嗜熱角蛋白降解菌的分離篩選及降解特性

劉 標(biāo)， 陳 薇， 吳迎奔， 喻孟元， 郭照輝， 劉惠知， 尹紅梅

(湖南省微生物研究院，湖南長沙 410009)

隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展，全球每年產(chǎn)生了數(shù)量巨大的角蛋白廢棄物，如動物毛發(fā)、羽毛、蹄角等，如何合理處理這些廢棄物引起了人們極大關(guān)注。將角蛋白廢棄物進(jìn)行降解回收利用，不僅解決了生態(tài)環(huán)境污染的問題，其降解產(chǎn)物可廣泛用于飼料工業(yè)、肥料工業(yè)、化妝品行業(yè)等領(lǐng)域。角蛋白中含有較多的半胱氨酸，相互之間形成大量的二硫鍵，性質(zhì)穩(wěn)定，很難被普通的蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等)水解，給資源化利用帶來了不便。傳統(tǒng)的降解方法包括：化學(xué)法(堿性水解法)、物理法(高溫高壓法、膨化法)，但這些方法能耗高，可能帶來二次污染，且在加工過程中會導(dǎo)致部分必需氨基酸損失，降低其營養(yǎng)價值。利用微生物或角蛋白酶降解角蛋白可提高降解產(chǎn)物的營養(yǎng)價值，降低能耗，是一種環(huán)境友好型的廢棄物資源化轉(zhuǎn)化方式。目前，科研工作者已篩選獲得較多角蛋白降解微生物菌株及其分泌的角蛋白酶，但絕大部分微生物來源于常溫環(huán)境，熱穩(wěn)定性不佳。適當(dāng)提高處理溫度能加速角蛋白降解，嗜熱菌產(chǎn)生的酶具有較高的熱穩(wěn)定性，因此在生物催化降解領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室在前期研究中從高溫環(huán)境中分離到1株嗜熱菌，以羽毛為唯一的碳氮源生長。本研究對該菌株的菌種分類、粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)及降解機(jī)理進(jìn)行了初步研究，以期為將來工業(yè)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 試驗(yàn)菌株分離自雞糞高溫堆肥樣品。

1.1.2 角蛋白材料 收集屠宰市場廢棄的雞毛，采用蒸餾水沖洗干凈，60 ℃烘干至恒質(zhì)量備用。羽毛粉制備：將烘干后的雞毛粉碎，過80目篩后即制成羽毛粉。

1.1.3 培養(yǎng)基 (1)羽毛(粉)無機(jī)鹽培養(yǎng)基(g/L)：羽毛(粉)10 g，KHPO0.5 g，KHPO1.0 g，NaCl 0.5 g，MgCl0.1 g，pH值7.0。(2)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，pH值7.0。(3)脫脂牛奶培養(yǎng)基：牛肉膏 5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，脫脂牛奶10.0 g，pH值7.0。(4)血瓊脂平板，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高溫角蛋白降解菌的分離及篩選 (1)初篩：稱取10.0 g雞糞堆肥高溫期樣品置于內(nèi)含 90 mL 無菌水的三角瓶中，充分振蕩混勻，80 ℃水浴處理1 h后取5 mL懸液置于100 mL羽毛無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，60 ℃(堆肥高溫期平均溫度)、180 r/min振蕩培養(yǎng)。將培養(yǎng)5 d的菌液梯度稀釋后，涂布在羽毛粉無機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)3～5 d，選擇能利用羽毛角蛋白為碳氮源生長的菌株，利用四分區(qū)劃線法進(jìn)一步純化出單菌落。(2)復(fù)篩：將初篩菌株接種至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h制備種子液，調(diào)節(jié)各菌株種子液的活菌數(shù)約為2.0×10CFU/mL。將各種子液以2%接種量分別接種到羽毛無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，60 ℃、180 r/min 培養(yǎng)5 d，接種等量無菌水作為對照，采用失質(zhì)量法測定雞毛的降解率。羽毛降解率=(對照羽毛干質(zhì)量-試驗(yàn)組剩余羽毛干質(zhì)量)/對照羽毛干質(zhì)量×100%。(3)菌株生物安全性初步判斷：將各降解菌株接種在血平板上培養(yǎng)，觀察是否有溶血圈出現(xiàn)，挑選羽毛降解率較高且溶血圈為陰性的菌株作為后續(xù)試驗(yàn)研究對象。

1.2.2 高效降解菌株K-7菌種鑒定 (1)菌株形態(tài)及生理生化特征檢測：在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)72 h后觀察菌落形態(tài)特征，挑取少量菌體進(jìn)行顯微鏡觀察和革蘭氏染色觀察。菌株生理生化試驗(yàn)參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程》(第2版)進(jìn)行。(2)菌株分子進(jìn)化樹分析：利用試劑盒提取菌株 K-7 的基因組DNA，采用16S rDNA序列通用擴(kuò)增引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃終止。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用膠回收試劑盒回收目的片段，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

使用NCBI中的Blast軟件對測序所得序列進(jìn)行同源性分析，選取同源性較高的16S rDNA序列，利用Mega 5.0軟件中Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)取樣1 000 次進(jìn)行BootStrap檢驗(yàn)。

1.2.3 菌株K-7降解羽毛角蛋白機(jī)理初步研究 (1)菌株K-7胞外酶活性分析。按照“1.2.1”節(jié)方法制備K-7種子液，以2%接種量接種到羽毛無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，60 ℃、180 r/min培養(yǎng)，發(fā)酵液經(jīng) 10 000 r/min 離心10 min 后，取上清液，即為粗酶液。分別在1、2、3、4、5、6 d測定角蛋白的降解率、粗酶液的胞外角蛋白酶活和胞外二硫鍵還原酶活性，酶活性測定參照文獻(xiàn)[14]中的方法進(jìn)行，酶活反應(yīng)溫度設(shè)為60 ℃，pH值為7.0。(2)菌株K-7降解羽毛角蛋白過程中含硫化合物變化。根據(jù)文獻(xiàn)報道，除降解酶外，各種含硫化合物在角蛋白降解中也起到非常關(guān)鍵的作用，本研究對不同時期發(fā)酵上清液中的硫酸鹽、亞硫酸鹽和巰基化合物含量進(jìn)行測定，操作步驟參照筆者所在實(shí)驗(yàn)室之前報道的方法進(jìn)行。

1.2.4 角蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)研究 (1)粗酶液最適反應(yīng)溫度測定。將反應(yīng)溫度設(shè)為30、40、50、60、70、80 ℃，分析不同溫度對角蛋白酶活性的影響，確定酶活性的最適反應(yīng)溫度。(2)pH值對角蛋白酶活性的影響。配制pH值為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的Tris-HCl 緩沖液，分析pH值對角蛋白酶活性的影響，確定酶活性的最適反應(yīng)pH值。(3)粗酶液的熱穩(wěn)定性分析。將粗酶液分別置于不同溫度(60、70、80、90、100 ℃)水浴中處理1 h后，測定殘余酶活性。以未經(jīng)處理的初始酶液為對照，活性設(shè)為100%，計算其他溫度處理后相對酶活性。(4)化學(xué)試劑對角蛋白酶活性的影響。向粗酶液中分別加入10 mmol/L的苯甲基磺酰氟(PMSF)、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫基蘇糖醇(DTT)、-巰基乙醇，以未添加的反應(yīng)管為對照，酶活性設(shè)為100%，計算各處理組的相對酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2003對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計算繪圖；利用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，不同處理間差異顯著性分析采用One-way ANOVA方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫角蛋白降解菌株的分離篩選

本試驗(yàn)初篩獲得5株能夠以雞羽毛為唯一碳氮源生長的耐高溫菌株，復(fù)篩結(jié)果顯示，菌株LY-3、K-7對羽毛的降解率分別為92.6%、90.6%，顯著高于其他3株菌株(<0.05)。血平板培養(yǎng)結(jié)果顯示，菌株LY-3菌落周圍出現(xiàn)明顯溶血圈，而K-7菌落周圍未出現(xiàn)溶血圈。結(jié)合菌株的降解能力和安全性能，選取菌株K-7進(jìn)行深入研究。

由圖1可知，在以雞羽毛為唯一碳氮源的培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)基由清亮逐漸變渾濁，羽毛中的羽枝和羽軸被K-7完全降解，而對照組的羽毛基本未變化。利用掃描電鏡對羽毛的微觀結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行觀察，由圖2-a可知，未接菌對照組中羽毛具有完整的羽軸、羽枝結(jié)構(gòu)；接種菌株K-7發(fā)酵24 h后，羽毛表面結(jié)構(gòu)變得松散，羽枝被大量降解，形成碎片(圖2-b)。

2.2 高效降解菌K-7菌種鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)、生理生化特征 菌株在牛肉膏蛋白胨平板上60 ℃培養(yǎng)72 h后，形成白色菌落，表面干燥，邊緣不整齊。在油鏡下觀察，菌體呈桿狀、單個排列、有芽孢形成(圖3)。菌株K-7為革蘭氏陽性菌，其他生理生化特征見表1，與已報道的副地衣芽孢桿菌的生化特征相符合。

表1 菌株K-7的生理生化特征

2.2.2 菌株16S rDNA序列分析 將測序獲得的 1 370 bp 16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast分析，根據(jù)同源性比對結(jié)果，利用Mega 5.0軟件構(gòu)建基于16S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹，由圖4可知，菌株與KJ-16聚為一群。結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rDNA序列分析的結(jié)果，初步將菌株K-7鑒定為副地衣芽孢桿菌()。

2.3 B. paralicheniformis K-7降解豬毛角蛋白的機(jī)理初探

根據(jù)文獻(xiàn)報道，微生物降解羽毛角蛋白主要包括2個步驟：二硫鍵斷裂、變性角蛋白水解。首先，微生物主要通過分泌二硫鍵還原酶、分泌亞硫酸鹽、菌絲體的機(jī)械作用等方式破壞二硫鍵；然后，變性的羽毛角蛋白可在角蛋白酶或其他蛋白酶的作用下被徹底水解。因此，本研究通過分析菌株 K-7 產(chǎn)酶和含硫化合物的情況，對其降解機(jī)理進(jìn)行初步研究。

2.3.1 發(fā)酵液的角蛋白酶活性、二硫鍵還原酶活性變化 由圖5-A可知，接種K-7到以羽毛角蛋白為唯一碳氮源的培養(yǎng)基中，羽毛角蛋白的降解率和角蛋白酶活性隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增加。角蛋白降解在前3 d最為迅速，這一時期，角蛋白酶活也顯著增加。但是在整個發(fā)酵周期中，并未在發(fā)酵液中檢測到顯著的二硫鍵還原酶活性，說明羽毛降解過程中二硫鍵的斷裂是由其他途徑提供的還原力。

2.3.2 菌株K-7降解角蛋白二硫鍵方式的探究 由圖5-B可知，菌株K-7在降解羽毛過程中，產(chǎn)生了大量的巰基化合物，表明羽毛角蛋白中大量交聯(lián)的二硫鍵被打開。巰基化合物的含量呈現(xiàn)出先增加后稍降低的趨勢，4 d時達(dá)最大值105.3 μg/mL。羽毛降解過程中產(chǎn)生了大量的亞硫酸鹽，同樣呈現(xiàn)出先增加后下降趨勢，5 d時達(dá)最大值 124.4 μg/mL，且其含量變化與羽毛降解率存在極強(qiáng)線性相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)為0.916 2)，表明亞硫酸鹽在羽毛角蛋白降解中起著非常關(guān)鍵的作用。

2.4 B. paralicheniformis K-7所產(chǎn)角蛋白酶粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 粗酶液的最適反應(yīng)溫度和pH值 由圖6-A可知，反應(yīng)溫度為30、40 ℃時，粗酶液的角蛋白酶活性較低；當(dāng)溫度升高至50 ℃時，酶活性顯著增加，在50～70 ℃范圍內(nèi)時，酶活性均可達(dá)最大值；但當(dāng)反應(yīng)溫度設(shè)為80 ℃時，酶活性有所降低，表明粗酶液催化角蛋白降解的最適反應(yīng)溫度為50～70 ℃。由圖6-B可知，當(dāng)反應(yīng)體系pH值在5.0～10.0時，粗酶液均有明顯的催化活性，表明該酶能耐受的pH值范圍較廣。當(dāng)pH值在7.0～8.0時，酶活性達(dá)最大值，說明粗酶液在中性和微堿性環(huán)境中能發(fā)揮最大活力。

2.4.2 粗酶液的熱穩(wěn)定性 由圖7可知，當(dāng)處理溫度低于80 ℃時，對酶活性破壞較弱，相對酶活均在80%以上；但在90 ℃條件下處理1 h后，相對酶活性降低至56.5%。結(jié)果表明，K-7所產(chǎn)粗酶液的熱穩(wěn)定性較好，可應(yīng)用于羽毛等角蛋白廢棄物資源化利用的高溫工藝流程中。

2.4.3 化學(xué)試劑對粗酶液的酶活影響 由表2可知，SDS可強(qiáng)烈抑制粗酶液的酶活力，相對酶活力僅為11.4%，而添加蛋白酶抑制劑PMSF和EDTA也對粗酶液有不同程度的抑制作用。添加DTT和-巰基乙醇則對酶活性具有顯著增強(qiáng)作用，相對酶活力分別達(dá)268.4%、317.8%。

表2 化學(xué)試劑對粗酶液酶活性影響

3 討論

羽毛角蛋白在高溫條件下結(jié)構(gòu)趨于松散，更易降解，且存在生物催化降解過程中能降低致病菌污染的可能性。目前，已報道的角蛋白降解菌株大部分為常溫型，因此發(fā)掘新的嗜熱降解菌可促進(jìn)生物降解技術(shù)在角蛋白廢棄物資源化利用方面的應(yīng)用。雞糞堆肥過程中，高溫期可達(dá)60～70 ℃，且堆體中富含羽毛角蛋白原料，因此選擇堆肥高溫期樣品作為分離源能有效分離到嗜熱的角蛋白降解菌。據(jù)報道，副地衣芽孢桿菌()可分泌高活性的胞外水解酶，如蛋白酶、脂肪酶、多糖水解酶，有助于降解植物性飼料中的復(fù)雜碳水化合物，提高植物性飼料的吸收利用率，但尚未見該菌種用于角蛋白降解方面的報道。因此，本研究篩選到K-7豐富了高溫角蛋白降解菌種資源庫，在廢棄角蛋白的資源化利用工程中應(yīng)用前景較好。

羽毛角蛋白降解的關(guān)鍵步驟是斷裂二硫鍵使角蛋白變性。基于已有報道，微生物破壞二硫鍵的方式主要有3種：機(jī)械穿透裂解、二硫鍵還原酶裂解、亞硫酸鹽裂解。機(jī)械穿透力破壞二硫鍵的現(xiàn)象發(fā)生在可產(chǎn)生菌絲體的微生物中，菌株K-7是細(xì)菌，不具有類似的途徑；菌株K-7發(fā)酵液中產(chǎn)生了大量的巰基化合物，表明角蛋白中的二硫鍵確實(shí)被大量破壞，但發(fā)酵液中并未檢測到高活性的二硫鍵還原酶，說明該菌株是通過其他方式斷裂二硫鍵；發(fā)酵液中檢測到大量的亞硫酸鹽，且其含量的變化與角蛋白的降解率呈較強(qiáng)的正相關(guān)性，因此，初步判斷亞硫酸鹽裂解是菌株K-7斷裂二硫鍵的主要方式。微生物可將羽毛中的半胱氨酸代謝成亞硫酸鹽，這個轉(zhuǎn)化過程需要半胱氨酸雙加氧酶(Cdo1)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Ast1)的參與，下一步試驗(yàn)擬構(gòu)建Cdo1、Ast1編碼基因缺失的突變菌株，分析突變株降解羽毛角蛋白的能力變化，從而進(jìn)一步明確菌株K-7的角蛋白降解機(jī)制。

在未經(jīng)優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)條件下，K-7的粗酶液酶活可達(dá)500 U/mL，高于絕大部分已報道的角蛋白降解菌株。酶學(xué)性質(zhì)分析結(jié)果顯示，粗酶液的最適反應(yīng)pH值為7.0～8.0，這主要是由于亞硫酸鹽在中性至微堿性環(huán)境中還原二硫鍵的能力最強(qiáng)。PMSF是常見的絲氨酸蛋白酶抑制劑，菌株K-7的酶活可被抑制，說明其產(chǎn)生的蛋白水解酶可能屬于絲氨酸蛋白酶類；在不同的微生物菌株種，SDS對酶活性的影響完全不同，本研究中SDS可顯著抑制酶活，這與GZD-23報道一致；DTT、-巰基乙醇是常見的還原劑，能夠催化斷裂二硫鍵，因此對酶活性有顯著的增強(qiáng)作用。

4 結(jié)論

本研究利用選擇培養(yǎng)基從雞糞高溫堆肥期樣品中分離獲得1株嗜高溫的高效角蛋白降解菌株 K-7，對羽毛角蛋白的降解率可達(dá)90%以上。結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果，初步鑒定該菌株為副地衣芽孢桿菌()。

在含羽毛角蛋白的培養(yǎng)基中發(fā)酵，該菌株產(chǎn)生的粗酶液顯示出較高的角蛋白酶活性，粗酶液的最適反應(yīng)溫度為50～70 ℃，最適反應(yīng)pH值為 7.0～8.0；粗酶液熱穩(wěn)定較好，在80 ℃以下時酶活較為穩(wěn)定；SDS、PMSF和EDTA等化學(xué)試劑對酶活有較強(qiáng)的抑制作用，而DTT、-巰基乙醇對酶活性有顯著的增強(qiáng)作用。

結(jié)合發(fā)酵上清液中角蛋白酶活、二硫鍵還原酶活、亞硫酸鹽含量、巰基化合物含量分析結(jié)果，初步分析其降解機(jī)制為：菌株K-7分泌的亞硫酸鹽提供還原力破壞羽毛角蛋白中的二硫鍵，變性后的角蛋白在胞外蛋白酶作用下進(jìn)一步被徹底分解。