西瓜細(xì)菌性果斑病菌現(xiàn)場快速雙模熒光RPA檢測方法的建立

王晨薇，汪小福，魏 巍，陳笑蕓，沈 潔，徐俊鋒，蔡 健

(1.阜陽師范大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021；3.寧夏醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004)

瓜類細(xì)菌性果斑病菌是一種傳播性強(qiáng)的細(xì)菌性種傳病害，它主要為害葫蘆科作物，如西瓜、甜瓜等。瓜類細(xì)菌性果斑病菌的病原為西瓜嗜酸菌(，Ac)，該病害于20世紀(jì)80年代在世界范圍內(nèi)爆發(fā)，并傳入我國，它主要由帶菌種子傳播，可使作物在幼苗期發(fā)病，發(fā)病時(shí)出現(xiàn)水漬狀病斑，并通過水源、昆蟲等快速侵染健康植株，使產(chǎn)量嚴(yán)重下降甚至死亡。目前尚未有可商業(yè)化的抗病品種出現(xiàn)，而我國又是瓜類種子(主要為西瓜、甜瓜)出口第一大國，因此，西瓜細(xì)菌性果斑病菌的檢測、鑒定尤為重要。

目前,常用的病害檢測方法有免疫檢測與分子生物學(xué)檢測。其中，免疫檢測包含酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和膠體金試紙法(colloidal gold immunochromatography assay，CICA)等，但是ELISA耗時(shí)較長，靈敏度與分子檢測方法相比略低，且特異性抗體的制備周期較長、較困難。膠體金試紙法耗時(shí)短，約為5～10 min，可用于現(xiàn)場快速檢測，但靈敏度不足，也無法滿足大批量樣品的病害檢測。分子生物學(xué)檢測特別是PCR技術(shù)是現(xiàn)今的主流檢測方法，但PCR檢測需要溫度梯度，循環(huán)時(shí)間較長。如趙子婧等利用微滴數(shù)字PCR對瓜類果斑病菌進(jìn)行檢測，靈敏度高，穩(wěn)定性較好，但成本較高，對儀器要求也很高。因此，目前無論是免疫檢測還是主流的PCR技術(shù)在瓜類果斑病菌的現(xiàn)場檢測方面都存在局限性，迫切需要建立可用于現(xiàn)場檢測果斑病的快速方法。

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(RPA)是2006年發(fā)明的新型等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，它可以在25～42 ℃恒溫條件下使核酸快速擴(kuò)增，形成單一的特異性產(chǎn)物，具有擴(kuò)增快、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。目前，RPA技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒等的檢測。Lee等利用RPA結(jié)合層析試紙條對番茄斑萎病毒進(jìn)行檢測，特異性良好，且靈敏度與實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)相當(dāng)。Kumar等研究發(fā)現(xiàn)，RPA可成功地用于大量樣品和體外產(chǎn)生的組織培養(yǎng)植物的檢測。Miao等使用側(cè)流試紙條對RPA擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行終點(diǎn)處的檢測。利用層析試紙條分析RPA檢測結(jié)果，一方面增加了實(shí)驗(yàn)成本，另一方面在檢測靈敏度上有所不足，在檢測過程中開蓋極可能造成污染。

本研究在普通RPA中引入熒光探針，根據(jù)熒光探針的特性，一方面利用熒光儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測RPA擴(kuò)增情況，另一方面在RPA擴(kuò)增終端，利用藍(lán)光照射進(jìn)行可視化分析，建立了2種模式的熒光RPA分析方式。在實(shí)際樣品的現(xiàn)場檢測中，利用NaOH簡化了DNA提取步驟，結(jié)合便攜式熒光監(jiān)測儀和藍(lán)光燈，實(shí)現(xiàn)對西瓜細(xì)菌性果斑病的現(xiàn)場快速雙模熒光檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

果斑病菌和6種葫蘆科植物常見致病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(表1)購自河北北納生物科技有限公司。實(shí)際檢測的10個(gè)西瓜品種(S1～S10)由寧波微萌種業(yè)有限公司提供。

表1 葫蘆科植物常見致病菌

1.1.2 試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)購自天根生化科技(北京)有限公司；RPA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒購自安普未來生物科技有限公司(濰坊)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與純化

基因組DNA提取按細(xì)菌DNA提取試劑盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)操作說明進(jìn)行。然后用NanoDrop 2000C核酸蛋白測定儀檢測DNA的提取效果，確保其濃度與純度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物與探針設(shè)計(jì)

參考瓜類細(xì)菌性果斑病檢測鑒定的國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 36822—2018)，利用普通PCR引物(表2)對瓜類果斑病菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物測序后進(jìn)行比對，確定其為核糖體RNA間隔區(qū)序列。然后以該特異性序列為模板，利用Vector NTI軟件分析選擇合適的引物與探針。設(shè)計(jì)探針時(shí)用四氫呋喃(tetrahydrofuran，THF)取代第126位堿基A，分別用熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)標(biāo)記THF位點(diǎn)兩側(cè)第124位堿基T和128位堿基T(圖1-A)。探針長度應(yīng)為46～52 bp，至少有30 bp位于THF位點(diǎn)5′端，另外至少15 bp位于其3′端。在探針的兩側(cè)分別設(shè)計(jì)4條正反向引物，長度約為30 bp，且引物與探針的重疊部分不能延伸至熒光/淬滅基團(tuán)的位置。為了避免引物-探針二聚體的出現(xiàn)，與探針方向相反的引物不應(yīng)當(dāng)有重疊。在重組酶的作用下，引物與互補(bǔ)序列識別，在單鏈結(jié)合蛋白(SSB)與Bsu聚合酶的共同作用下進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增(圖1-B)。當(dāng)探針與其互補(bǔ)序列結(jié)合時(shí)，THF被核酸外切酶切割，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離產(chǎn)生熒光信號(圖1-C)。具體RPA探針與引物設(shè)計(jì)原理見圖1，引物與探針序列見表2。引物與探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表2 探針與引物

A，引物與探針序列信息；B，RPA擴(kuò)增原理；C，RPA探針原理。

1.2.3 RPA反應(yīng)

參照RPA反應(yīng)試劑盒的說明書，反應(yīng)總體系為50 μL：Buffer A 12.5 μL，正、反向引物(10 nmol·L)各2 μL，探針(10 nmol·L)0.6 μL，模板DNA(60 ng·μL)2 μL，加HO至47.5 μL，充分混勻后加Buffer B 2.5 μL。RPA反應(yīng)條件：39 ℃擴(kuò)增20 min。RT-RPA的擴(kuò)增結(jié)果利用熒光儀器(CFX Connect熒光定量PCR儀，Bio-Rad，美國)每30 s進(jìn)行1次熒光信號收集；EP-RPA的擴(kuò)增結(jié)果利用手持藍(lán)光燈(LUYOR-3415RG，路陽儀器)照射并在黃色濾鏡下觀察。

qRT-PCR反應(yīng)體系參考國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 36822—2018)，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.4 引物篩查

共設(shè)計(jì)了4條正向引物、4條反向引物，首先用正向引物F1分別與所有反向引物組合，結(jié)合探針對病原物DNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RPA檢測，選擇擴(kuò)增效果最佳的一條反向引物，再將其與所有正向引物組合，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RPA檢測，選擇擴(kuò)增效率最高的組合作為最終的檢測引物組合。

1.2.5 RPA特異性實(shí)驗(yàn)

以瓜類細(xì)菌性果斑病菌和其他葫蘆科植物常見致病菌的基因組DNA作為模板，利用篩選到的最佳引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RPA檢測，以無菌水為空白對照。

1.2.6 RPA靈敏度實(shí)驗(yàn)

以初始濃度60 ng·μL的病原物DNA和初始濃度2.05×10CFU·mL的菌液為樣本進(jìn)行RPA靈敏度實(shí)驗(yàn)。將病原物DNA稀釋為8個(gè)梯度(60、60×5、60×5、60×5、60×5、60×5、60×5、60×5ng·μL)，以初始和稀釋后的所有DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RPA檢測；將陽性菌液稀釋為8個(gè)梯度(2.05×10、2.05×10、2.05×10、2.05×10、2.05×10、2.05×10、2.05×10、20.5 CFU·mL)后提取DNA，以其為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RPA檢測，均用蒸餾水為對照，并將結(jié)果與qRT-PCR檢測結(jié)果和藍(lán)光照射結(jié)果進(jìn)行對比。

1.2.7 實(shí)際樣品的現(xiàn)場快速檢測

將3～5粒西瓜種子放入500 μL裂解液(0.4 mol·LNaOH)中混勻浸泡2～5 min，取2 μL做為模板，利用建立好的RPA檢測體系，使用手持熒光恒溫?cái)U(kuò)增儀對實(shí)際西瓜樣本(S1～S10)進(jìn)行檢測，程序運(yùn)行結(jié)束后進(jìn)行可視化操作，在藍(lán)光照射下通過黃色濾鏡觀察，若為陽性可顯出熒光。將所得結(jié)果與qRT-PCR檢測結(jié)果進(jìn)行對比。具體操作流程見圖2。

A，將西瓜種子于裂解液中處理2～5 min，取2 μL浸出液作為模板進(jìn)行RPA擴(kuò)增；B，將八連管放入手持熒光恒溫?cái)U(kuò)增儀中，設(shè)置程序總運(yùn)行時(shí)間為25 min，10 min內(nèi)即可檢出；C，可視化操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩查結(jié)果

為篩選出最優(yōu)的引物對，共選用了7組引物組合，全部出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。圖3-A為上游引物F1與所有下游引物(R1、R2、R3、R4)組合的實(shí)時(shí)熒光RPA擴(kuò)增結(jié)果，F(xiàn)1/R2組合起峰最早，3 min左右起峰，且相對熒光強(qiáng)度最大，達(dá)到了2 500多，擴(kuò)增效果最好。因此，選用R2與所有上游引物(F1、F2、F3、F4)組合，擴(kuò)增結(jié)果見圖3-B，其中F3/R2組合，雖然起峰時(shí)間不是最早，但和其他引物對相比，起峰較快且熒光值最高，因此，選用F3/R2作為瓜類果斑病菌的實(shí)時(shí)熒光RPA擴(kuò)增引物。

A，上游引物F1與所有下游引物組合的擴(kuò)增結(jié)果；B，下游引物R2與所有上游引物組合的擴(kuò)增結(jié)果。

2.2 RPA特異性實(shí)驗(yàn)

為保證檢測方法的特異性，在引物與探針設(shè)計(jì)的時(shí)候參考了瓜類細(xì)菌性果斑病檢測鑒定國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 36822—2018)中的特異性序列，從而確保了擴(kuò)增區(qū)域的特異性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該方法在實(shí)際檢測中的特異性，對葫蘆科植物常見致病菌進(jìn)行了檢測分析。如圖4-A所示，只有Ac出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，其他葫蘆科常見致病菌未見擴(kuò)增，說明篩選出的引物與探針具有良好的特異性。熒光可視化分析結(jié)果與實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增結(jié)果一致，含有Ac的檢測管中有明亮的綠色熒光，其他檢測管中未見熒光(圖4-B)。

A，Ac與葫蘆科植物常見致病菌DNA擴(kuò)增結(jié)果；B，Ac與葫蘆科植物常見病原物擴(kuò)增可視化結(jié)果。Ac，西瓜噬酸菌；1～6，表1中其他致病菌；7，H2O。

2.3 RPA靈敏度與檢測限

圖5-A為不同濃度DNA的實(shí)時(shí)熒光RPA檢測結(jié)果，起峰時(shí)間隨DNA濃度降低而延長，熒光強(qiáng)度也隨之減弱，與qRT-PCR的檢測結(jié)果(圖5-B)基本一致；反應(yīng)結(jié)束后可視化結(jié)果見圖5-C，1～8管的亮度逐漸減弱，與擴(kuò)增曲線顯示的結(jié)果一致。圖5-D為不同濃度菌液的實(shí)時(shí)熒光RPA檢測結(jié)果，前3個(gè)濃度起峰時(shí)間基本相同，可能是菌液濃度過高，提取的DNA有限導(dǎo)致，也可能是由于DNA濃度過高，達(dá)到了擴(kuò)增閾值，其他濃度的起峰時(shí)間隨菌液濃度的降低而延長，與qRT-PCR檢測結(jié)果(圖5-E)一致。反應(yīng)結(jié)束后可視化結(jié)果見圖5-F，左側(cè)1～4管的亮度相當(dāng)，之后亮度逐漸減弱，與擴(kuò)增曲線顯示的結(jié)果基本一致。

A，不同濃度DNA的RT-RPA檢測結(jié)果；B，不同濃度DNA的qRT-PCR檢測結(jié)果；C，不同濃度DNA擴(kuò)增后的可視化結(jié)果(0～7的模板DNA濃度分別為60、60×5-1、60×5-2、60×5-3、60×5-4、60×5-5、60×5-6、60×5-7ng·μL-1)；D，不同濃度菌液的RT-RPA檢測結(jié)果；E，不同濃度菌液的qRT-PCR檢測結(jié)果；F，不同濃度菌液擴(kuò)增后的可視化結(jié)果(0～7的菌液濃度為：2.05×108、2.05×107、2.05×106、2.05×105、2.05×104、2.05×103、2.05×102、20.5 CFU·mL-1)。

2.4 實(shí)際樣品檢測結(jié)果

將實(shí)際樣品的實(shí)時(shí)熒光RPA檢測結(jié)果與qRT-PCR檢測結(jié)果的起峰時(shí)間進(jìn)行比對，結(jié)果表明(表3)，RPA方法的檢測均可在10 min之內(nèi)完成，最快可在3 min內(nèi)完成；而qRT-PCR要在30個(gè)循環(huán)左右才能檢出，忽略儀器升降溫的時(shí)間，最快也要40 min左右。由此可見，雖然兩種方法檢測結(jié)果一致，但實(shí)時(shí)熒光RPA所需檢測時(shí)間比qRT-PCR短，約為qRT-PCR檢測時(shí)間的1/5～1/10。擴(kuò)增后的陽性樣品進(jìn)行藍(lán)光照射后的熒光結(jié)果與陰性對照對比明顯，S6、S8的相對熒光值最高，熒光強(qiáng)度和其他樣品相比更強(qiáng)一些；S1、S2、S9的RPA結(jié)果相近，熒光亮度也差不多；S3的相對熒光值比其他幾個(gè)陽性樣品低，熒光強(qiáng)度也更弱(圖6)。

表3 實(shí)際樣品檢測結(jié)果

圖6 陽性樣品檢測曲線與熒光結(jié)果

3 討論

本研究針對瓜類果斑病菌序列設(shè)計(jì)了RPA引物和探針，對引物進(jìn)行篩選并進(jìn)行了檢測體系的特異性、靈敏度和適用性等測試，建立了瓜類細(xì)菌性果斑病的實(shí)時(shí)熒光RPA檢測方法。該檢測方法特異性強(qiáng)，靈敏度高，對極微量的DNA也能有效檢出?，F(xiàn)場對實(shí)際樣品的檢測能夠在10 min內(nèi)完成，加上制樣時(shí)間也不超過15 min，是qRT-PCR檢測時(shí)間的1/5～1/10，還可通過藍(lán)光照射達(dá)到檢測結(jié)果可視化的目的。該恒溫、快速的檢測方法為瓜類果斑病菌的現(xiàn)場快速檢測提供了新的技術(shù)支持，并為植物病害的快速檢測提供參考。

RPA是一種簡單、快速、特異和敏感的核酸擴(kuò)增方法，與普通PCR復(fù)雜的熱循環(huán)反應(yīng)相比，它可以恒溫?cái)U(kuò)增，因此有助于從高級實(shí)驗(yàn)室到低資源外部環(huán)境的應(yīng)用。但也由于它的擴(kuò)增溫度恒定，特異性引物與探針的設(shè)計(jì)便尤為重要。本研究上下游引物各設(shè)計(jì)了4條，并用不同的排列組合方式進(jìn)行篩選，以便篩選出最優(yōu)的引物組合，既方便快速又節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。目前針對普通分子實(shí)驗(yàn)的引物設(shè)計(jì)平臺有很多，隨著RPA技術(shù)的快速發(fā)展，也有必要開發(fā)針對RPA的引物設(shè)計(jì)平臺。

本研究所建立的瓜類果斑病菌RPA檢測體系未與其他瓜類病害發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性良好，且靈敏度與qRT-PCR的靈敏度基本一致。對不同菌落數(shù)的菌懸液進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，當(dāng)菌液濃度高于2.05×10CFU·mL時(shí)，RPA檢測效果無明顯變化，可能與DNA提取的最大限度有關(guān)，或是達(dá)到了DNA擴(kuò)增的閾值。與Walcott等進(jìn)行的普通PCR檢測相比，RPA檢測靈敏度是其近10倍，并且無需進(jìn)行凝膠電泳，避免了溴化乙錠的污染；與免疫PCR(Immuno-PCR)和qRT-PCR相比，大大節(jié)約了時(shí)間，并降低了對操作人員和實(shí)驗(yàn)條件的要求。

Crannell等研究表明，僅利用身體的溫度，就可使RPA檢測體系進(jìn)行反應(yīng)，但在實(shí)際的檢測過程中，由于外界環(huán)境的變化，體溫差異很大，而且在具體操作過程中，利用體溫檢測的樣品量也有限。本研究利用便攜式檢測儀保證了RPA對溫度的需要，同時(shí)提供兩種觀察RPA擴(kuò)增結(jié)果的方式，以滿足不同檢測場景的需要。這種基于熒光信號的RPA檢測方法，整個(gè)檢測過程不需要開蓋，防止了污染，同時(shí)也保證了檢測靈敏度。在可視化熒光檢測方面，本文利用了藍(lán)光燈和濾鏡，后續(xù)的研究考慮研發(fā)RPA擴(kuò)增、藍(lán)光照射與可視化判斷的小型裝置，以便更好地滿足RPA現(xiàn)場檢測的需要。