百里香酚對(duì)魚源耐藥性維氏氣單胞菌的體外抑菌效果及其機(jī)制研究

吳玉如，梁天雨，梁 超，譚媛元，柳 源，潘星羽，黃小麗，陳德芳，耿 毅，歐陽萍，*

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) a.動(dòng)物醫(yī)學(xué)院；b.動(dòng)物科技學(xué)院，四川 成都 611130)

傳統(tǒng)中草藥具有天然的抗菌活性，并且具有殘留少、毒副作用小、安全性高、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，近年來逐漸成為替代抗生素的研究熱點(diǎn)。但中草藥的成分相對(duì)復(fù)雜，抑菌機(jī)制也具有多重性。因此，有必要深入研究不同中藥成分的抑菌作用及其作用機(jī)制。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，中草藥活性成分的抑菌機(jī)制主要表現(xiàn)為對(duì)細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)、遺傳物質(zhì)和呼吸代謝的影響。研究人員可以借助電子顯微鏡觀察中藥及其有效成分對(duì)細(xì)菌超微結(jié)構(gòu)的影響；將堿性磷酸酶用作判定細(xì)菌細(xì)胞壁完整性的指標(biāo)；通過細(xì)胞膜流動(dòng)性、通透性、結(jié)構(gòu)的變化和內(nèi)容物外流來檢測細(xì)胞膜的變化。

百里香酚(5-甲基-2-異丙基酚)，又名麝香草酚，是芳香植物精油的主要成分，具有廣譜抑菌作用，對(duì)革蘭氏陰性菌(大腸埃希菌、沙門氏菌等)和革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等)都具有良好的抑制作用，可以替代抗生素或與其聯(lián)合使用。作者團(tuán)隊(duì)前期研究證實(shí)，百里香酚對(duì)魚源耐藥性維氏氣單胞菌具有較好的抑菌作用，但是其抑菌機(jī)制尚不清楚。本研究擬探析百里香酚對(duì)維氏氣單胞菌的抑菌機(jī)制，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株和主要試劑

維氏氣單胞菌SC株分離自瀕死黃顙魚()，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水生動(dòng)物疾病研究中心鑒定保存。

百里香酚(色譜純，純度>98%，CAS No.89-83-8)，購于上海展云化工有限公司，溶于二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma-Aldrich)，制成質(zhì)量濃度為40.96 mg·mL的原液備用。LB肉湯和LB營養(yǎng)瓊脂購于青島海博生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片購于杭州微生物試劑有限公司；乳酸脫氫酶測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 維氏氣單胞菌的藥物敏感性檢測

采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)，參照抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)[美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)制定，2017年版]進(jìn)行試驗(yàn)。用無菌棉簽蘸取對(duì)數(shù)期的維氏氣單胞菌菌液(1×10CFU·mL)均勻涂布于LB營養(yǎng)瓊脂平板，待培養(yǎng)基表面干燥后，在超凈工作臺(tái)用無菌鑷子分別放置直徑6 mm的慶大霉素(gentamicin，GN)、阿奇霉素(azithromycin，AZM)、頭孢克洛(cefaclor，CEC)、頭孢噻肟(cefotaxime，CTX)、恩諾沙星(enrofloxacin，ENR)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin，CIP)、多黏菌素B(polymyxinB，PB)、復(fù)方新諾明(compound sulfamethoxazole，CO SMZ)、磺胺異惡唑(sulfisoxazole，SIZ)、氟苯尼考(florfenicol，F(xiàn)FC)、美羅培南(meropenem，MEM)、四環(huán)素(tetracycline，TE)藥敏紙片，保持紙片間距離相等并做好標(biāo)記。將平板放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測定并記錄抑菌圈大小，根據(jù)CLSI 2017的標(biāo)準(zhǔn)判斷維氏氣單胞菌的藥物敏感性。

1.3 百里香酚對(duì)維氏氣單胞菌的抑菌活性

采用微量倍比稀釋法測定百里香酚對(duì)維氏氣單胞菌的最低抑菌濃度(MIC)。在96孔板中，對(duì)百里香酚進(jìn)行連續(xù)2倍稀釋，使其終濃度分別為1 024、512、256、128、64、32、16 μg·mL，另向每個(gè)孔加入1×10CFU·mL的菌液5 μL，以只加入菌液的孔作為陽性對(duì)照組，以加入DMSO的為陰性對(duì)照組，以加入LB液體培養(yǎng)基的為空白對(duì)照組。在28 ℃、150 r·min條件下于氣浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)24 h，觀察每個(gè)孔的澄清度，以肉眼觀察的無菌生長孔的百里香酚最低濃度為MIC值。

采用平板計(jì)數(shù)法測定百里香酚對(duì)維氏氣單胞菌的最低殺菌濃度(MBC)。取肉眼觀察的各澄清孔中溶液各30 μL，分別加入LB平板，均勻涂布，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌落數(shù)，以生長菌落數(shù)不大于5的對(duì)應(yīng)孔中的百里香酚濃度為MBC。

將維氏氣單胞菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、150 r·min條件下于氣浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)24 h。用新鮮LB培養(yǎng)液稀釋菌液至=0.3，分裝于200 mL錐形瓶中，加入百里香酚，使培養(yǎng)基中百里香酚的質(zhì)量濃度分別為0、32、64、128、256、512 μg·mL。將其置于氣浴恒溫振蕩器中，在28 ℃、150 r·min條件下培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)0、1、2、4、6、8、12、20、24 h時(shí)，取100 μL菌液加入96孔板，在Varioskan Flash全波長多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific)下測定其值，繪制維氏氣單胞菌的生長曲線。

1.4 百里香酚對(duì)維氏氣單胞菌膜通透性的影響

取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(=1.0)的維氏氣單胞菌懸液，加入質(zhì)量濃度為512 μg·mL的百里香酚，置于氣浴恒溫振蕩器中，在28 ℃、150 r·min條件下培養(yǎng)，分別于0、1、2、4、6、8 h取菌液1 mL，4 500 r·min離心10 min后，用無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS，pH=7.4)重復(fù)洗滌3次，收集下層沉淀，重懸于1 mL的無菌PBS中，再加入40 mL 5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))無菌葡萄糖溶液，測定其電導(dǎo)率。對(duì)照組加入等體積的DMSO。

1.5 百里香酚對(duì)維氏氣單胞菌可溶性蛋白的影響

取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(=1.0)的維氏氣單胞菌懸液，加入質(zhì)量濃度為512 μg·mL的百里香酚，置于氣浴恒溫振蕩器中，在28 ℃、150 r·min條件下培養(yǎng)，分別于4、8、16、24 h取菌液1 mL，于4 500 r·min離心10 min，用無菌PBS洗滌3次并重懸，用超聲破碎儀裂解菌體，4 500 r·min離心10 min后，收集上清液。取40 μL上清液與10 μL的5×蛋白上樣緩沖液混勻，煮沸10 min。取混合上清液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳完畢后，使用考馬斯亮藍(lán)R250對(duì)膠染色過夜，煮沸洗脫染色劑，在Universal Hood Ⅱ全功能凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD)中成像。對(duì)照組加入等體積的DMSO。

1.6 百里香酚對(duì)維氏氣單胞菌乳酸脫氫酶活性的影響

向培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(=1.0)的菌液中加入質(zhì)量濃度為512 μg·mL的百里香酚，分別于0、2、4、6、8 h取菌液1 mL，4 500 r·min離心10 min后倒去上清液，收集下層沉淀，用無菌PBS洗滌3次，重懸后用超聲破碎儀對(duì)菌體進(jìn)行破碎，按照乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所)的要求操作。對(duì)照組加入等體積的DMSO。

1.7 百里香酚對(duì)維氏氣單胞菌DNA外滲量的影響

向培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(=1.0)的維氏氣單胞菌懸液中加入質(zhì)量濃度為512 μg·mL的百里香酚，置于氣浴恒溫振蕩器中，在28 ℃、150 r·min條件下培養(yǎng)，分別于0、1、2、4、6、8 h取菌液1 mL，于4 500 r·min離心10 min收集沉淀，用無菌PBS洗滌3次并重懸，取2 μL菌液用NanoDrop OneC超微量紫外分光光度計(jì)(美國Thermo Scientific)測定菌液中的DNA含量。對(duì)照組加入等體積的DMSO。

1.8 百里香酚對(duì)維氏氣單胞菌DNA的影響(染色分析)

向培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(=1.0)的維氏氣單胞菌懸液加入512 μg·mL的百里香酚，置于氣浴恒溫振蕩器中，在28 ℃、150 r·min條件下培養(yǎng)，分別于0、2、4、8 h取菌液1 mL，用無菌PBS洗滌3次，于4 500 r·min離心10 min收集沉淀，加入2.5%(體積分?jǐn)?shù))的戊二醛1 mL重懸，靜置10 min后于4 500 r·min離心10 min，收集菌體，再用1 mL無菌PBS重懸。取100 μL菌液加入等量的4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，10 μg·mL)染料，避光靜置反應(yīng)10 min，4 500 r·min離心10 min，收集下層沉淀，并用200 μL無菌PBS洗滌3次，去除殘余的DAPI染料，取5 μL重懸后的菌液加在無菌載玻片上，在BX53熒光顯微鏡(日本Olympus)下觀察菌體。

1.9 百里香酚對(duì)維氏氣單胞菌菌體形態(tài)的影響

將維氏氣單胞菌在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期(=1.0)，加入512 μg·mL的百里香酚，培養(yǎng)4 h后，取菌液1 mL，于4 500 r·min離心10 min，收集下層沉淀，用PBS洗滌菌體3次，然后在4 ℃條件下重懸于2.5%(體積分?jǐn)?shù))的戊二醛，在Inspect掃描電子顯微鏡(SEM)(美國Thermo Scientific)下進(jìn)行觀察分析。將維氏氣單胞菌與百里香酚共培養(yǎng)8、16 h后在透射電子顯微鏡(TEM)下進(jìn)行觀察分析，樣品制備參照文獻(xiàn)[20]的方法進(jìn)行。對(duì)照組加入等體積的DMSO。

1.10 數(shù)據(jù)分析

各指標(biāo)在測定時(shí)，均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，取平均值。使用Prism 8.0軟件對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和檢驗(yàn)，以<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 維氏氣單胞菌SC株的耐藥性

根據(jù)CLSI 2017的藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)，維氏氣單胞菌SC株對(duì)氯霉素類的氟苯尼考和喹諾酮類的環(huán)丙沙星和恩諾沙星耐藥，對(duì)-內(nèi)酰胺類的頭孢克洛、頭孢噻肟和多黏菌素類的多黏菌素B敏感，對(duì)慶大霉素、美羅培南、四環(huán)素、阿奇霉素和復(fù)方新諾明中介(表1)。

表1 維氏氣單胞菌SC株的耐藥性

2.2 百里香酚對(duì)維氏氣單胞菌SC株的體外抑菌活性

經(jīng)測定，百里香酚對(duì)維氏氣單胞菌SC株的MIC為256 μg·mL，MBC為512 μg·mL(圖1)。當(dāng)百里香酚的質(zhì)量濃度達(dá)到或超過256 μg·mL時(shí)，菌液的值在24 h內(nèi)趨近于0，表明此時(shí)百里香酚完全抑制維氏氣單胞菌SC株的生長；當(dāng)百里香酚的質(zhì)量濃度低于MIC時(shí)，雖然對(duì)細(xì)菌的生長有一定的影響，但菌液的值與對(duì)照組相差不大。

圖1 不同質(zhì)量濃度的百里香酚對(duì)維氏氣單胞菌SC株生長的影響

2.3 百里香酚對(duì)維氏氣單胞菌SC株菌體膜通透性的影響

將維氏氣單胞菌SC株與百里香酚共培養(yǎng)，通過測量菌懸液電導(dǎo)率的變化推斷膜通透性的改變。添加512 μg·mL的百里香酚后，菌液電導(dǎo)率迅速增加，在6 h時(shí)達(dá)到最大值，并在8 h內(nèi)一直保持較高的電導(dǎo)率，且始終與對(duì)照組差異極顯著(<0.01)(圖2)。上述結(jié)果表明，百里香酚能增大維氏氣單胞菌SC株細(xì)胞膜的通透性。

“**”表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

2.4 百里香酚對(duì)維氏氣單胞菌SC株可溶性蛋白的影響

用SDS-PAGE測定百里香酚對(duì)維氏氣單胞菌可溶性蛋白的影響(圖3)：對(duì)照組中，菌體蛋白泳道(泳道1、3、5、7)隨著時(shí)間延長，條帶逐漸增多并變深；試驗(yàn)組(添加512 μg·mL的百里香酚)菌體蛋白泳道(泳道2、4、6、8)隨著時(shí)間延長，蛋白條帶數(shù)量減少，顏色變淺，與對(duì)照組相比，某些蛋白條帶(15～20 ku)甚至消失。

M代表Marker(蛋白質(zhì)量標(biāo)記)，泳道1、3、5、7分別對(duì)應(yīng)于對(duì)照組4、8、16、24 h的菌體蛋白，泳道2、4、6、8分別對(duì)應(yīng)于添加百里香酚(512 μg·mL-1)處理組4、8、16、24 h的菌體蛋白。

2.5 百里香酚對(duì)維氏氣單胞菌SC株乳酸脫氫酶活性的影響

添加512 μg·mL的百里香酚后，菌液的乳酸脫氫酶活性與對(duì)照組相比極顯著(<0.01)降低(圖4)，并表現(xiàn)出時(shí)間依賴性，在2、4、6、8 h分別降低了(32.8±0.7)%、(46.2%±0.3)%、(46.1±1.6)%、(60.0±1.0)%，而對(duì)照組的乳酸脫氫酶活性始終維持在較高水平。

圖4 百里香酚(512 μg·mL-1)對(duì)維氏氣單胞菌SC株乳酸脫氫酶(LDH)活性的影響

2.6 百里香酚對(duì)維氏氣單胞菌SC株DNA外滲量的影響

DNA本身為大分子物質(zhì)，正常情況下不會(huì)穿透完整的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁。對(duì)照組菌液的DNA含量在0～8 h維持不變(圖5)。加入512 μg·mL的百里香酚1 h后，菌液DNA含量迅速上升到(115.6±0.5)mg·L，并在8 h內(nèi)穩(wěn)定在110～120 mg·L，且始終與對(duì)照組差異極顯著(<0.01)。這說明，百里香酚可以破壞維氏氣單胞菌SC株細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致DNA等大分子外滲。

圖5 百里香酚(512 μg·mL-1)對(duì)維氏氣單胞菌SC株DNA外滲量的影響

2.7 百里香酚對(duì)維氏氣單胞菌SC株DNA的影響

DAPI可以透過完整的細(xì)菌細(xì)胞膜與DNA結(jié)合，并在特定的熒光條件下顯現(xiàn)出熒光，且熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比。對(duì)試驗(yàn)組(添加512 μg·mL的百里香酚)和對(duì)照組2、4、8 h的菌液進(jìn)行DAPI染色觀察，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度和密度明顯低于對(duì)照組，且熒光強(qiáng)度隨著處理時(shí)間的延長而降低(圖6)。

A，對(duì)照組(0 h)；B～D，分別對(duì)應(yīng)于百里香酚(512 μg·mL-1)處理2、4、8 h。

2.8 百里香酚對(duì)維氏氣單胞菌SC株形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

用SEM觀察維氏氣單胞菌SC株的超微結(jié)構(gòu)：對(duì)照組的細(xì)胞完整清晰(圖7)；百里香酚(512 μg·mL)處理4 h后，菌體表面明顯出現(xiàn)塌陷、溶解和壞死。

A～B，掃描電鏡(SEM)觀察結(jié)果；C～F，透射電鏡(TEM)觀察結(jié)果。A，對(duì)照組，4 h；B，百里香酚(512 μg·mL-1)處理4 h，箭頭指示菌體表面溶解塌陷；C，對(duì)照組，8 h；D，百里香酚(512 μg·mL-1)處理8 h，箭頭指示細(xì)胞染色不均，并開始出現(xiàn)空泡化；E，對(duì)照組，16 h；F，百里香酚(512 μg·mL-1)處理16 h，箭頭指示細(xì)胞膜與細(xì)胞壁分離，細(xì)胞皺縮壞死。

TEM觀察可見：對(duì)照組細(xì)菌結(jié)構(gòu)完整，生長、分裂正常；經(jīng)百里香酚(512 μg·mL)處理后，細(xì)菌皺縮變形，細(xì)胞膜和細(xì)胞壁分離，由于細(xì)胞膜破損引起內(nèi)容物流出，菌體內(nèi)染色不均，甚至出現(xiàn)空泡化，且隨著藥物作用時(shí)間延長，呈現(xiàn)空泡化的細(xì)胞數(shù)量增多。

3 討論

本研究對(duì)臨床分離到的魚源維氏氣單胞菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖常用抗生素中的氟苯尼考和恩諾沙星耐藥，對(duì)慶大霉素中介。呂觀等的研究結(jié)果顯示，32株維氏氣單胞菌對(duì)恩諾沙星的耐藥率達(dá)到100%；林煜等發(fā)現(xiàn)，大刺鰍源維氏氣單胞菌對(duì)氟苯尼考和恩諾沙星等12種抗生素表現(xiàn)出耐藥性。雖然來源于不同地區(qū)和宿主的維氏氣單胞菌的耐藥性存在一定差異，但對(duì)氟苯尼考和恩諾沙星都表現(xiàn)出較高的耐受性。本試驗(yàn)證實(shí)了百里香酚對(duì)耐藥性維氏氣單胞菌的體外抑菌活性，初步明確了其作用機(jī)制，可以為基于百里香酚的新型抗菌藥物的研發(fā)提供理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)。

百里香酚能抑制耐藥性維氏氣單胞菌SC株的生長，其MIC和MBC分別為256 μg·mL和512 μg·mL。生長曲線測定結(jié)果表明：當(dāng)藥物濃度達(dá)到MIC時(shí)，就可以完全抑制維氏氣單胞菌的生長；但在亞抑菌濃度下百里香酚對(duì)維氏氣單胞菌的生長無明顯抑制作用。因此，在生產(chǎn)中可以考慮采用與抗生素聯(lián)合使用的方法提高百里香酚的抑菌效果，并降低其使用量。此外，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，百里香酚作為飼料添加劑喂養(yǎng)動(dòng)物和魚，還可以提高宿主的免疫力，增強(qiáng)其對(duì)病原菌的抵抗能力。

細(xì)菌菌體細(xì)胞膜具有選擇通過性，可以穩(wěn)定細(xì)菌的內(nèi)部環(huán)境，屏蔽外界環(huán)境對(duì)細(xì)菌的影響。當(dāng)細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性受到破壞時(shí)，細(xì)胞膜的選擇性下降，細(xì)胞內(nèi)容物流出，導(dǎo)致菌液的電導(dǎo)率增加。經(jīng)百里香酚處理后，維氏氣單胞菌菌液的電導(dǎo)率明顯升高，表明百里香酚可以增加細(xì)菌細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)電解質(zhì)的外流。孫茂關(guān)于百里香酚抗小鼠金黃色葡萄球菌肺炎的藥效學(xué)評(píng)價(jià)也表明，百里香酚可以改變細(xì)菌細(xì)胞膜通透性，導(dǎo)致內(nèi)容物流出，從而抑制細(xì)菌生長。

蛋白質(zhì)是機(jī)體生命活動(dòng)的基礎(chǔ)物質(zhì)，機(jī)體內(nèi)參與各種生命活動(dòng)調(diào)節(jié)的酶大多數(shù)都是蛋白質(zhì)。SDS-PAGE結(jié)果顯示，百里香酚對(duì)維氏氣單胞菌菌體的可溶性蛋白有抑制作用，并且這種抑制作用具有時(shí)間依賴性。維氏氣單胞菌可溶性蛋白含量的降低可能與其細(xì)胞膜通透性的改變相關(guān)，也可能是因?yàn)榘倮锵惴右种屏讼嚓P(guān)蛋白的生物合成，干擾了細(xì)菌的正常代謝，這與李振翼等和張猛等的研究結(jié)果相似。

乳酸脫氫酶可催化丙酮酸和乳酸的相互轉(zhuǎn)化，是細(xì)菌代謝過程中具有重要作用的蛋白酶。百里香酚明顯降低了維氏氣單胞菌的乳酸脫氫酶活性，指示細(xì)胞膜和細(xì)胞壁受到損傷。該結(jié)果與SDS-PAGE結(jié)果一致，表明百里香酚可通過抑制菌體可溶性蛋白的合成，從而影響細(xì)菌代謝和生長。

DNA是攜帶生物體遺傳信息的大分子，在存在完整細(xì)胞膜的情況下，不會(huì)通過生物膜；因此，菌液中的DNA含量亦可以反映細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性。DNA外滲量增加表明百里香酚破壞了維氏氣單胞菌細(xì)胞膜的完整性。有研究發(fā)現(xiàn)，百里香酚可以與金黃色葡萄球菌的DNA結(jié)合，改變其結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮抗菌作用。

DAPI是一種能與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料，能在不破壞細(xì)胞膜完整性的情況下進(jìn)入細(xì)胞，并與DNA特異性結(jié)合，在熒光顯微鏡下顯現(xiàn)熒光，且熒光強(qiáng)度與DNA含量呈正比。百里香酚處理的熒光強(qiáng)度低于對(duì)照組，推測百里香酚破壞了細(xì)胞膜的完整性，造成DNA外流，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度大大降低，這與DNA外滲量的測定結(jié)果一致。蔣加鵬等推測，百里香酚可能通過影響相關(guān)基因的表達(dá)來抑制細(xì)菌的正常生長，但是百里香酚干擾核酸合成的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

電鏡結(jié)果顯示，經(jīng)百里香酚處理后，維氏氣單胞菌菌體出現(xiàn)表面溶解塌陷、皺縮變形，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜分離，細(xì)胞質(zhì)丟失，內(nèi)部空化等現(xiàn)象，表明百里香酚會(huì)改變維氏氣單胞菌的結(jié)構(gòu)形態(tài)，破壞其細(xì)胞膜的完整性，與前述研究結(jié)論一致。

綜上，百里香酚通過破壞耐藥性維氏氣單胞菌菌體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞壁和細(xì)胞膜分離，增加細(xì)胞膜通透性，從而抑制細(xì)菌生長繁殖。由此判斷，百里香酚可以作為抑制耐藥性維氏氣單胞菌的潛在藥物進(jìn)行研發(fā)，但今后還需要進(jìn)一步開展動(dòng)物試驗(yàn)，對(duì)其安全性和有效性進(jìn)行深入研究。