舒洛地特對膜性腎病大鼠腎組織中podocin、nephrin表達的影響

吝娜 曹磊 王保興

膜性腎病(MN)是成人腎病綜合征的常見病因,約占我國原發(fā)性腎病綜合征的20%[1]，其病理基礎主要為腎小球足細胞損傷[2]。MN發(fā)病率估計每年約為12/1 000 000[3],且有1/3患者進展為終末期腎病[4],給家庭和社會帶來沉重的負擔。MN患者處于高凝狀態(tài)[5]。舒洛地特是一種葡萄糖胺聚糖[6]，為肝素類物質,早期主要作為抗血栓藥物應用于臨床。曾有報道稱舒洛地特可輔助治療MN，但具體機制不明[7]。本研究應用舒洛地特干預MN大鼠，觀察MN大鼠腎小球podocin、nephrin的表達變化，從而探討舒洛地特治療MN的干預靶點。

材料與方法

1.材料：實驗動物及藥物：清潔級健康雄性SD大鼠40只，體質量160±20 g，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。舒洛地特膠囊(意大利阿爾法韋氏曼制藥公司)。試劑：牛血清白蛋白(C-BSA第V組分，北京索萊寶科技有限公司)；無水乙二胺(EDA)、碳化二亞胺(EDC，上海阿拉丁試劑有限公司)；弗式不完全佐劑(美國sigma公司)；兔兩步法免疫組化試劑盒、二胺基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京中杉金橋公司)；兔抗大鼠nephrin多克隆抗體(美國bioworld生物科技有限公司)；兔抗大鼠podocin多克隆抗體(武漢博士德生物公司)。儀器：透析袋(北京索萊寶科技有限公司)；真空冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司LGJ-10)；蛋白尿(24 h)分光光度計(gohnson-gohnson巴西強生公司)；脫水機、包埋機(德國LEICA TP 1020)；石蠟切片機(德國LEICA RM 2255)；烤片機(上海智城分析儀器制造有限公司)；切片漂烘溫控儀(安徽電子科學研究所)；恒溫水浴箱(北京西城區(qū)醫(yī)療機械廠)；低溫冰箱(青島海爾集團有限公司)；超低溫冰箱(日本SANYO公司)；病理圖像分析儀(麥克奧迪圖像分析系統(tǒng))；Olympus BX51光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；H-7500透射電鏡(日本日立公司)。

2.方法

(1)模型制備及給藥方式：將40只清潔級雄性SD大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組(A組)、模型組(B組)、低劑量舒洛地特組(C組)、高劑量舒洛地特組(D組)，每組各10只。參照改良Border法[8]制成陽離子化C-BSA。將制備好的C-BSA分裝密封保存于-80 ℃冰箱內，注射前用pH為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)配制成溶液。取C-BSA 1 mg溶于0.5 mlPBS中，與等量不完全弗式佐劑充分混合乳化，除A組 外，其他3組大鼠均于雙前肢腋下及腹股溝做多點皮下注射進行預免疫。預免疫1周后，開始正式免疫，取C-BSA 2.5 mg，溶于1 ml PBS中，B組、C組、D組大鼠均隔日尾靜脈注射，連續(xù)4周。A組大鼠隔日尾靜脈注射等體積的生理鹽水。MN模型制備成功的標準為大量蛋白尿，腎小球基底膜增厚，上皮下電子致密物沉積，足細胞足突融合。造模成功后，C組和D組每只大鼠分別按照舒洛地特10 mg/kg、20 mg/kg劑量溶于生理鹽水配成溶液灌胃，A、B組于C、D組正式免疫結束后同一天起，每日每只大鼠給予相同劑量生理鹽水灌胃，4組灌胃均連續(xù)4周。實驗期間動物自由進食、飲水，給予普通鼠飼料(河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供)喂養(yǎng)，室溫23 ℃左右，相對濕度40%～50%。最終B組大鼠死亡3只，剩余7只；余各組大鼠均為10只。

(2)24 h尿蛋白定量檢測：各組大鼠分別于造模前、后及藥物干預4周后應用代謝籠收集24 h尿液并記錄尿量，用干化學法檢測24小時尿蛋白定量。

(3)光鏡、電鏡檢查:應用10%水合氯醛按0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉大鼠，隨后立即開腹解剖出雙腎，去掉包膜，取腎上極皮質的腎組織在光鏡和電鏡下觀察。光鏡：腎組織固定于10%中性福爾馬林固定液中(固定液與組織塊體積比>20∶1)，乙醇梯度脫水，石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅(HE)、過碘酸雪夫染色(PAS)、Masson 染色后在光鏡下觀察。電鏡：腎組織固定于4%戊二醛中，用1%鋨酸磷酸鈉緩沖液固定，丙酮梯度脫水，常規(guī)包埋、聚合、切片，采用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色，應用投射電鏡觀察腎小球基底膜、足突等的變化情況，并照相記錄。

(4)免疫組化檢測大鼠腎組織podocin、nephrin表達:腎組織固定、脫水、包埋切片、DAB顯色，每張切片在腎皮質范圍內隨機選取10個腎小球(×400)，計算單位面積陽性染色區(qū)域平均積分光密度(IOD)，對各組均值比較，以圖像半定量分析對腎小球足細胞podocin、nephrin的陽性面積與著色強度進行綜合評價。

結 果

1.4組大鼠24 h尿蛋白定量比較：造模結束后檢測造模大鼠尿蛋白，顯示大量蛋白尿；隨機抽取2只大鼠進行腎組織光鏡、電鏡檢查，觀察到腎小球基底膜增厚，上皮下電子致密物沉積，足細胞足突融合，證實MN造模成功。造模后，與A組比較，B、C、D組大鼠24 h尿蛋白定量均顯著升高(P<0.05)。治療后，C、D組大鼠24 h尿蛋白定量較同組造模后及B組同期均降低(P<0.05)；D組24 h尿蛋白定量較C組同期顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠24 h尿蛋白定量比較

2.4組大鼠腎組織病理形態(tài)學觀察：光鏡下，A組大鼠腎小球形態(tài)基本正常，毛細血管袢開放良好，無固有細胞增多，無基底膜增厚；B組大鼠腎小球固有細胞增多，基底膜明顯增厚；C、D組大鼠腎小球固有細胞輕度增多，基底膜增厚較B組減輕。電鏡下，A組大鼠足細胞結構清晰，足突排列整齊；B組大鼠腎小球基底膜彌漫增厚，上皮下電子致密物沉積，足細胞足突廣泛融合或消失；C組大鼠腎小球基底膜不規(guī)則增厚，上皮下電子致密物沉積，足突部分融合；D組大鼠基底膜輕度增厚，上皮下少量電子致密物沉積，足突部分融合。見圖1(圖1A～P)。

3.4組大鼠腎組織中podocin、nephrin IOD比較：從免疫組化染色中可觀察到podocin、nephrin兩種蛋白表達于腎小球上皮下。與A組比較，B、C、D組大鼠podocin、nephrin IOD均降低；與B組比較，C、D組大鼠podocin、nephrin IOD均升高；與C組比較，D組大鼠podocin、nephrin IOD明顯升高(P<0.05)。見表2、圖1(1Q～X)。

圖1 4組大鼠腎臟組織病理染色及免疫組化結果(A、E、I、M、Q、U：A組；B、F、J、N、R、V：B組；C、G、K、O、S、W：C組；D、H、L、P、T、X：D組；A、B、C、D：HE染色，×200；E、F、G、H：Masson染色，×400；I、J、K、L：PAS染色，×400；N：電鏡，×25 000；M、O、P：電鏡，×20 000；Q、R、S、T：podocin免疫組化染色，×200；U、V、W、X：nephrin免疫組化染色，×200)

表2 4組大鼠腎組織中podocin、nephrin IOD比較

討 論

MN臨床上常表現(xiàn)為腎病綜合征或無癥狀蛋白尿,部分患者有高血壓、腎功能損害[9]。在形態(tài)學上，本病的特點是上皮下免疫復合物沉積，含有免疫球蛋白(Ig)G和補體，足細胞足突融合消失，腎小球基底膜(GBM)增厚[10-11]。其腎小球病變可分為4個階段，第1階段的特點是上皮下存在少量免疫復合物沉積，GBM光鏡下觀察可能出現(xiàn)正?；蛏栽龊瘢坏?階段可見“釘突”形成；第3階段，免疫復合物嵌入 GBM；第4階段，GBM不規(guī)則增厚，免疫復合物重吸收[12]。

MN是一種自身免疫性足細胞病[13]。雖然MN是免疫復合物介導的疾病,但其腎組織病變主要集中在腎小球臟層上皮細胞,即足細胞。足細胞在腎小球基底膜上的穩(wěn)定附著和功能發(fā)揮依賴于一組足細胞相關蛋白維持，根據(jù)其在足細胞分布和功能不同,可將其分為裂孔膜蛋白、頂膜區(qū)蛋白、基底膜區(qū)蛋白和細胞骨架蛋白。 裂孔膜蛋白包括 nephrin、podocin、CD2AP 等[14],其中 nephrin 是裂孔膜的關鍵組成。nephrin 作為裂孔膜的關鍵組成，能通過介導上皮細胞與基質相互作用來影響 GBM 的通透性和基質的沉積，從而影響腎臟濾過膜結構與屏障功能的完整性[15]。有研究表明，nephrin mRNA和蛋白表達降低可導致裂孔隔膜功能受損,從而導致大量蛋白尿[16]。也有研究表明，nephrin基因敲除小鼠出生時即表現(xiàn)為大量的蛋白尿,出生后不久即死亡[17]。Podocin 編碼基因 NPHS2 敲除小鼠出生前即表現(xiàn)為蛋白尿，出生后數(shù)天死亡，電鏡可觀察足突廣泛融合，裂孔膜消失[18]。MN中可觀察到podocin蛋白表達下調，足細胞損傷和nephrin、podocin蛋白在腎小球的表達下降與蛋白尿的發(fā)生及發(fā)展密切相關[19]。足細胞損傷程度越大，nephrin和podocin蛋白表達下調越多，足細胞之間裂孔膜的結構破壞越嚴重，導致蛋白尿產(chǎn)生。大鼠MN模型早期nephrin、podocin表達減少可能使足細胞裂孔膜結構的完整性受損，腎小球濾過屏障破壞，從而導致蛋白尿[20]。

本實驗給予大鼠尾靜脈注射C-BSA進行模型復制，造模完成后出現(xiàn)大量蛋白尿，腎小球固有細胞明顯增多，基底膜增厚，上皮下大量電子致密物沉積，足細胞足突廣泛融合或消失等MN特征。經(jīng)舒洛地特干預后MN大鼠蛋白尿明顯減少，可見舒洛地特可改善MN大鼠大量蛋白尿癥狀。本實驗病理結果亦顯示經(jīng)舒洛地特治療的各組大鼠腎小球固有細胞較少，毛細血管基底膜增厚較輕、免疫復合物沉積較少、足細胞損傷較輕，結果提示舒洛地特對MN大鼠腎小球的病理形態(tài)有改善作用。免疫組化結果表明，MN大鼠腎組織中nephrin和podocin蛋白表達量減少，表明在MN大鼠中足細胞有明顯的損傷。經(jīng)舒洛地特干預后大鼠腎組織nephrin和podocin蛋白表達有不同水平的上調，表明舒洛地特可改變MN大鼠足細胞骨架相關蛋白表達，進而改善足細胞結構損傷，且有劑量依賴性。

綜上所述，舒洛地特對MN具有治療作用，同時具有劑量依賴性，其可通過上調MN大鼠腎組織nephrin和podocin蛋白的表達水平，進而改善足細胞損傷、維持足細胞功能、減少蛋白尿。這可能是其治療MN的作用機制之一。