不同質(zhì)地葡萄果實果膠含量及基因表達(dá)差異分析

馬 麗， 喬 軍， 呂春晶， 孫凌俊

(1.遼寧省果樹科學(xué)研究所，遼寧營口 115009； 2.遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧營口 115009)

葡萄屬于葡萄科(Vitaceae)葡萄屬()多年生植物，是世界上最古老的物種之一，其果實可用于鮮食、釀酒和制干，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值。葡萄在世界果樹生產(chǎn)中占有非常重要的位置，據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)統(tǒng)計，2018年全世界葡萄栽培面積約為715.8萬hm，總產(chǎn)量約為7 912.6萬t。我國葡萄栽培面積達(dá)到79.8萬hm，約占全球總面積的11.1%，產(chǎn)量1 349.5萬t，約占全球葡萄總產(chǎn)量的17.1%(http：//www.fao.org/faostat/en/#data)，是世界葡萄的第一生產(chǎn)大國。就全世界葡萄生產(chǎn)而言，近70%的葡萄用于加工，超30%的葡萄用于鮮食，而我國則以鮮食為主，占據(jù)70%以上，鮮食葡萄生產(chǎn)是我國葡萄產(chǎn)業(yè)的主體。

葡萄屬于典型的非呼吸躍變型果實，果實軟化發(fā)生時間比呼吸躍變型果實要早，且由于其為漿果，果實皮薄，汁多，在食用、運輸貯存過程中易發(fā)生破裂、腐爛等問題，所以就其鮮食品質(zhì)而言，果實質(zhì)地已經(jīng)成為判斷鮮食葡萄果實新鮮程度的一個重要指標(biāo)。不同葡萄品種間果實質(zhì)地存在較大差異，脆肉型品種一直備受消費者關(guān)注，現(xiàn)已成為重要的育種材料及目標(biāo)品種，然而造成不同品種間質(zhì)地差異的機(jī)制還不是很清楚。因此，了解葡萄果實成熟軟化及不同質(zhì)地形成因素，對于葡萄綜合品質(zhì)改良及葡萄栽培有著非常重要的理論意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用脆肉型葡萄品種紅地球(L.)和軟肉型葡萄品種玫瑰香(L.)為試材，2個品種均定植于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄試驗園內(nèi)(41°50′24″N，123°24′41″E)，管理水平一致。鑒于2個葡萄品種在遼寧省沈陽地區(qū)物候期接近，2018年2個品種分別于盛花后56 d(轉(zhuǎn)色前)開始采樣，每隔7 d采樣1次，直到果實成熟。采樣時間均定在08：00進(jìn)行，采集方式：每個品種隨機(jī)選取長勢較為一致的6株樹，在植株的不同位置選取20個果粒作為1個重復(fù)，每個時期采集3個重復(fù)，用裝有冰袋的保溫箱迅速帶回實驗室。在實驗室內(nèi)，每個重復(fù)樣品隨機(jī)選取5個果粒，將種子剔除，果實磨成細(xì)末狀，用錫紙包好，經(jīng)液氮冷凍1 h后置于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。其他果實放? ℃冰箱用于果實質(zhì)地及內(nèi)含物測定。

1.2 試驗方法

1.2.1 果實質(zhì)地相關(guān)指標(biāo)測定 葡萄果實質(zhì)地測定采用整果穿刺測試法。穿刺試驗使用的是英國Stable Micro Systems 公司生產(chǎn)的TA.XT Plus質(zhì)構(gòu)儀，穿刺試驗選擇2 mm直徑的P/2針狀探頭，測試在室溫下進(jìn)行，測試時將被測試的漿果放置在質(zhì)構(gòu)儀載物臺的中心位置，用手稍稍固定，力量以不壓迫果實為宜，樣品被穿刺部位為葡萄漿果中部偏上區(qū)域。質(zhì)構(gòu)儀主要參數(shù)設(shè)定為測前速度為 1 mm/s，貫穿速度為1 mm/s，測后速度為10 mm/s，穿刺深度設(shè)為7 mm，負(fù)載觸發(fā)力為5 g。參數(shù)設(shè)定時需要注意，穿刺既要保證一定的穿刺深度，又要避免在穿刺過程中探頭接觸到葡萄種子，影響測試結(jié)果。質(zhì)地相關(guān)指標(biāo)包括：果皮硬度(PPH)、果皮破裂距離(PB)、果肉硬度(SF)，果皮硬度是從探頭接觸果皮開始，到探頭穿刺果皮瞬間所用的力(g)；果皮破裂距離是從接觸到刺破果皮瞬間探頭下行位移(mm)；果肉硬度是探頭穿刺果肉到測試結(jié)束所測感應(yīng)力的平均值(g)。

1.2.2 總糖和總酸含量測定 葡萄果實中總糖和總酸含量利用高效液相色譜儀Agilent1260(美國安捷倫公司)進(jìn)行測定。吸取擠壓好并混和均勻的葡萄汁，加入超純水定容至10 mL，吸取定容后果汁 2 mL 置于離心管中，12 000 r/min離心10 min。然后吸取上清液和pH值=2.6的磷酸二氫鉀鹽溶液各500 μL至新的2 mL離心管中進(jìn)行總酸的提取，加入等體積的乙腈進(jìn)行總糖的提取，后使用水系微孔濾膜進(jìn)行過濾，過濾后的溶液用于上機(jī)檢測。

總糖含量測定使用的是Agilent Zorbax Carbohydrate色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)和示差折光(RID)檢測器，柱溫為40 ℃，運行時間為15 min；流動相體積比為75 ∶25的乙腈和純凈水，流速為 1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

總酸含量測定使用的是Agilent SB-AQ色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)，G1314B可變波長紫外檢測器(VWD)，參數(shù)為柱溫25 ℃，波長210 nm，運行時間15 min。流動相為體積比為95 ∶5的10 mmol/L磷酸二氫鉀和甲醇溶液，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.3 果膠含量測定 原果膠和可溶性果膠采用比色法測定，略有改動。具體方法如下：稱取 1.0 g 帶果皮的果肉組織，在液氮保護(hù)下研成勻漿，轉(zhuǎn)到事先裝好25 mL的95%乙醇溶液的50 mL離心管中，沸水加熱30 min，在煮沸的過程中要及時補加95%乙醇溶液，冷卻至室溫后，需8 000 r/min離心 15 min，去除上清液，再加入95%乙醇溶液，沸水浴加熱，如此反復(fù)3次。然后將沉淀置于20 mL蒸餾水中，50 ℃保溫30 min后，溶解果膠。取出冷卻至室溫，8 000 r/min 離心15 min，再將上清液用蒸餾水定容至100 mL，該液為水溶性果膠；在沉淀中加入25 mL 0.5 mol/L的硫酸溶液，沸水加熱1 h，取出冷卻至室溫，于8 000 r/min離心15 min，上清液用蒸餾水定容至100 mL，該液為原果膠。測定時吸取1 mL提取液，加入6 mL濃硫酸，沸水加熱 20 min，冷卻室溫后，加入0.2 mL 1.5 g/L咔唑-乙醇溶液，暗處放置30 min后，測定反應(yīng)液在530 nm處的吸光度，重復(fù)3次。根據(jù)溶液吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的半乳糖質(zhì)量，計算果膠含量，以生成的半乳糖醛酸的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)表示果膠含量。

1.2.4 熒光定量PCR分析 將2個品種花后56、63、70、84、98 d的果實樣品進(jìn)行總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄合成后的cDNA稀釋5倍作為候選基因差異表達(dá)分析的模板。實時熒光定量反應(yīng)在ABI QuantStudio 6 Flex System(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，美國)384 孔儀器上進(jìn)行，使用SYBR? PremixExⅡ(Takara，Madison，WI，美國)制造反應(yīng)混合液。以作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔ計算差異表達(dá)值，所有樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，RT-PCR引物采用Primer3設(shè)計，相關(guān)引物信息見表1。

表1 相關(guān)基因RT-PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 果實發(fā)育過程中果實質(zhì)地差異變化

葡萄果實質(zhì)地是評價果實成熟軟化的一項重要依據(jù)，對紅地球和玫瑰香2個品種各發(fā)育階段果實質(zhì)地進(jìn)行測定，由圖1分析發(fā)現(xiàn)，紅地球和玫瑰香2個品種果皮硬度在轉(zhuǎn)色期(花后 63 d)之前均保持在較高水平，隨著發(fā)育時期遞進(jìn)，軟肉玫瑰香在轉(zhuǎn)色期后，果皮硬度迅速下降，直到成熟期達(dá)到最低值，而脆肉紅地球果皮硬度下降時期較玫瑰香晚，在花后70 d才開始下降。雖然在花后84 d時，2個品種果皮硬度接近，但成熟時紅地球果皮硬度還是遠(yuǎn)高于玫瑰香的果皮硬度。果皮破裂距離可以反映果皮被刺穿時漿果形變的程度。由圖2可知，2個品種果皮破裂距離呈相似的增長趨勢，轉(zhuǎn)色前期，2個品種果皮破裂距離都處于較低水平，轉(zhuǎn)色期紅地球和玫瑰香果皮破裂距離比較接近，分別為2.00、2.05 mm，而后隨著果實成熟，果皮破裂距離迅速增大，成熟期相差較大，分別為3.68、5.13 mm，整個發(fā)育過程紅地球的果皮破裂距離都明顯低于玫瑰香的果皮破裂距離。由圖3可知，果肉硬度更多反映的是果肉的機(jī)械性能，果實整個發(fā)育過程中，2個品種果肉硬度變化趨勢與果皮硬度的變化趨勢相似，即隨著果實的生長發(fā)育果肉硬度逐漸降低，轉(zhuǎn)色后下降速度迅速增快，近成熟期果肉硬度變化較為平緩，成熟期時紅地球和玫瑰香果肉硬度分別降到了44.6、26.28 g，并且在每個發(fā)育階段紅地球的果肉硬度都高于玫瑰香的果肉硬度。

2.2 果實發(fā)育過程中果實糖酸含量變化

伴隨著果實的發(fā)育、成熟軟化，與成熟軟化相關(guān)的內(nèi)含物也發(fā)生了明顯的變化，總糖含量增加，總酸含量降低。由圖4可知，轉(zhuǎn)色前期葡萄果實內(nèi)總糖含量較低，隨著果實轉(zhuǎn)色，迅速增加，在果實成熟時達(dá)到最高，而后基本保持不變。紅地球在轉(zhuǎn)色后1周總糖含量增加較慢，出現(xiàn)了一個平臺期，而后迅速增加，成熟期達(dá)到最高。玫瑰香總糖含量增加比紅地球快，且玫瑰香各個時期的總糖含量均明顯高于紅地球。由圖5可知，果實內(nèi)總酸含量隨著果實的成熟逐漸降低，紅地球是個退酸較快的葡萄品種，轉(zhuǎn)色時總酸含量急劇下降，而后變化較為平緩，但總酸水平也逐漸降低，直到成熟。玫瑰香果實內(nèi)的總酸含量也隨著果實成熟軟化逐漸下降，但各時期含量都高于紅地球。

2.3 果實發(fā)育過程中果膠含量變化

隨著葡萄果實的成熟軟化，果實細(xì)胞壁發(fā)生降解，果實質(zhì)地發(fā)生了顯著變化，果膠作為細(xì)胞壁基質(zhì)中含量最高的一類大分子物質(zhì)，其組分和含量也發(fā)生了變化。由圖6可知，隨著葡萄果實的生長發(fā)育，2個品種原果膠含量逐漸下降，但在整個發(fā)育階段，紅地球果實內(nèi)的原果膠含量一直高于玫瑰香。隨著果實的成熟軟化，原果膠在相關(guān)酶的作用下分解成可溶性果膠含量，可溶性果膠呈逐漸增加趨勢，且在轉(zhuǎn)色后增加速度較快，與原果膠相反，紅地球果實內(nèi)的可溶性果膠含量一直低于玫瑰香(圖7)。

2.4 果實發(fā)育過程中果膠降解酶基因的表達(dá)

由圖8可知，-表達(dá)量在軟肉玫瑰香和脆肉紅地球中均呈先升高后降低的趨勢。在轉(zhuǎn)色前期，2個品種的表達(dá)量接近，轉(zhuǎn)色期二者表達(dá)量均迅速增加，此后-在2個品種中的表達(dá)模式發(fā)生變化。脆肉紅地球中-的表達(dá)量在轉(zhuǎn)色期達(dá)到最高值后逐漸下降，在成熟期達(dá)到最低值，而軟肉玫瑰香中的表達(dá)量在轉(zhuǎn)色后繼續(xù)升高，花后 84 d 略有降低，但都處于較高水平，而在成熟期表達(dá)量才下降到較低水平。在葡萄果實轉(zhuǎn)色后的各個時期，軟肉玫瑰香中-的表達(dá)量一直極顯著高于脆肉紅地球中的表達(dá)量(除花后98 d)。結(jié)果表明，-基因可能在轉(zhuǎn)色后期調(diào)控了葡萄不同質(zhì)地形成。

表達(dá)量在軟肉葡萄玫瑰香轉(zhuǎn)色期即迅速升高，而后持續(xù)較高水平，在花后84 d開始下降，而在脆肉葡萄紅地球中的表達(dá)量在果實發(fā)育前期一直處于較低水平，花后70 d才開始逐漸升高，花后84 d達(dá)到最高值后又略有下降(圖9)。比較2個品種各個時期的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)色前后表達(dá)量差異極顯著，隨著果實成熟軟化表達(dá)量差異變小，但仍然是軟肉葡萄玫瑰香中的表達(dá)量明顯高于脆肉葡萄紅地球中的表達(dá)量。結(jié)果說明可能對葡萄成熟軟化及不同質(zhì)地形成起到一定作用。

表達(dá)量在2個品種中的變化趨勢明顯不同，在整個發(fā)育階段，軟肉葡萄玫瑰香中的表達(dá)量一直處于較高水平，而在脆肉葡萄紅地球中表達(dá)量呈現(xiàn)出先升高后降低再升高的趨勢，且各個時期，在軟肉葡萄玫瑰香中的表達(dá)量一直極顯著高于在脆肉葡萄紅地球中的表達(dá)量(圖10)。結(jié)果表明，很可能調(diào)控了葡萄果實的成熟軟化及質(zhì)地的形成。

3 結(jié)論與討論

3.1 果膠變化與不同質(zhì)地形成的關(guān)系

果膠是果實細(xì)胞壁中非常重要的大分子物質(zhì)，其組分和含量對果實質(zhì)地都會產(chǎn)生一定的影響。Dong等以2個歐洲冬梨品種為試材，對貯存5個月后可溶性果膠(WSP)含量和果膠降解酶活性進(jìn)行測定，得出歐洲梨果實質(zhì)地與PG、PL、PME、-GAL、-ARF等果膠降解酶高度相關(guān)，WSP含量越高，果實硬度越低，認(rèn)為果實中WSP可以通過減少細(xì)胞黏附，使果實更容易軟化。Yang等發(fā)現(xiàn)沉默基因的番茄果實中可溶性果膠含量降低，果實硬度增加，認(rèn)為可溶性果膠含量與番茄果實硬度密切相關(guān)。管雪強(qiáng)等對紅地球葡萄進(jìn)行噴鈣處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外源鈣可以增加果實內(nèi)原果膠含量、總果膠含量以及果實硬度，且發(fā)現(xiàn)果實硬度與果膠含量呈極顯著正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)脆肉葡萄紅地球中原果膠含量在各時期都顯著高于軟肉葡萄玫瑰香中的含量，且果皮硬度和果肉硬度與原果膠含量呈極顯著正相關(guān)，這與管雪強(qiáng)等的研究結(jié)果相似，與可溶性果膠含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與Dong等的結(jié)論相似。

3.2 果膠降解酶基因與葡萄不同質(zhì)地形成的關(guān)系

和基因可以降解去甲酯化的果膠，參與果實成熟軟化過程。Villarreal等研究發(fā)現(xiàn)，可編碼PG酶活性的基因在脆肉草莓中低表達(dá)，而在軟肉草莓中高表達(dá)，而-(缺少PG 5′端 85 bp 而導(dǎo)致編碼無活性的PG酶)基因表達(dá)模式正好相反，在脆肉草莓中高表達(dá)，在軟肉草莓中低表達(dá)。Fabi等研究得出了基因在木瓜果實成熟軟化中的關(guān)鍵作用。Atkinson等發(fā)現(xiàn)基因可以通過影響細(xì)胞壁降解和降低細(xì)胞間黏稠度來調(diào)控蘋果果實硬度。也有研究得出不同PG活性造成了葡萄果實質(zhì)地的差異?；虮徽J(rèn)為是調(diào)節(jié)果實成熟軟化的一種重要的候選基因。有研究者認(rèn)為草莓果實成熟軟化與基因有著直接的關(guān)系。Nunan等發(fā)現(xiàn)基因高表達(dá)可以促進(jìn)葡萄果實軟化。本研究發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)地葡萄果實的、基因表達(dá)模式相近，隨著果實成熟表達(dá)量增加，但比較二者表達(dá)量發(fā)現(xiàn)軟肉葡萄玫瑰香中的表達(dá)量高于脆肉葡萄紅地球中的表達(dá)量，這可能是造成不同質(zhì)地果實形成的關(guān)鍵因素，該結(jié)論與前人的研究結(jié)果相似。

Smith等研究得出-Gal在草莓果實成熟軟化過程中起到了關(guān)鍵作用。Paniagua等研究發(fā)現(xiàn)，基因在草莓成熟過程中，參與了共價果膠的溶解過程，降低了果實硬度，得出的表達(dá)與草莓果實硬度密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)在葡萄果實成熟軟化早期，軟肉型玫瑰香中-的表達(dá)量迅速升高，且在整個成熟過程中，軟肉型玫瑰香-的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于脆肉紅地球中的表達(dá)量，結(jié)果表明-對葡萄果實質(zhì)地差異形成起到一定作用，與前人的研究結(jié)果相似。