貧血樣本手工推片與自動(dòng)化推片用于數(shù)字化閱片儀的對比研究

黃小天，張 斌，邱婧璐，歐 華

(1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 a.臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，b.骨科，四川 成都 610072；2.成都市新津區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 成都 611436)

在外周血檢測中貧血是最常見的情況，很多疾病如：白血病、骨折等創(chuàng)傷失血、缺鐵、血紅蛋白病、孕產(chǎn)期貧血等都會(huì)直接導(dǎo)致血紅蛋白含量降低造成貧血[1]。貧血樣本由于血紅比含量較低，手工推片時(shí)往往難以把握好血滴量及推片角度和力度，影響推片質(zhì)量從而影響鏡檢分類外周血細(xì)胞。自動(dòng)推片機(jī)可通過檢測外周血紅細(xì)胞比容(hematocrit, HCT)值來控制血推片的角度和力度，保證血推片的質(zhì)量，數(shù)字化細(xì)胞形態(tài)閱片儀可提升外周血涂片的閱片速度、降低漏診的概率，并具有外周血推片質(zhì)量分析軟件CellaVision SmearChecker模塊功能[2]。本研究通過選取貧血樣本，采取自動(dòng)推片和手工推片的方法制備樣本，采用CellaVision SmearChecker模塊功能分析其推片質(zhì)量，并對白細(xì)胞分類結(jié)果與人工顯微鏡鏡檢進(jìn)行相關(guān)性分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料2020年2～10月選取四川省人民醫(yī)院臨床送檢樣本100例。在臨床醫(yī)生要求檢測全血細(xì)胞計(jì)數(shù)的樣本中選取血紅蛋白<80 g/L的貧血樣本，排除血紅蛋白>80 g/L的貧血樣本。經(jīng)過Sysmex XN自動(dòng)血球分析儀進(jìn)行流水線分析后，紅細(xì)胞(RBC)(1.72～3.00)×1012/L，血紅蛋白(HGB)38～80 g/L，白細(xì)胞(WBC)分類正常45例，分類異常55例，其中7例WBC數(shù)為(0.24～1.00)×109/L。將100例外周血樣本分別進(jìn)行自動(dòng)推片機(jī)制片和人工手工推片，每組50例，并將兩種方法制得的血片進(jìn)行染色分析。

1.2 儀器與試劑全自動(dòng)細(xì)胞形態(tài)分析儀DI-60(瑞典 CellaVision AB公司)；自動(dòng)血細(xì)胞分析儀XN(日本 希森美康Sysmex公司)；自動(dòng)推片機(jī)SP-10(日本Sysmex公司)；人工顯微鏡(日本奧林巴斯Olympas公司)；瑞氏-吉姆薩染液(珠海貝索生物技術(shù)公司)。

1.3 樣本收集與制備樣本的采集與檢測按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第3版進(jìn)行[3]，采用自動(dòng)血細(xì)胞分析儀XN進(jìn)行血常規(guī)的檢測。分別采取自動(dòng)推片機(jī)SP-10進(jìn)行制片和手工推片進(jìn)行制片，將兩種方式制得的血片均用自動(dòng)推片機(jī)SP-10進(jìn)行染色。

1.4 樣本分析方法

1.4.1推片質(zhì)量分析方法 采用外周血推片質(zhì)量分析軟件CellaVision SmearChecker對自動(dòng)推片手工推片的樣本進(jìn)行質(zhì)量分析，SmearChecker軟件在DI-60上使用，可以對外周血制片標(biāo)準(zhǔn)[4]中推片樣本中進(jìn)行染色酸堿度、染色強(qiáng)度及單層長度進(jìn)行分析。本次染色方法通過SmearChecker軟件進(jìn)行質(zhì)控，調(diào)至染色酸堿度及強(qiáng)度在最佳范圍內(nèi)，通過SmearChecker對自動(dòng)推片和手工推片的單層細(xì)胞長度進(jìn)行分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[7]并比較兩組差異。SmearChecker軟件中綠色代表單層細(xì)胞良好區(qū)域、黃色代表單層細(xì)胞一般區(qū)域及紅色代表單層細(xì)胞較差區(qū)域。

1.4.2單層紅細(xì)胞統(tǒng)計(jì)分析方法 采用DI-60外周血涂片分析功能進(jìn)行數(shù)字化分析及人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析，分別統(tǒng)計(jì)自動(dòng)推片和人工推片樣本，紅細(xì)胞概覽圖中不重疊的紅細(xì)胞數(shù)量[5]，并對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.3人工顯微鏡鏡檢和數(shù)字化細(xì)胞形態(tài)閱片儀白細(xì)胞分類方法 采用人工顯微鏡鏡檢的方式，2名臨床檢驗(yàn)技師進(jìn)行審核，計(jì)數(shù)100個(gè)白細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及原始幼稚細(xì)胞的百分比，采用DI-60對外周血涂片進(jìn)行白細(xì)胞分類，計(jì)數(shù)100個(gè)白細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的百分比，對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行決定系數(shù)(R2)線性分析，對比自動(dòng)推片和人工推片的一致性分類結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用線性相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅細(xì)胞系統(tǒng)推片質(zhì)量比較自動(dòng)推片組單層長度為(0.87±0.37)cm，顯著高于手工推片組的(0.51±0.33)cm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.99，P<0.01)。自動(dòng)推片組的單層細(xì)胞合格率為80%，顯著高于手工推片組的42%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=18.37，P<0.01)。

2.2 紅細(xì)胞數(shù)量比較兩種推片方式制備的樣本分別在DI-60外周血涂片分析功能進(jìn)行數(shù)字化分析及人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析，統(tǒng)計(jì)兩組的不重疊紅細(xì)胞數(shù)量，自動(dòng)推片組紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(1116±222)個(gè)，顯著多于手工推片組(787±392)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.57，P<0.01)。

2.3 人工顯微鏡鏡檢和數(shù)字化細(xì)胞形態(tài)閱片儀白細(xì)胞分類線性相關(guān)分析選取血液科貧血且白細(xì)胞分類異常含有幼稚細(xì)胞的45份樣本以及白細(xì)胞分類正常的55份樣本，用兩種推片方式制備的樣本分別在人工顯微鏡鏡檢和DI-60外周血涂片分析功能進(jìn)行白細(xì)胞分類(圖1)，自動(dòng)推片組中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及原始幼稚細(xì)胞的數(shù)字化細(xì)胞形態(tài)閱片儀與人工顯微鏡鏡檢白細(xì)胞分類結(jié)果相關(guān)性更高(P<0.05)，見表3。

圖1 推片機(jī)SP-10制片與手工制片白細(xì)胞分類結(jié)果對比圖 a：SP-10；b：手工

表3 DI-60分類與人工顯微鏡分類線性相關(guān)分析(r)

3 討論

DI-60中通過外周血推片質(zhì)量分析軟件SmearChecker，可以用來檢測外周血推片染色酸堿度、染色強(qiáng)度及單層細(xì)胞層長度。當(dāng)細(xì)胞單層區(qū)域較小時(shí)，為了計(jì)數(shù)夠100個(gè)白細(xì)胞用于臨床診斷，定位在非單層區(qū)域的白細(xì)胞可能受到擠壓導(dǎo)致形態(tài)的改變，嚴(yán)重時(shí)可能發(fā)生重疊，導(dǎo)致增大細(xì)胞形態(tài)識別的難度，降低細(xì)胞分類的準(zhǔn)確性[6]。本研究結(jié)果表明，自動(dòng)推片機(jī)SP-10制備的樣本，與手工推片組比較，其單層細(xì)胞層長度平均值更大、合格率更高，說明對于貧血樣本自動(dòng)推片的方法更能得到推片質(zhì)量穩(wěn)定的樣本。無論的是采取數(shù)字化細(xì)胞形態(tài)閱片儀閱片，還是人工顯微鏡鏡檢閱片，檢驗(yàn)單層細(xì)胞的長短就是判定一張血片的合格與否的重要指標(biāo)[6，7]。

DI-60外周血涂片分析功能具有掃描紅細(xì)胞概覽圖的功能，過多的紅細(xì)胞重疊，紅細(xì)胞形態(tài)無法得到準(zhǔn)確的分析。本研究結(jié)果表明，在同樣數(shù)量的視野下，自動(dòng)推片機(jī)SP-10制備的樣本，與手工推片組比較，其紅細(xì)胞概覽圖中不重疊的紅細(xì)胞數(shù)量更多，說明對于貧血樣本自動(dòng)推片的方法可以制備更高質(zhì)量的紅細(xì)胞單細(xì)胞層，與曾素根等[7]結(jié)論一致。

目前，人工顯微鏡鏡檢作為外周血白細(xì)胞分類的金標(biāo)準(zhǔn)，其主要是通過人工找尋血推片體尾交界處單細(xì)胞層，人工計(jì)數(shù)100個(gè)白細(xì)胞進(jìn)行分類；然而，數(shù)字化細(xì)胞形態(tài)閱片儀的出現(xiàn)，是通過模擬人工顯微鏡鏡檢的方式，首先在血推片體尾交界處尋找單細(xì)胞層，然后定位找尋目標(biāo)數(shù)量的白細(xì)胞。

閱片機(jī)計(jì)數(shù)可以設(shè)置100個(gè)白細(xì)胞或更多數(shù)量，如200個(gè)或300個(gè)白細(xì)胞。其全自動(dòng)細(xì)胞形態(tài)分析系統(tǒng)，具有10倍、50倍或100倍的放大倍數(shù)的顯微鏡，其彩色攝像頭,可獲得最佳的圖像質(zhì)量和高速的圖像采集，最終通過DI-60細(xì)胞形態(tài)分析軟件進(jìn)行對細(xì)胞類別進(jìn)行分析[8，9]。其分類的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞及原始幼稚細(xì)胞的相關(guān)性均有相對的提升，說明自動(dòng)推片法制備的樣本，具有高質(zhì)量、穩(wěn)定的單細(xì)胞層區(qū)域，更有利于外周血白細(xì)胞分類的準(zhǔn)確性與邢瑩等[10，11]結(jié)果一致。之后通過人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行預(yù)分類，臨床檢驗(yàn)技師在電腦顯示器上進(jìn)行審核結(jié)果。

綜上，針對貧血患者的血液涂片分析，經(jīng)自動(dòng)推片法制備的血涂片結(jié)果，其單層細(xì)胞層區(qū)域評價(jià)更優(yōu)、紅細(xì)胞單層細(xì)胞層數(shù)量及白細(xì)胞分類結(jié)果與人工顯微鏡鏡檢的吻合度更高，故優(yōu)于手工推片制備的血涂片。根據(jù)本研究的經(jīng)驗(yàn)表明，貧血樣本血液粘稠度較清，手工推片更加難以掌握其推片的角度和力度，也更加耗時(shí)費(fèi)力，且制作的血片差異很大質(zhì)量穩(wěn)定性不強(qiáng)[12]。因此，在以后的標(biāo)準(zhǔn)化管理中通過使用自動(dòng)推片法推片染色后經(jīng)DI-60的閱片人工復(fù)核后所得到的結(jié)果更加準(zhǔn)確、穩(wěn)定且高效。