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    低溫等離子體在口腔微生物感染性疾病中的應(yīng)用研究進(jìn)展

    2022-07-28 02:01:38孫小欽
    實(shí)用醫(yī)院臨床雜志 2022年4期
    關(guān)鍵詞:生物膜種植體成骨細(xì)胞

    孫小欽,王 旭,韓 琪,3,陳 宇,3△

    (1.口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心,四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院,四川成都610041;2.四川大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院,四川成都610041;3.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院口腔病理科,四川成都610041)

    口腔富含微生物,口腔微生物組是“表示共生,和病原微生物共生的生態(tài)群落,實(shí)際上共享我們的身體空間,為健康和疾病的決定因素”,當(dāng)口腔微生物群失去穩(wěn)態(tài)時(shí)會導(dǎo)致一系列微生物感染性疾病[1]。免疫系統(tǒng)可協(xié)調(diào)維持宿主與微生物之間的平衡,但找尋一種新型的口腔抗感染方法是當(dāng)前該領(lǐng)域的研究方向。20世紀(jì)90年代,等離子體抗菌在醫(yī)用研究上取得很大進(jìn)度。低溫等離子體(cold atmospheric plasma, CAP)通過向氣體提供能量誘導(dǎo)電離產(chǎn)生,形成活性氧和氮物質(zhì)(reactive oxygen and nitrogen species ,RONS)等部分電離氣體[2]。當(dāng)微生物直接暴露于CAP時(shí),RONS綜合協(xié)同作用滅活[3]。CAP可調(diào)節(jié)與氧化還原信號相關(guān)的多個(gè)細(xì)胞過程,活性氧(reactive oxygen species,ROS)的變化會觸發(fā)氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用[2],促進(jìn)有微生物導(dǎo)致的口腔創(chuàng)傷感染愈合。該文對CAP在口腔微生物感染性疾病中的應(yīng)用做一概述。

    1 CAP防治齲病應(yīng)用

    齲病與口腔微生物群落生態(tài)失調(diào)密切相關(guān),膳食碳水化合物代謝持續(xù)產(chǎn)酸導(dǎo)致耐酸微生物增加,改變牙體硬組織表面pH穩(wěn)態(tài),打破脫礦-再礦化平衡[4],導(dǎo)致牙無機(jī)物脫礦、有機(jī)物分解而形成齲。

    1.1 CAP與口腔齲病相關(guān)浮游微生物等離子體應(yīng)用牙科抗菌研究始于20世紀(jì)初期[2]。CAP對接種在不同介質(zhì)(多孔介質(zhì)如濾紙,光滑固體表面介質(zhì)如載玻片,聚合物表面介質(zhì)如牙釉質(zhì)類似物)的變異鏈球菌和嗜酸乳桿菌均有較好的殺菌效果,但嗜酸乳桿菌的滅活時(shí)間比變異鏈球菌長。嗜酸乳桿菌的直徑比變異鏈球菌大,具有更高的等離子體耐受性,為了使單個(gè)細(xì)胞達(dá)到相同強(qiáng)度的等離子體射流,在相同條件下,CAP處理嗜酸乳桿菌的時(shí)間會更長。其次是在相似細(xì)胞群密度下,嗜酸乳桿菌的細(xì)胞層重疊比變異鏈球菌更多,CAP的活性物質(zhì)被細(xì)胞外層阻擋而無法到達(dá)細(xì)胞的下層。革蘭氏陽性菌對CAP治療的敏感性低于革蘭氏陰性菌,這可能是由于革蘭氏陽性菌的肽聚糖層厚而堅(jiān)韌。CAP中的活性物質(zhì)可以破壞革蘭氏陽性細(xì)菌肽聚糖結(jié)構(gòu)中的鍵和導(dǎo)致革蘭氏陰性細(xì)菌膜的脂質(zhì)過氧化[5]。

    1.2 CAP對生物膜的作用牙菌斑生物膜在齲病的發(fā)生上有重要作用。研究[6]發(fā)現(xiàn)氬/氧CAP處理2分鐘后顯著降低了血鏈球菌單一菌種和雙菌種生物膜中細(xì)菌的活力,降低幅度高達(dá)99%,其機(jī)制是通過降低細(xì)菌活力以及疏水性和共聚集能力來有效地滅活口腔細(xì)菌生物膜。氮基CAP處理后,羥基磷灰石盤(HA)上由人工唾液包被培養(yǎng)的生物膜被殺滅,同時(shí)HA表面形成具有羥基的新化合物,增加了表面的親水性,可能影響細(xì)菌的粘附和生長速度[7]。CAP對生長在修復(fù)樹脂復(fù)合材料表面的生物膜有抗菌效果,作用150秒后,細(xì)菌活力降低38.3%,同時(shí)能立即降低未破壞生物膜的代謝活性[8]。但生物膜去除方面存在局限性,其厚度可以減少CAP進(jìn)入,防止CAP滲透到深層及對生物膜底部細(xì)菌的殺菌作用。此外,牙菌斑生物膜破壞程度與菌種組成和CAP氣體成分有相關(guān)性。

    1.3 CAP與牙體硬組織再礦化提高牙齒再礦化能力也是防治齲病的有效手段,氟化物可以增強(qiáng)牙釉質(zhì)的再礦化、抗菌、抗腐蝕。CAP處理后牙齒表面氟化物的保留改善,CAP和氟化物聯(lián)合治療組的牙釉質(zhì)含氟量和鈣磷都比CAP未處理組高,說明CAP處理牙齒表面后對氟化物的吸收增加,提高了氟化物在牙釉質(zhì)上的滯留率,導(dǎo)致牙釉質(zhì)表面酸溶解度和脫鈣降低。氟化鈣樣沉積物在口腔的停留時(shí)間較短,而CAP處理后,作為活性氧物質(zhì)的羥基自由基與牙齒表面相互作用改變表面特征,形成氟化鈣抑制牙釉質(zhì)表面礦物質(zhì)溶解。類釉質(zhì)HA經(jīng)過CAP處理后,氟保留得到改善,這可能與抗菌和抗生物膜作用增加相關(guān)[9]。CAP具有生物膜調(diào)節(jié)和氟化強(qiáng)化牙釉質(zhì)雙重作用,可以預(yù)防和治療齲病。

    2 CAP在牙髓炎和根尖周炎中的應(yīng)用

    根尖周病和牙髓疾病與口腔微生物感染密切相關(guān),牙髓復(fù)雜的根管解剖結(jié)構(gòu)和個(gè)體間牙本質(zhì)小管形態(tài)的差異讓次氯酸鈉和氯己定對根管系統(tǒng)的所有部分充分消毒進(jìn)行困難[10],CAP能深入到常規(guī)操作不能達(dá)到的根管腔隙中。

    2.1 CAP對糞腸球菌的作用在牙髓感染和慢性根尖周炎中,糞腸球菌常被分離出來[11]。CAP對糞腸球菌浮游培養(yǎng)物具有良好的殺菌效果,且CAP處理時(shí)間變長時(shí)進(jìn)一步提高了殺滅效果。CAP對年輕或者成熟(培養(yǎng)48小時(shí)或72小時(shí))的生物膜具有顯著抗菌功效,通過核酸釋放的光譜測量發(fā)現(xiàn)處理后細(xì)胞質(zhì)膜沒有損傷,表明CAP主要作用機(jī)制似乎不是膜損傷。氦/氧等離子體對糞腸球菌生物膜的殺菌作用強(qiáng)于純氦等離子體[12]。在次氯酸鈉使用后輔助使用CAP處理糞腸球菌生物膜,與單用次氯酸鈉顯示出相似的抗菌效果,均比單獨(dú)使用CAP有效[13]。

    2.2 CAP與其他根管感染相關(guān)微生物滅菌后的離體牙根管內(nèi)培養(yǎng)白色念珠菌—感染根管內(nèi)最常見的真菌,發(fā)現(xiàn)單用CAP殺滅白色念珠菌的效果好過次氯酸鈉和氯己定[14]。在無菌牛牙本質(zhì)盤上培養(yǎng)來自人牙根管感染的多菌種細(xì)菌,證實(shí)CAP與氯己定對混合菌種生物膜的殺菌具有協(xié)同作用。通過分析CAP在不同深度感染根管中的殺菌效果,發(fā)現(xiàn)CAP與氯己定組合使用在整體消毒和根管0~300 μm層內(nèi)更有效[15]。但實(shí)際情況下根管內(nèi)的感染為多菌種的復(fù)雜感染,CAP對根管多菌種生物膜處理效果如何有待進(jìn)一步研究。

    2.3 CAP對根管材料的作用Bisag等[16]用氦等離子體對預(yù)備好的離體牙根管處理180秒后,直接使用牙膠尖充填,通過共焦顯微鏡分析發(fā)現(xiàn)CAP處理提高了牙膠尖向牙本質(zhì)小管的擴(kuò)散和滲透程度。同時(shí)CAP處理后環(huán)氧樹脂基纖維樁和充填樹脂之間的粘合增加,其原理可能是CAP改變其表面性質(zhì)[17],強(qiáng)調(diào)了在根尖封閉中避免使用具有細(xì)胞毒性的根管封閉劑的可能性,提示CAP輔助根管治療的應(yīng)用潛力。

    3 CAP在牙周病中的應(yīng)用

    牙周和牙髓組織兩個(gè)部位的微生物群之間存在相似性,但牙周微生物群變動復(fù)雜和多樣化。牙周炎由多種微生物的協(xié)同作用和宿主的免疫反應(yīng),導(dǎo)致牙周組織進(jìn)行性破壞[18]。

    3.1 CAP與牙周炎感染相關(guān)微生物牙周炎生物膜相關(guān)的的致病因素包括牙齦卟啉單胞菌、齒狀密螺旋體和連翹革蘭氏菌[18]。CAP對牙齦卟啉單胞菌具有顯著的劑量相關(guān)滅活作用,暴露時(shí)間越長,細(xì)菌抑制區(qū)越大。而牙齦卟啉單胞菌生物膜具有多層結(jié)構(gòu),通過逐層掃描,發(fā)現(xiàn)厚度約15 μm,相當(dāng)于30層牙齦卟啉單胞菌,但CAP可以穿透15 μm的生物膜,有效抑制牙齦卟啉單胞菌[19]。

    3.2 CAP在牙周炎中對組織修復(fù)作用骨重塑階段是通過骨形成和骨吸收之間的平衡進(jìn)行管理,其中,成骨細(xì)胞在這些過程中發(fā)揮重要的關(guān)鍵作用并產(chǎn)生多種蛋白質(zhì),如堿性磷酸酶、骨鈣素和I型膠原蛋白,它們可以刺激新骨形成。CAP有形成RONS獲得殺菌和促進(jìn)成骨細(xì)胞分化等特性,實(shí)驗(yàn)[20]發(fā)現(xiàn)CAP處理后增加大鼠成骨細(xì)胞活性并降低破骨細(xì)胞活性,同時(shí)骨鈣素和堿性磷酸酶抗體的免疫反應(yīng)性增加。CAP刺激引起的機(jī)械負(fù)荷和電刺激等物理壓力可能會誘導(dǎo)細(xì)胞增殖并促進(jìn)骨再生。還有實(shí)驗(yàn)[21]分析CAP影響人成骨細(xì)胞樣細(xì)胞(MG63)基因和蛋白質(zhì)調(diào)節(jié),與未處理的細(xì)胞相比,處理組關(guān)鍵凋亡標(biāo)志物p53、凋亡蛋白酶激活因子-1、半胱天冬酶9和半胱天冬酶3的表達(dá)顯著下調(diào),CAP對凋亡基因有抑制作用。通過評估應(yīng)用CAP與牙根平整術(shù)對牙周炎患者臨床效果研究,發(fā)現(xiàn)CAP作為輔助治療增加了牙齒的臨床附著水平,并有效減少牙周病原體重新定植。以上研究可以認(rèn)為CAP具有通過炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、成骨細(xì)胞分化和減少牙槽骨丟失來加速治療牙周炎的臨床潛力。

    4 CAP與種植體周圍炎

    種植體周圍炎指伴有支持骨丟失的種植體周圍組織的炎癥反應(yīng),是種植體失敗的重要危險(xiǎn)因素之一[22]。

    4.1 CAP與種植體周圍炎感染相關(guān)微生物研究[3,23,24]發(fā)現(xiàn)CAP處理不同材質(zhì)(鈦,氧化鋯)的種植體后,牙齦卟啉單胞菌在其表面的粘附和生長得到抑制,有效減少生物膜,同時(shí)對牙齦上皮細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性,與氯己定、激光等方法對比時(shí)顯示了更好的效果。氦氣CAP處理氧化鋯表面后,ROS抑制變異鏈球菌生長,處理的時(shí)間依賴性有效性取決于CAP處理后氧化鋯在不同儲存時(shí)間下的表面特性和抗菌功效的變化。盡管60秒CAP處理的氧化鋯的抗菌效果隨著時(shí)間的推移降低,但14天后處理表面上的細(xì)菌比未處理表面上的細(xì)菌要少,氧化鋯圓盤仍然具有一定的抑菌能力,通過活性氧染色分析,驗(yàn)證了其抑菌能力是殘留在氧化鋯表面的ROS對細(xì)菌施加氧化應(yīng)激,導(dǎo)致其死亡[25]。

    4.2 CAP與種植體表面改性氧化鋯基臺通過CAP處理后材料表面的親水性增加,表面形貌未變,但鈦表面經(jīng)過處理后粗糙程度得到提高,促進(jìn)成骨細(xì)胞的粘附、增殖和分化[26]。空氣CAP 對人類牙周細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞樣細(xì)胞具有良性刺激作用,促進(jìn)其在種植體表面的增殖、黏附,提示CAP治療提供的愈合能力可以增強(qiáng)牙種植體的骨整合,這可能是由于水接觸角減小和表面官能團(tuán)存在氧,和/或碳污染水平降低[27,28]。通過增強(qiáng)鈦基臺上的種植體周圍軟組織密封,防止口腔環(huán)境感染,減少種植失敗,CAP有可能成為種植體周圍炎治療的有效選擇,但關(guān)于CAP對種植體周圍炎的作用研究多為體外研究或動物研究,并不完全符合口腔的真實(shí)情況。

    5 CAP促進(jìn)口腔傷口愈合

    增加活性氧可以促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子的釋放和傷口愈合[29]。RONS可以滅活細(xì)菌,提高組織中的血氧水平,加速愈合過程。

    5.1 CAP通過抗菌促進(jìn)口腔傷口愈合微生物感染嚴(yán)重阻礙或延緩愈合過程,慢性傷口的微生物常具有耐藥性,包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA),銅綠假單胞菌等。以氯己定作為陽性對照,發(fā)現(xiàn)不同氣體(氬氣,氬氣和氧氣混合物)的CAP對銅綠假單胞菌生物膜的治療效果至少與氯己定處理一樣有效,甚至更好,具體取決于氣體、菌種組成和暴露時(shí)間[30]。CAP對小鼠感染傷口進(jìn)行治療時(shí),提高了抗生素的有效性并降低了滅活MRSA生物膜所需的抗生素濃度,同時(shí)CAP治療與抗生素相結(jié)合可以有效地減少體外和小鼠傷口模型中的生物膜[31]。

    6 結(jié)語

    由于其抗菌性能、促進(jìn)傷口愈合和生物安全性,CAP在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。目前CAP在口腔醫(yī)學(xué)的應(yīng)用仍停留在研究階段以及臨床的初步實(shí)驗(yàn),實(shí)際應(yīng)用于口腔臨床還需要更深入的研究。作為一項(xiàng)新技術(shù),CAP也存在一些缺點(diǎn),裝置的成本及其維護(hù)是目前很受關(guān)注的問題,設(shè)備的便攜性也是牙科應(yīng)用中的一個(gè)關(guān)注點(diǎn)。這些問題都有待未來的技術(shù)革新解決。

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