/min離心15 min，取上清液。一部分回腸勻漿用TP試劑盒測(cè)定回腸蛋白質(zhì)含量，其余用相應(yīng)試劑盒測(cè)定回腸乳糖酶、麥芽糖酶、-AMS、LPS活力。

1.3.7 回腸SIg A、ZO-1和Occludin表達(dá)量測(cè)定

大鼠回腸組織勻漿室溫解凍后，按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定回腸SIg A、ZO-1和Occludin表達(dá)量，具體操作步驟依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，并采用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。SIg A、ZO-1和Occludin表達(dá)量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程決定系數(shù)分別為0.987 5、0.951 8和0.991 4。

1.3.8 抗氧化功能測(cè)定

大鼠回腸組織經(jīng)室溫解凍后，在冰浴中勻漿，制備10%組織勻漿，3 000 r/min離心15 min，取上清液。一部分回腸勻漿用TP試劑盒測(cè)定回腸蛋白質(zhì)含量，其余用于回腸T-AOC、SOD活力和GSH-Px含量測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行One-way ANOVA分析，采用Dunnett’s檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的顯著性差異，＜0.05表示差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 硼對(duì)大鼠的進(jìn)食狀況和體質(zhì)量的影響

通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)I和II組大鼠行為表現(xiàn)出興奮性增強(qiáng)、精神狀態(tài)良好、采食次數(shù)增加。與對(duì)照組相比，隨著飲水硼添加劑量的增加，大鼠的體質(zhì)量出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)I～V組大鼠體質(zhì)量出現(xiàn)不同程度升高。而實(shí)驗(yàn)VI～I(xiàn)X組硼大鼠體質(zhì)量呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)VIII和IX組大鼠表現(xiàn)出行動(dòng)遲緩、常靜立不動(dòng)、采食次數(shù)減少。

2.2 硼對(duì)大鼠回腸絨毛影響的顯微結(jié)構(gòu)

由圖1可見(jiàn)，對(duì)照組大鼠回腸絨毛顯微結(jié)構(gòu)正常，絨毛高度和寬度適中，絨毛柱狀上皮細(xì)胞排列緊密。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)I和III組大鼠回腸絨毛明顯增高，寬度明顯增加，柱狀上皮細(xì)胞有所增高，排列更加緊密。實(shí)驗(yàn)II和VI組回腸絨毛高度明顯降低，寬度有所變窄，柱狀上皮細(xì)胞數(shù)量減少。實(shí)驗(yàn)VIII組大鼠回腸絨毛明顯變短，絨毛柱狀上皮細(xì)胞脫落、排列疏松，固有層內(nèi)細(xì)胞明顯減少，且與上皮分離，但絨毛寬度變化不明顯。實(shí)驗(yàn)IV、V、VII組和IX組大鼠回腸絨毛高度和寬度無(wú)明顯變化。

圖1 大鼠回腸絨毛顯微結(jié)構(gòu)（16×）Fig. 1 Histological structure of rat ileum (16 ×)

由表1可知，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)I、III組大鼠回腸絨毛高度分別顯著增加29.99%（＜0.01）、23.15%（＜0.05），而實(shí)驗(yàn)VIII組極顯著降低34.12%（＜0.01）；實(shí)驗(yàn)VII、IX組大鼠回腸隱窩深度分別顯著增加49.63%（＜0.01）和41.72%（＜0.05），而實(shí)驗(yàn)VIII組顯著降低33.85%（＜0.05）。V/C比值在實(shí)驗(yàn)I、II、III及IV組呈現(xiàn)出一定的增大趨勢(shì)，在實(shí)驗(yàn)VII和IX組呈現(xiàn)出一定的下降趨勢(shì)，但均差異不顯著（＞0.05）。

表1 硼對(duì)大鼠回腸絨毛高度、隱窩深度和V/C比值的影響Table 1 Effect of boron on ileum villus height, crypt depth and villus/crypt ratio

2.3 硼對(duì)大鼠回腸絨毛中GC和IEL數(shù)量的影響

由圖2可見(jiàn)，對(duì)照組大鼠回腸絨毛上皮中GC呈高腳杯狀，其頂部胞質(zhì)含有大量黏原顆粒，呈藍(lán)紫色，主要分布于腸絨毛柱狀上皮細(xì)胞之間；IEL主要分布在上皮細(xì)胞的基膜內(nèi)側(cè)，少量位于上皮細(xì)胞之間。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)I和II組大鼠回腸絨毛中GC和IEL數(shù)量明顯增多、分布密集，且染色明顯較深；實(shí)驗(yàn)III、IV、V和VI組大鼠回腸絨毛中GC和IEL數(shù)量和分布均無(wú)明顯變化；而實(shí)驗(yàn)VII、VIII、IX組回腸絨毛上GC和IEL數(shù)量均明顯減少，且分布比較集中。

圖2 硼對(duì)大鼠回腸GC、IEL數(shù)量的影響（40×）Fig. 2 Effect of boron on the number of GC and IEL in rat ileum (40 ×)

由表2可知，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)I、II組大鼠回腸絨毛中GC數(shù)量分別顯著增加24.39%（＜0.01）、12.54%（＜0.05），而實(shí)驗(yàn)VII、VIII和IX組分別極顯著減少19.09%、27.26%以及34.02%（＜0.01）。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)I、II組大鼠回腸絨毛中IEL數(shù)量分別極顯著增加54.25%、49.36%（＜0.01），而實(shí)驗(yàn)VII、VIII和IX組分別極顯著減少29.96%、30.47%以及42.23%（＜0.01）。

表2 硼對(duì)大鼠回腸IEL和GC數(shù)量的影響（每100個(gè)上皮細(xì)胞中細(xì)胞數(shù)量）Table 2 Effects of different boron levels on the number of IEL and GC in rat ileum (cells/100 epithelial cells)

2.4 硼對(duì)大鼠回腸消化酶活力的影響

由圖3可知，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)I組大鼠回腸麥芽糖酶活力顯著增加76.51%，而實(shí)驗(yàn)IV、VIII和IX組分別顯著降低63.32%、66.89%以及56.46%（＜0.05）。實(shí)驗(yàn)I、II、VI組大鼠回腸乳糖酶活力分別極顯著增加139.97%、150.83%以及118.15%（＜0.01）；實(shí)驗(yàn)I、VI組大鼠回腸-AMS活力也分別極顯著增加125.62%和83.51%（＜0.01），而實(shí)驗(yàn)IV組顯著降低54.80%（＜0.05）。實(shí)驗(yàn)I組大鼠回腸LPS活力極顯著增加48.23%（＜0.01），而實(shí)驗(yàn)IV、V、VII和VIII組分別極顯著減少59.82%、46.74%、42.81%以及48.33%（＜0.01）。

圖3 硼對(duì)大鼠回腸消化酶活力的影響Fig. 3 Effect of boron on the activity of digestive enzymes in rat ileum

2.5 硼對(duì)大鼠回腸SIg A、ZO-1和Occludin表達(dá)量的影響

由圖4可知，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)II、III組大鼠回腸SIg A表達(dá)量分別顯著增加14.51%、14.00%（＜0.05），而實(shí)驗(yàn)VII、VIII以及IX組分別顯著減少23.84%（＜0.05）、42.54%（＜0.01）及64.83%（＜0.01）。實(shí)驗(yàn)I、II組大鼠回腸ZO-1表達(dá)量分別顯著增加36.01%（＜0.05）、92.19%（＜0.01），而實(shí)驗(yàn)VII、VIII以及IX組分別顯著減少36.36%、36.01%以及32.63%（＜0.05）。實(shí)驗(yàn)I、II以及III組大鼠回腸Occludin的表達(dá)量分別顯著增加74.36%（＜0.01）、76.92%（＜0.05）以及42.31%（＜0.05），而實(shí)驗(yàn)V、VII、VIII以及IX組分別顯著減少41.03%（＜0.05）、70.51%（＜0.01）、78.21%（＜0.01）以及55.13%（＜0.01）。

圖4 硼對(duì)大鼠回腸SIg A、ZO-1和Occludin表達(dá)量的影響Fig. 4 Effect of boron on SIg A, ZO-1 and occludin expression in rat ileum

2.6 硼對(duì)大鼠回腸抗氧化功能的影響

由圖5可知，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)I組大鼠回腸T-AOC顯著增加16.59%（＜0.05），而實(shí)驗(yàn)VIII、IX組分別顯著降低14.20%和14.54%（＜0.05）。實(shí)驗(yàn)I、II、III和VI組大鼠回腸SOD活力分別顯著增加66.39%、77.57%、37.66%以及156.92%（＜0.05、＜0.01）。實(shí)驗(yàn)I、II、V和VI組大鼠回腸GSH-Px含量分別顯著增加227.22%、105.63%、149.72%以及437.75%（＜0.05、＜0.01）。實(shí)驗(yàn)IV組大鼠回腸T-AOC、SOD活力和GSH-Px含量均無(wú)顯著變化（＞0.05）。

圖5 硼對(duì)大鼠回腸抗氧化功能的影響Fig. 5 Effect of boron on the antioxidant function of rat ileum

3 討 論

3.1 飲水補(bǔ)充不同劑量硼對(duì)大鼠回腸顯微結(jié)構(gòu)的影響

研究證明，絨毛高度、隱窩深度以及V/C比值能夠直接反映腸道的功能狀況。絨毛高度與細(xì)胞數(shù)量呈正顯著相關(guān)，腸絨毛高度增加，其上皮細(xì)胞數(shù)量增多，養(yǎng)分吸收能力增強(qiáng)，絨毛高度降低，上皮細(xì)胞數(shù)量減少，養(yǎng)分吸收能力降低；隱窩深度可反映上皮細(xì)胞的增殖率，隱窩深度加深細(xì)胞增殖能力加強(qiáng)；V/C可反映小腸的功能狀態(tài)，比值與消化吸收功能成正比。孫鵬鵬對(duì)雛鴕鳥(niǎo)腸管進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，飲水添加40 mg/L和80 mg/L硼可增加小腸的絨毛高度和隱窩深度，促進(jìn)了腸管發(fā)育，改善腸管消化吸收功能，而添加320 mg/L和640 mg/L硼抑制了腸管發(fā)育，破壞腸管的顯微結(jié)構(gòu)，減弱消化吸收功能。另外，Liu Ting等研究發(fā)現(xiàn)，飲水中添加40 mg/L和80 mg/L的硼能明顯增加大鼠十二指腸的絨毛高度和隱窩深度，提高V/C比值，改善十二指腸的顯微結(jié)構(gòu)，而添加640 mg/L硼破壞了十二指腸顯微結(jié)構(gòu)。本研究也發(fā)現(xiàn)，飲水中添加5 mg/L和20 mg/L硼時(shí)，大鼠的采食次數(shù)增加，精神狀態(tài)較好，回腸絨毛高度顯著增加，回腸上皮細(xì)胞完整度改善；而添加480 mg/L硼導(dǎo)致絨毛高度和隱窩深度顯著降低。產(chǎn)生以上結(jié)果的原因可能是飲水補(bǔ)充適量硼能夠通過(guò)改善回腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)，增加動(dòng)物回腸的吸收面積，提高養(yǎng)分吸收能力，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)物組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育。但與硼對(duì)大鼠十二指腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響相比，添加5 mg/L和10 mg/L硼比40 mg/L和80 mg/L硼對(duì)回腸結(jié)構(gòu)的有益作用更加明顯，其原因可能是由于回腸位于小腸末段，十二指腸對(duì)于低劑量硼的作用不敏感，而回腸作為小腸中接觸硼最遲的部位，對(duì)低劑量硼的作用更加敏感。

3.2 飲水補(bǔ)充不同劑量的硼對(duì)大鼠回腸消化酶的影響

小腸是食物消化吸收的最主要部位，腸黏膜絨毛上皮細(xì)胞刷狀緣的消化酶在最終消化階段處于關(guān)鍵地位，其活性與腸黏膜結(jié)構(gòu)完整性密切相關(guān)，是監(jiān)測(cè)小腸功能受損最靈敏的指標(biāo)。Hedemann等研究發(fā)現(xiàn)，與飼糧中添加2 500 mg/kg鋅相比，添加100 mg/kg鋅能顯著增加腸道內(nèi)乳糖酶和蔗糖酶活力，促進(jìn)斷奶仔豬生長(zhǎng)，減少腹瀉。陳娜娜等對(duì)蛋雞進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加70 mg/kg和140 mg/kg蛋氨酸鋅時(shí)可顯著增加十二指腸淀粉酶、蛋白酶以及回腸蛋白酶的活性，而添加1 400 mg/kg蛋氨酸鋅則顯著降低上述消化酶活力以及腸道抗氧化能力。本研究也發(fā)現(xiàn)，飲水中添加5 mg/L硼時(shí)，可顯著增加大鼠回腸麥芽糖酶、乳糖酶、-AMS、LPS活力，而添加480 mg/L和640 mg/L硼對(duì)麥芽糖酶活力和LPS活力有抑制作用。這表明添加5 mg/L硼可促進(jìn)回腸黏膜上皮細(xì)胞分泌消化酶，進(jìn)而提高其對(duì)食物和飼料的消化吸收能力，為細(xì)胞供能，而添加480 mg/L和640 mg/L硼則導(dǎo)致腸黏膜結(jié)構(gòu)受損，進(jìn)而使機(jī)體無(wú)法采取足夠多的應(yīng)對(duì)措施來(lái)保證消化酶活性。但是，添加160 mg/L硼也可顯著增加各種消化酶活性，其原因可能是由于長(zhǎng)時(shí)間受到硼的刺激，機(jī)體可能產(chǎn)生了某種代償機(jī)制以適應(yīng)硼對(duì)消化酶活性的刺激，加快相應(yīng)的酶促反應(yīng)及生理生化進(jìn)程，降低硼的毒性或促進(jìn)硼的排出。

3.3 飲水補(bǔ)充不同劑量硼對(duì)大鼠回腸屏障功能的影響

腸道是保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性的先天性屏障，能阻止腸腔內(nèi)的有害物質(zhì)穿過(guò)腸黏膜進(jìn)入血液循環(huán)和體內(nèi)其他組織器官。腸道生物屏障功能包括機(jī)械、化學(xué)、免疫和生物屏障4個(gè)部分，其中腸道機(jī)械屏障主要由結(jié)構(gòu)和功能完整的腸黏膜上皮及細(xì)胞間的緊密連接構(gòu)成。腸道化學(xué)屏障主要由腸黏膜上皮細(xì)胞分泌的黏液、消化液和腸道菌群產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)構(gòu)成；腸道免疫屏障主要由腸黏膜上皮細(xì)胞分泌的SIg A、IgM等抗體及黏膜下淋巴組織構(gòu)成；腸道生物屏障主要由腸道內(nèi)正常共生菌對(duì)致病菌的定植抵抗作用及菌間聚集構(gòu)成。其中，腸道機(jī)械屏障中的GC主要功能是分泌黏蛋白，對(duì)腸道上皮具有保護(hù)作用。腸道緊密連接為腸上皮細(xì)胞間的主要連接方式，主要包含閉鎖蛋白（Occludin）、閉合蛋白（Claudins）、連接黏附分子（junctional adhesion molecule A，JAMs）3種跨膜蛋白以及閉合小環(huán)蛋白（ZO）等外周胞漿蛋白。Occludin和Claudins能夠維持腸黏膜的硬度和不可通透性，從而保護(hù)機(jī)體免受細(xì)菌、毒素等有害物質(zhì)的入侵。ZO-1參與腸上皮細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及凋亡，調(diào)控腸道屏障通透性，常被作為腸上皮細(xì)胞間緊密連接狀況的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在斷奶仔豬飼糧中添加適量氧化鋅可以提高仔豬空腸黏膜中Occludin和ZO-1表達(dá)量，從而降低腸道通透性，緩解腹瀉。同樣，飼糧中添加80 mg/kg和120 mg/kg的鋅能夠顯著提高肉仔雞回腸黏膜Occludin和Claudin-1蛋白mRNA表達(dá)量，并提高其生產(chǎn)性能。本研究發(fā)現(xiàn)，添加5、10 mg/L硼可增加大鼠回腸GC的數(shù)量以及ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)量，而添加320、480、640 mg/L硼則對(duì)GC的數(shù)量以及ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)出現(xiàn)一定的抑制作用。說(shuō)明補(bǔ)充低劑量硼可促進(jìn)腸黏膜上皮細(xì)胞及其細(xì)胞間的連接，從而保持腸道機(jī)械屏障的穩(wěn)態(tài)，而添加高劑量硼則產(chǎn)生相反作用。

腸道免疫屏障中的IEL是免疫系統(tǒng)的主要組成部分，其參與機(jī)體免疫監(jiān)控和免疫防御作用。腸道內(nèi)SIg A能夠抑制細(xì)菌在腸黏膜中的黏附和定植，阻止菌體通過(guò)腸黏膜上皮進(jìn)入機(jī)體。王子旭等研究發(fā)現(xiàn)，添加適量微量元素鋅和硒有利于維持肉雞小腸上皮細(xì)胞、IEL以及GC的完整性，過(guò)低或過(guò)高的鋅和硒都會(huì)破壞小腸屏障功能。羅治彬等研究報(bào)道，在飼料中添加1 500 mg/kg的硫酸鋅會(huì)導(dǎo)致大鼠黏膜固有層SIg A漿細(xì)胞數(shù)量顯著減少，進(jìn)而導(dǎo)致腸道黏膜免疫功能下降。同時(shí)本研究也發(fā)現(xiàn)，添加10 mg/L硼可增加大鼠回腸黏膜IEL數(shù)量和SIg A分泌量，而添加360、480、640 mg/L硼對(duì)大鼠回腸黏膜IEL數(shù)量和SIg A分泌量都產(chǎn)生一定的抑制作用。這說(shuō)明添加低劑量硼對(duì)腸黏膜的免疫屏障有促進(jìn)作用，而添加高劑量硼對(duì)腸黏膜免疫屏障功能表現(xiàn)出抑制作用，使腸道易受到損傷而發(fā)生病變。

3.4 飲水補(bǔ)充不同劑量的硼對(duì)大鼠抗氧化功能的影響

機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中，SOD活力和GSH-Px含量的高低可間接反應(yīng)機(jī)體清除自由基能力的強(qiáng)弱。T-AOC可直接反映機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)對(duì)外來(lái)刺激的代償能力，以及機(jī)體自由基代謝的狀況，是評(píng)價(jià)機(jī)體抗氧化功能的一個(gè)良好指標(biāo)。李升和等研究表明，飲水添加40 mg/L硼可增加血清SOD、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）活力以及GSH-Px含量，而添加640 mg/L硼則導(dǎo)致血清CAT和SOD活力顯著降低。張瀟研究發(fā)現(xiàn)，飲水添加40 mg/L硼能顯著提高肉仔雞成活率、增加體質(zhì)量、降低料肉比，且能顯著增強(qiáng)肉仔雞免疫和抗氧化能力，而添加160 mg/L和320 mg/L硼則產(chǎn)生抑制作用。本研究也表明，飲水中添加5 mg/L硼可提高大鼠回腸T-AOC、SOD活力以及GSH-Px含量，而添加480 mg/L和640 mg/L則使回腸T-AOC顯著降低。這說(shuō)明添加低劑量硼可增強(qiáng)大鼠回腸抗氧化功能，提高其清除O·、HO和·OH等自由基的能力，進(jìn)而對(duì)機(jī)體起到一定的保護(hù)作用。然而，補(bǔ)充160 mg/L硼也顯著增加大鼠回腸SOD活力及GSH-Px含量，其主要原因可能是回腸組織為清除大量的氧自由基而產(chǎn)生代償性作用。

通過(guò)以上研究發(fā)現(xiàn)，飲水中添加5 mg/L和10 mg/L硼可以改善大鼠回腸顯微結(jié)構(gòu)，提高消化酶活力、增強(qiáng)抗氧化功能，促進(jìn)緊密連接蛋白的表達(dá)和分泌。其主要原因是添加適量的硼通過(guò)增強(qiáng)腸道局部抗氧化功能，為腸上皮細(xì)胞增殖提供了良好的氧化還原環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞的增殖，抑制腸道上皮細(xì)胞凋亡基因表達(dá)，從而使腸上皮細(xì)胞分泌消化酶的活性增強(qiáng)，緊密連接蛋白的表達(dá)增加，最終在一定程度上改善腸道顯微結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)大鼠消化吸收功能，對(duì)于大鼠生理功能的改善產(chǎn)生明顯的有益作用。而飲水中添加480 mg/L和640 mg/L硼則對(duì)大鼠回腸顯微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損傷，使抗氧化功能和消化酶活力降低，緊密連接蛋白表達(dá)量降低，其主要原因是高劑量硼破壞了腸道局部氧化和抗氧化系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡，降低了腸道局部細(xì)胞的抗氧化功能，使腸上皮細(xì)胞增殖環(huán)境受損，促進(jìn)了腸上皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制了消化酶的分泌，降低了緊密連接蛋白的表達(dá)，最終導(dǎo)致回腸顯微結(jié)構(gòu)受損，對(duì)大鼠消化功能產(chǎn)生一定的毒性作用。

綜上所述，飲水添加5 mg/L硼可改善大鼠回腸的顯微結(jié)構(gòu)，并且顯著增加大鼠回腸的絨毛高度、GC數(shù)量；提高麥芽糖酶、乳糖酶、-AMS、LPS活力以及T-AOC、SOD活力、GSH-Px含量；促進(jìn)緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達(dá)和分泌。飲水添加10 mg/L硼可提高大鼠回腸GC和IEL數(shù)量；提高乳糖酶、SOD活力和GSH-Px含量；促進(jìn)SIg A、ZO-1和Occludin的表達(dá)和分泌。而添加飲水添加480 mg/L和640 mg/L硼則產(chǎn)生相反作用。