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    二氫楊梅素抑制黃曲霉菌生長的機制

    2022-07-29 02:40:24喬蘇瑞謝巖黎
    食品科學(xué) 2022年13期
    關(guān)鍵詞:細胞膜完整性抑制率

    李 倩,趙 穎,喬蘇瑞,謝巖黎

    (河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院,河南省糧油食品安全檢測與控制重點實驗室,河南 鄭州 450001)

    黃曲霉菌(,AF)屬子囊菌門、叢梗孢科、曲霉屬,是一種常見的腐生型好氧真菌。AF易侵染多種糧食作物,如小麥、玉米、花生,不僅損害其品質(zhì),而且影響經(jīng)濟效益。據(jù)報道,我國每年因霉菌污染而造成的糧食損失高達2 100萬 t,占全國糧食總產(chǎn)量的4.2%,是每年新增糧食產(chǎn)量的4 倍多。作為一種病原性真菌,AF極易通過呼吸道、口耳眼鼻、皮膚等部位進入人和動物體內(nèi),引起支氣管炎、肺泡壞死、外耳炎、角膜炎、鼻竇炎等多種疾病,危害人畜身體健康。此外,AF可產(chǎn)生多種次級代謝產(chǎn)物——黃曲霉毒素(aflatoxin,AFT),其中黃曲霉毒素B(aflatoxin B,AFB)毒性最強,約為氰化鉀的10 倍、砒霜的8 倍、二甲基亞硝胺的75 倍、三聚氰胺的416 倍,被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WTO)列為I類致癌物。AFT對光、熱、酸較穩(wěn)定,280 ℃高溫下才可裂解,因此一般烹調(diào)加工溫度難以破壞。

    二氫楊梅素(dihydromyricetin,DMY)又名白蘞素、蛇葡萄素,屬于二氫黃酮類化合物,多存在于葡萄科、楊梅科、杜鵑科、藤黃科、大戟科及柳科等植物中,其中在葡萄科藤茶中含量最高。以往研究表明,DMY具有廣泛的生物活性,如抗炎、抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)血糖血脂、保肝護肝等,因此廣泛應(yīng)用于藥品、食品、化妝品等行業(yè)。例如,目前以DMY為功效添加成分已研制出速溶茶、顯齒蛇葡萄總黃酮含片、DMY解酒保肝膠囊等保健食品。除此之外,DMY可以有效抑制食源性細菌,如金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、副傷寒沙門氏菌和銅綠假單胞菌,DMY對其最小抑菌質(zhì)量濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)分別為0.63、1.25、0.31、0.63、0.31 mg/mL。在熊皓平等的研究中,DMY對AF、青霉、黑曲霉、毛霉、根霉等真菌也具有顯著抑制效果。

    作為一種天然植物提取物,DMY成本低廉、來源廣泛,具有極大的開發(fā)前景。本實驗首先檢測DMY對AF的抗真菌活性,在此基礎(chǔ)上通過測定細胞壁/膜完整性、細胞內(nèi)容物釋放量、呼吸速率、細胞外相對電導(dǎo)率和pH值探究DMY潛在的抗真菌機制,最后評估其在糧食中的抑菌效果,以期為天然抑菌劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 菌株、材料與試劑

    AF菌株(CGMCC 3.6304) 中國微生物菌種保藏中心(China General Microbial Culture Collection Center,CGMCC);DMY(純度≥98%) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;卡爾科弗盧爾熒光增白劑(calcofluor white,CW) 上海懋康生物科技有限公司;抗熒光猝滅劑上海生工生物工程股份有限公司;碘化丙啶(propidium iodide,PI) 北京索萊寶科技有限公司;花生、玉米購于鄭州永輝超市。

    1.2 儀器與設(shè)備

    LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;101-E電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京市光明醫(yī)療儀器廠;SW-CJ-2D雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;PYX-DHS-40X50-BS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱上海躍進醫(yī)療器械廠;THZ-98B雙功能汽浴恒溫振蕩器上海誦誠實業(yè)發(fā)展有限公司;BM-37XBC倒置生物顯微鏡上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司;DFC 7000T熒光顯微鏡德國徠卡公司;UV-6100S紫外-可見分光光度計上海美譜達儀器有限公司;DZS-706-C多參數(shù)分析儀上海雷磁儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 DMY對AF抑制作用實驗

    AF于(28±2)℃下在固體沙氏培養(yǎng)基(Sabouraud dextrose agar,SDA)(含40 g/L葡萄糖、10 g/L蛋白胨和20 g/L瓊脂)上培養(yǎng)7 d,然后用打孔器在菌落中央打孔制得AF菌餅(直徑0.6 cm)備用。

    孢子懸浮液制備:向AF的SDA表面傾注5 mL生理鹽水并用涂布器刮取孢子,吸取含有孢子的生理鹽水并用濾紙過濾,所得濾液即為孢子原液。充分吹打混勻后用血球計數(shù)板計數(shù),加入液體沙氏培養(yǎng)基(Sabouraud dextrose broth,SDB)(含40 g/L葡萄糖和10 g/L蛋白胨)稀釋孢子懸浮液使孢子濃度為5×10個/mL,備用。

    用無水乙醇配制不同質(zhì)量濃度的DMY溶液,避光儲存于4 ℃冰箱。實驗所用水均為去離子水。

    1.3.1.1 DMY對AF孢子萌發(fā)抑制率的測定

    DMY對AF孢子萌發(fā)抑制率的測定參考文獻[16]的方法并稍作修改。在96 孔板加入20 μL孢子懸浮液(5×10個/mL)和20 μL DMY溶液(終質(zhì)量濃度分別為0(對照,后同)、0.5、1、2、4、8、16 mg/mL)。將96 孔板置于恒溫培養(yǎng)箱(28±2)℃中孵育48 h,每24 h于倒置顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)形態(tài),顯微鏡拍照后計算孢子萌發(fā)抑制率(視野中未萌發(fā)孢子數(shù)占總孢子數(shù)比值),DMY對AF孢子的最小抑菌質(zhì)量濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)指DMY完全抑制孢子萌發(fā)的最小質(zhì)量濃度。

    1.3.1.2 DMY對AF菌絲生長抑制率的測定

    在培養(yǎng)皿(直徑6 cm)中加入10 mL含DMY(質(zhì)量濃度分別為0、2、4、8、16 mg/mL)的SDA。培養(yǎng)基凝固后,在培養(yǎng)基中央打孔(直徑0.6 cm),然后嵌入AF菌餅,密封后于恒溫培養(yǎng)箱靜置72 h,每24 h測量菌落直徑。72 h后菌落直徑無變化且菌絲生長抑制率為100%的最小質(zhì)量濃度即為DMY對AF菌絲的MIC。菌絲生長抑制率按式(1)計算。

    式中:和分別代表對照組和實驗組在SDA上的平均菌落直徑/cm。

    1.3.2 孢子活力檢測和菌絲生物量分析

    1.3.2.1 孢子活力檢測

    采用平板記數(shù)法檢測孢子活力,結(jié)果以孢子存活率表征。參照1.3.1.1節(jié)方法,制備DMY終質(zhì)量濃度分別為0、4、8、16 mg/mL的孢子懸浮液。然后取100 μL孢子懸浮液稀釋10倍,取200 μL均勻涂布于9 cm培養(yǎng)皿(每個培養(yǎng)皿含30 mL SDA,每個質(zhì)量濃度做3個重復(fù)),置于恒溫培養(yǎng)箱48 h,根據(jù)菌落數(shù)按式(2)計算孢子存活率。

    式中:為用于涂布的孢子數(shù)量;為培養(yǎng)48 h后記錄的菌落數(shù)。

    1.3.2.2 菌絲生物量分析

    將100 μL孢子懸浮液(5×10個/mL)加入20 mL SDB中,于(28±2)℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h,然后加入2 mL DMY溶液(終質(zhì)量濃度分別為0、2、4 mg/mL),繼續(xù)振蕩培養(yǎng)一定時間后用濾紙過濾培養(yǎng)液收集菌絲,用去離子水沖洗兩次以洗去培養(yǎng)液。0-24組代表培養(yǎng)24 h收集的菌絲,0-48、2-48、4-48組代表在48 h收集的DMY終質(zhì)量濃度分別為0、2、4 mg/mL的菌絲。將各組收集的菌絲在80 ℃電熱恒溫干燥箱中干燥24 h后分別稱質(zhì)量,以表征菌絲生物量。

    1.3.3 細胞壁完整性測定

    將50 μL孢子懸浮液(5×10個/mL)加入10 mL SDB中,于恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h。加入1 mL DMY溶液(終質(zhì)量濃度分別為0、1/2 MIC和MIC)。再靜置培養(yǎng)24 h,取菌絲或培養(yǎng)液進行細胞壁完整性、細胞膜完整性和細胞內(nèi)容物釋放量的分析與測定。

    細胞壁完整性分析參考文獻[17]的方法并稍作修改。取少量菌絲置于載玻片上,用10%(質(zhì)量分數(shù))KOH溶液和CW染色,并滴加抗熒光猝滅劑保護熒光,最后用熒光顯微鏡觀察并拍照(放大20 倍)。

    1.3.4 細胞膜完整性測定

    參考文獻[18]的方法進行染色。取少量1.3.3節(jié)培養(yǎng)的菌絲置于載玻片上,滴加10 μL PI染料(1 μL/mL)染色,避光靜置20 min后,用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)洗去未結(jié)合染料。滴加抗熒光猝滅劑并用熒光顯微鏡觀察拍照,采用Image J軟件計算PI熒光強度,以表征細胞膜完整性。

    1.3.5 細胞內(nèi)容物釋放量的測定

    細胞內(nèi)容物釋放量實驗參考文獻[19]的方法并稍作修改。取2 mL 1.3.3節(jié)培養(yǎng)液,5 000 r/min離心10 min,取上清液測定260 nm波長處光密度值(OD),測定時用新鮮的空白SDB校準。

    1.3.6 相對電導(dǎo)率和pH值的測定

    相對電導(dǎo)率和pH值的測量參考文獻[20]。將500 μL孢子懸浮液(5×10個/mL)加入100 mL SDB中,(28±2)℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。加入10 mL DMY溶液(終質(zhì)量濃度分別為0、1/2 MIC、MIC),然后再振蕩培養(yǎng)24 h。收集0.5 g菌絲懸浮在 20 mL 純水中,使用多參數(shù)分析儀測定0、5、10、20、40、60、80、100、120、140、160、180 min時混合液的電導(dǎo)率和pH值。檢測完畢后立即煮沸5 min,冷卻至室溫后測定混合液的電導(dǎo)率。按式(3)計算相對電導(dǎo)率。

    式中:和分別代表樣品煮沸前后的電導(dǎo)率/(μS/cm);和分別代表純水煮沸前后的電導(dǎo)率/(μS/cm)。

    1.3.7 呼吸抑制率的測定

    DMY對AF孢子呼吸代謝影響的測定參考文獻[21]。向試管中加入7.2 mL磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L、pH 7.0)和2 mL孢子懸浮液(5×10個/mL)靜置5 min后,加入0.8 mL 1%(質(zhì)量分數(shù))葡萄糖,混合均勻后靜置10 min,然后加入1 mL DMY溶液(終質(zhì)量濃度分別為0、1/2 MIC、MIC)混勻后靜置10 min,以等體積去離子水作為空白組。待溶液穩(wěn)定后用溶解氧測定儀測定溶解氧濃度,30 min后再次測定培養(yǎng)液的溶解氧濃度,計算30 min內(nèi)溶解氧濃度變化(=-)。按式(4)計算呼吸抑制率。

    式中:和分別代表空白組和DMY樣品組在30 min內(nèi)溶解氧濃度變化。

    1.3.8 DMY對花生和玉米籽粒儲存過程中AF的體外抑菌效果分析

    DMY對花生和玉米籽粒儲存過程中AF的抑制效果測定參考文獻[22]的方法并稍加修改?;ㄉ陀衩鬃蚜S脽o菌水洗滌,然后用紫外線照射20 min。在超凈工作臺短暫干燥后,將10 ?;ㄉ鶆蚍湃胫睆? cm培養(yǎng)皿中。將400 μL孢子懸浮液(5×10個/mL)與40 μL DMY溶液混合(DMY終質(zhì)量濃度分別為0、1/2 MIC和MIC),隨后均勻涂抹于花生表面(40 μL/粒)。在恒溫培養(yǎng)箱(28±2)℃中放置72 h,每24 h統(tǒng)計1 次受污染花生的數(shù)量并拍照。以相同方式測定DMY對玉米籽粒的抗真菌作用。按式(5)計算花生/玉米籽粒污染率。

    式中:和分別代表72 h后花生/玉米籽粒的污染個數(shù)和實驗所用花生/玉米籽粒總數(shù)。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

    每組實驗重復(fù)至少3 次,采用Origin 2017軟件處理數(shù)據(jù),結(jié)果表示為平均值±標準差。采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析,通過Duncan多重比較進行顯著性分析,<0.05表示差異顯著。采用Illustrator CC 2018軟件作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 DMY對AF孢子和菌絲的MIC

    如圖1A所示,DMY對AF孢子萌發(fā)有顯著抑制作用。其中,0、0.5 mg/mL時,因DMY質(zhì)量濃度過低,暫無抑制作用;當(dāng)DMY為1 mg/mL時,24 h和48 h時抑制率分別為24.41%和9.05%;2 mg/mL的DMY處理48 h后80.45%的孢子未萌發(fā);當(dāng)DMY質(zhì)量濃度不低于4 mg/mL時,孢子萌發(fā)抑制率達到100%,即DMY對AF孢子萌發(fā)的MIC為4 mg/mL。如圖1B所示,DMY對AF菌絲生長同樣有顯著抑制作用。當(dāng)DMY質(zhì)量濃度為2 mg/mL時,24、48、72 h時菌絲生長抑制率分別為95.00%、29.88%和16.98%;當(dāng)DMY質(zhì)量濃度不低于4 mg/mL時,抑制率達到100%,即DMY對AF菌絲生長的MIC為4 mg/mL,高于香芹酮(MIC=1.5 mg/mL)、槲皮素(MIC=1.0 mg/mL)等,但低于羅勒烯(MIC=8.0 mg/mL),這種差異可能與AF孢子及不同菌株濃度有關(guān)。相同菌株接種濃度相同時,鄰香蘭素、2-羥基-4-甲氧基苯甲醛(2-hydroxy-4-methoxybenzaldehyde,HMB)、丹皮酚、辛醛、壬醛、癸醛抑制AF菌絲生長的MIC分別為0.1、0.07、0.625、1.65、1.65、4.15 mg/mL。雖然DMY的MIC接近或高于上述天然化合物,但其作為抑菌劑仍然潛力巨大,這是由于:1)醛類化合物易揮發(fā),在實際使用過程中不可避免存在損失,而DMY穩(wěn)定性較高;2)DMY在37.5 mg/mL和0.01 mg/mL質(zhì)量濃度下能夠分別發(fā)揮保護肝臟和抗腫瘤活性,說明DMY還具有多重功效。這些結(jié)果為后續(xù)抑菌機理的探究奠定了良好的基礎(chǔ)。

    圖1 DMY對AF孢子萌發(fā)(A)和菌絲生長(B)抑制率Fig. 1 Inhibition rate of DMY on spore germination (A) and mycelial growth (B) of A. flavus

    2.2 DMY處理后AF孢子存活率和菌絲生物量

    為了檢測DMY在MIC質(zhì)量濃度及以上處理后的孢子活力,本研究測定了孢子存活率和菌絲生物量。如圖2A所示,對照組孢子存活率接近100%,而4、8、16 mg/mL的DMY處理組中孢子活力下降,孢子存活率分別為80%、65%和65%,表明DMY處理從一定程度上削弱了孢子的活力,且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。此外,進一步對菌絲的生物量進行量化分析,如圖2B所示,對照組振蕩培養(yǎng)24 h的菌絲生物量為4.95 mg,對照組振蕩培養(yǎng)48 h菌絲生物量達57.65 mg。與對照組振蕩培養(yǎng)48 h相比,經(jīng)2 mg/mL的DMY處理后,菌絲生物量顯著下降,下降比例為55.51%,4 mg/mL的DMY對菌絲生物量的降低效果最為顯著,下降比例為88.93%。同時,0-24組和4-48組的菌絲生物量無顯著差異(>0.05),由此可知,4 mg/mL的DMY幾乎能夠完全抑制菌絲的生長。

    圖2 DMY處理后AF孢子存活率(A)和菌絲生物量(B)Fig. 2 Spore survival rate (A) and mycelial biomass (B) of A. flavus treated with DMY

    2.3 細胞壁完整性觀察結(jié)果

    多糖是真菌細胞壁的主要成分,為細胞壁提供強度和硬度,如幾丁質(zhì)和-1,3-葡聚糖。細胞壁在向心力作用下向菌絲中心局部延伸形成隔膜,把菌絲內(nèi)部分隔為不同的小室,且相鄰的小室之間有細胞質(zhì)的互通。已知熒光白染料可與幾丁質(zhì)特異性結(jié)合,而幾丁質(zhì)是細胞壁(隔膜)的主要成分,因此,熒光強度與細胞壁完整性有關(guān)。由圖3可知,對照組菌絲隔膜完整且清晰透亮,表明幾丁質(zhì)含量較高。與對照組相比,1/2 MIC和MIC組隔膜數(shù)量依次減少,熒光強度依次減弱,表明DMY處理后,AF菌絲中幾丁質(zhì)含量減少,即細胞壁完整性被破壞。相似地,植物源天然化合物中的鄰香蘭素、HMB、丹皮酚等均能不同程度的溶解隔膜,在具有相似隔膜的酸腐菌中也發(fā)現(xiàn),肉桂醛能夠溶解隔膜,植物精油如紫蘇精油能夠從基因水平調(diào)控葡聚糖合成酶、幾丁質(zhì)酶等的表達。以上研究表明,細胞壁可能是植物源天然化合物抑菌的一個靶標,然而,哪些天然化合物能夠被成功開發(fā)為靶向抑菌劑仍有待進一步研究。

    圖3 DMY處理后AF菌絲CW熒光染色圖Fig. 3 CW fluorescence staining images of A. flavus treated with DMY

    2.4 細胞膜完整性與細胞內(nèi)容物釋放量變化

    對PI染色后的菌絲熒光強度進行量化,結(jié)果如圖4A所示。隨著DMY質(zhì)量濃度的增加,相對熒光強度顯著增加,1/2 MIC和MIC組分別是對照組的36.49 倍和257.69 倍。結(jié)果表明,DMY破壞了AF真菌細胞膜完整性,且這種破壞作用與DMY質(zhì)量濃度成正比關(guān)系。已有許多研究報道醛類化合物具有疏水性,能夠破壞細胞膜,導(dǎo)致細胞膜的通透性升高、完整性破壞。一些黃酮類化合物對真菌細胞膜的破壞作用與之相似,如喬松素和白楊素對意大利青霉以及黃芩素對煙曲霉的破壞作用。

    細胞膜完整性的破壞可直接導(dǎo)致細胞內(nèi)容物的滲出,因此,通過測定260 nm波長處的光密度值(OD)分析細胞內(nèi)容物的釋放情況,結(jié)果如圖4B所示。當(dāng)DMY質(zhì)量濃度分別為0、1/2 MIC、MIC時,OD依次增加(分別為0.14、0.58和0.97)。與對照組相比,1/2 MIC組和MIC組光密度值分別增加了3.14 倍和5.93 倍。細胞內(nèi)容物釋放量的顯著增加再次印證了細胞膜通透性的提高。

    圖4 DMY對AF細胞膜完整性(A)和細胞內(nèi)容物釋放量(B)的影響Fig. 4 Effects of DMY on the integrity of cell membrane (A) and the release of cell contents (B) of A. flavus

    2.5 AF的相對電導(dǎo)率和pH值改變情況

    由于滲出的細胞內(nèi)容物具有導(dǎo)電性,因此,進一步通過細胞外相對電導(dǎo)率的變化趨勢研究DMY對細胞膜破壞的程度。如圖5A所示,對照組和DMY處理組均呈現(xiàn)了相對電導(dǎo)率升高的趨勢。對照組的升高可能是細胞內(nèi)外的滲透壓導(dǎo)致的,1/2 MIC組的升高趨勢和對照組接近,在180 min時約為43%,MIC組的升高最為顯著,180 min時約為69.63%。這些結(jié)果表明細胞內(nèi)的導(dǎo)電物質(zhì)穿過完整性遭到破壞的細胞膜,且隨著時間的延長,滲出的電解質(zhì)逐漸增多。上述PI染色、OD及相對電導(dǎo)率的檢測結(jié)果均間接表明了DMY處理后細胞膜受到了損傷,且該損傷呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。

    為了研究這些電解質(zhì)的酸堿度,測定了不同質(zhì)量濃度DMY處理后AF細胞外的pH值。如圖5B所示,與對照組相比,DMY處理組細胞外pH值均升高,但隨著時間變化,各組pH值均呈現(xiàn)略微下降的趨勢,這可能與酸性物質(zhì)的滲出有關(guān)。在180 min檢測時間內(nèi),DMY處理組的pH值均明顯高于對照組,推測處理組中有更多堿性物質(zhì)滲出。pH值的變化趨勢在不同天然產(chǎn)物處理的不同菌株中表現(xiàn)不同,如檸檬醛、辛醛和-松油醇3種揮發(fā)性化合物降低了柑桔地霉的pH值,HMB和丹皮酚均提高了AF菌絲胞外pH值。因此,pH值的變化趨勢可能更多地與菌株類型有關(guān)。細胞膜位于真菌細胞壁和細胞質(zhì)的中間,不僅是細胞的一層屏障,更能夠參與調(diào)控、介導(dǎo)多種細胞功能,因此,細胞膜何種組分(脂質(zhì)、蛋白等)、何種結(jié)構(gòu)受到DMY的破壞仍有待深入研究。

    圖5 DMY處理下AF細胞外相對電導(dǎo)率和pH值的變化Fig. 5 Changes in extracellular relative conductivity and pH of A. flavus treated with DMY

    2.6 DMY對AF呼吸代謝的影響

    通過檢測細胞外溶液中的溶解氧,能夠了解AF消耗氧氣的情況,進而通過計算呼吸抑制率分析DMY對AF呼吸的抑制作用。如圖6所示,與對照組相比,DMY對AF的呼吸抑制率呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系,1/2 MIC和MIC組的呼吸抑制率分別為16.99%和25.82%。已有研究報道部分植物源天然化合物對真菌的呼吸代謝有抑制作用,如檸檬醛在MIC時抑制率達到21.20%,HMB在MIC時的抑制率達到33.33%,癸醛在MIC時抑制率達到58.94%。根據(jù)本實驗結(jié)果雖尚無法全面揭示呼吸抑制原理,但由先前研究推測,該抑制作用可能與三羧酸循環(huán)途徑或線粒體功能的破壞有關(guān)。

    圖6 DMY對AF的呼吸抑制率Fig. 6 Inhibition rate of DMY on A. flavus respiration

    2.7 DMY對花生和玉米籽粒體外抑菌作用

    花生和玉米易受AF侵染,因此,在上述人工培養(yǎng)液抑菌實驗的基礎(chǔ)上,本研究進一步評估了DMY對于防控AF污染的效果。AF的生長情況如圖7所示,培養(yǎng)24 h時,除了兩個MIC組,剩余花生和玉米籽粒上均觀察到孢子的萌發(fā)。培養(yǎng)48 h時,對照組花生和玉米籽粒上均可觀察到AF菌絲。培養(yǎng)72 h時,即便花生和玉米籽粒表面涂布有1/2 MIC的DMY,AF的生長情況也和48 h的對照組相似,而涂布MIC的DMY后花生和玉米籽粒表面則均無孢子萌發(fā)。對圖7污染情況的量化結(jié)果如圖8所示,培養(yǎng)72 h時,花生和玉米籽粒AF抑制率達到100%的均為DMY的MIC處理組。與培養(yǎng)液抑菌結(jié)果相同,4 mg/mL的DMY能夠完全抑制AF侵染花生和玉米籽粒,因此,DMY具有開發(fā)為新型抑菌劑的潛力。

    圖7 DMY對花生(A)和玉米(B)籽粒的體外抑菌作用Fig. 7 In vitro antifungal effect of DMY on peanut (A) and corn (B) kernels

    圖8 DMY處理下花生(A)和玉米(B)籽粒的污染率Fig. 8 Contamination rates of peanut (A) and corn (B) kernels treated with DMY

    3 結(jié) 論

    本實驗旨在研究DMY對AF的抗真菌效果及其作用機理,首先進行AF孢子萌發(fā)和菌絲生長的最小抑菌實驗,然后通過CW和PI染色、細胞內(nèi)容物釋放以及細胞外pH值和相對電導(dǎo)率變化檢測細胞壁和細胞膜完整性,并進行呼吸速率檢測及花生和玉米籽粒體外抑菌實驗。研究獲得的初步結(jié)論如下:DMY對AF孢子萌發(fā)和菌絲生長的MIC均為4 mg/mL,其通過破壞細胞壁和細胞膜的完整性發(fā)揮抑菌作用。DMY處理后線粒體是否遭到破壞仍需進一步的實驗證明。此外,DMY能夠有效抑制AF侵染花生和玉米籽粒,未來有望將其開發(fā)為新型抑菌劑應(yīng)用于糧食及農(nóng)產(chǎn)品的儲藏。

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