腎茶袋泡茶質(zhì)量標準的提升研究

王 劍 楊文玉 普天彪 李曉花,2*

1.西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，云南 景洪 666100；2.滇西應(yīng)用技術(shù)大學(xué) 傣醫(yī)藥學(xué)院，云南 景洪 666100

腎茶為唇形科植物Clerodendranthusspicatus(Thunb.)C. Y. Wu的全草，傣醫(yī)應(yīng)用歷史悠久[1-2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)和化學(xué)研究[3-4]顯示：腎茶中含有黃酮、二萜、酚類、三萜類等化學(xué)成分，具有抗炎、抗菌、利尿、免疫調(diào)節(jié)、改善慢性腎功能衰竭等藥理活性。腎茶袋泡茶(國藥準字Z20026660)由云南西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，是將腎茶切段粉碎成粗粉，過篩，混勻，滅菌后低溫干燥制得，具有清熱解毒、利水通淋的功效，用于膀胱濕熱所致的尿急、尿熱、尿痛，非特異性下尿路感染見上述證候者[5]。

腎茶袋泡茶質(zhì)量控制的文獻報道較少，僅見王劍等[6]采用薄層色譜法對腎茶中熊果酸的含量進行了改進。腎茶袋泡茶現(xiàn)行質(zhì)量標準WS-11108(ZD-1108)-2002中，包括薄層色譜的定性鑒別方法，采用HPLC法對熊果酸含量進行測定等方法[5]。根據(jù)文獻報道，迷迭香酸(RA)是一種天然存在的羥基化合物，具有抗炎、抗氧化、抗抑郁、抗菌作用和抗病毒的活性[7-8]，是腎茶主要有效成分之一，目前未見以腎茶袋泡茶中迷迭香酸作為含量測定指標的質(zhì)量標準研究。本項目以腎茶袋泡茶的臨床應(yīng)用為基礎(chǔ)，采用TLC法對腎茶袋泡茶進行定性鑒別，并建立腎茶袋泡茶中迷迭香酸的高效液相色譜法，以期使該制劑具備更好的質(zhì)量可控性，使檢測標準更加全面和完善，提高現(xiàn)行質(zhì)量標準。

A.腎茶生藥；B.腎茶藥材；C.腎茶袋泡茶圖1 腎茶圖

1 儀器與材料

1.1 儀器 1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；LC-2030型高效液相色譜儀(日本SHIMADZU公司)；DFY-600D型粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；ZF-2三用紫外分析儀(上海安亭電子儀器廠)；XMTD-701型薄層電動點樣器(上?？普苌萍加邢薰?ZDHW型調(diào)溫電熱套(河北省黃驊市中興儀器有限公司)；MS-105DU型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)；DFY-600型搖擺式高速萬能粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；島津InertSustain C18液相色譜柱；Agilent 5 TC-C18液相色譜柱。

1.2 藥品與試劑 10批腎茶袋泡茶(西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：160803、160805、170131、170901、170903、180610、180701、180704、180911、181004；規(guī)格：每袋裝3 g)；腎茶對照藥材(中國藥品生物制品檢定所，批號：121326-200502)；迷迭香酸對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號：111871-201706；純度：90.5%)；硅膠G薄層色譜板(青島譜科分離材料有限公司，批號：20200421)；純乙腈(Merk)和磷酸(J.T.Baker)為色譜純；鹽酸、乙酸乙酯、三氯甲烷、甲醇、甲酸等均為分析純試劑，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 外觀性狀 原標準對腎茶袋泡茶的性狀描述為“本品為袋泡茶，內(nèi)容物為植物莖、葉混合粗粉；氣微香，味微苦”，缺少色澤描述，筆者對樣品進行觀察后，將腎茶袋泡茶的外觀性狀描述修改為“本品為袋泡茶，內(nèi)容物黃褐色至深褐色的粗粉及顆粒；氣微香，味微苦”。

2.2 TLC鑒別[9-11]精密稱取腎茶袋泡茶(批號：180701)粉末約1.0g，置于圓底燒瓶中，加入20倍量30%甲醇，回流提取60 min，濾過，濾液作為供試品溶液；另取迷迭香酸對照品，加30%甲醇超聲處理5 min，搖勻，制成50 μg /mL對照品溶液；30%甲醇作為陰性對照。照薄層色譜法 (通則 0502) 試驗， 吸取上述3種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲酸(10∶2∶2∶0.5) 為展開劑展開，取出晾干，置紫外光燈 (365 nm) 下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性樣品無干擾。結(jié)果表明不同批次腎茶袋泡茶中均含有迷迭香酸。TLC色譜圖如圖2所示。

2.3 迷迭香酸的含量測定[8,12-15]

2.3.1 溶液制備 精密稱取腎茶袋泡茶(批號：180701)約1.0 g，置于圓底燒瓶中，加入20倍量30%甲醇，稱定質(zhì)量，回流提取60 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，30%甲醇補足減失質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，得到供試品溶液。取迷迭香酸對照品10.79 mg，置50 mL容量瓶中，加30%甲醇適量，超聲處理5 min，加30%甲醇至刻度，搖勻，制成195.3 μg /mL對照品儲備液。乙腈-0.1%磷酸水溶液(20∶80，V/V)為陰性對照溶液。

1.腎茶對照藥材；2.迷迭香酸對照品；3.陰性對照(30%甲醇)；4～13號樣品

2.3.2 色譜條件 高效液相色譜儀：Agilent 1260和島津LC-2030；檢測器：紫外檢測器；色譜柱：島津InertSustain C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)和Agilent 5 TC-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(20∶80，V/V)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：330 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.3.3 系統(tǒng)適用性及專屬性試驗 取陰性對照溶液(流動相)、對照品溶液和供試品溶液各適量，按照“2.3.2”項下色譜條件進樣測定，結(jié)果顯示：腎茶袋泡茶中迷迭香酸的保留時間約為21.9 min，與其余色譜峰的分離度均大于1.5，基線分離度良好，陰性對照溶液在供試品和對照品色譜峰相應(yīng)位置無干擾色譜峰，本方法系統(tǒng)適用性及專屬性良好。色譜圖如圖3所示。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密量取對照品儲備液 0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL，置25 mL容量瓶中，加30%甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別取上述制備的對照溶液10 μL注入液相色譜中，按“2.3.2”項下色譜條件進行檢測，測定峰面積，以進樣量(μg)橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。線形方程為Y=28988.0569967X+3434.4871968(r=0.9999)。迷迭香酸在3.906～78.12μg范圍內(nèi)線性符合要求。結(jié)果如圖4所示。

A. 陰性對照；B. 對照品；C.樣品

圖4 迷迭香酸線性曲線圖

2.3.5 中間精密度試驗 精密稱取同一批的腎茶袋泡茶(批號180701)，采用Agilent1260高效液相色譜儀和島津LC-2030高效液相色譜儀，按“2.3.2”項下方法試驗，試驗結(jié)果表明，兩個型號高效液相色譜儀，兩個不同操作人員檢測結(jié)果分別為3.70mg和3.79mg，RSD分別為1.56%和1.45%，表明該方法中間精密度良好，結(jié)果符合要求。

2.3.6 重復(fù)性試驗 分別稱取腎茶袋泡茶(批號：180701)，按照“2.3.1”項下制備方法獲得6個供試品，按“2.3.2”項下檢測方法測定迷迭香酸峰面積，計算質(zhì)量分數(shù)，測定結(jié)果RSD為1.59%，重復(fù)性符合要求。

2.3.7 加樣回收試驗 取已知含量的供試品(批號：180701)9份，隨機分為3組，分別加入含有401.2 μg/mL的迷迭香酸對照品溶液4 mL、5 mL和7 mL后，加30%甲醇補充至20 mL，精密稱定，按“2.3.1”項下樣品溶液制備方法進行提取，按“2.3.2”項下檢測方法進行含量測定，結(jié)果表明：本法回收率在98.07%～101.45%之間。平均回收率為99.47%。結(jié)果符合要求。結(jié)果見表1。

表1 迷迭香酸回收率試驗

2.3.8 檢測限與定量限考察 檢測限和信噪比以3倍和10倍噪聲水平所相當?shù)拇郎y物質(zhì)的量計算，按照“2.3.2”項下迷迭香酸的檢測方法對對照品溶液進樣檢測，結(jié)果迷迭香酸的檢測限為195.3 ng /mL，定量限為664.02 ng /mL。

2.3.9 穩(wěn)定性試驗 取腎茶袋泡茶(批號：180701)樣品3份，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，與對照品溶液分別于0、3、6、9、12、18、24 h測定，每個樣品3個重復(fù)，考察溶液穩(wěn)定性，結(jié)果顯示：RSD為0.57%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.10 耐用性試驗 取三份樣品，按“2.3.1”項下方法進行樣品制備，選用Agilent 5 TC-C18色譜柱和島津InertSustain C18色譜柱，按“2.3.2”項下方法測定含量，比較不同廠家同型色譜柱對測定結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，用島津InertSustain C18色譜柱和Agilent 5 TC-C18色譜柱所測的樣品含量均為3.55 mg/g，RSD分別為0.81%和0.96%，兩種品牌的色譜柱對迷迭香酸的含量測定結(jié)果無顯著影響，本方法耐用性良好。

2.3.11 樣品含量測定 按“2.3.2”項下檢測方法測定10批腎茶袋泡茶，迷迭香酸含量在8.13～11.54 mg/袋之間。平均含量為9.05 mg/袋。

表2 10批次腎茶袋泡茶迷迭香酸含量測定結(jié)果 (n=2)

續(xù)表2 表2 10批次腎茶袋泡茶迷迭香酸含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的選擇 在薄層鑒定和含量測定試驗中，筆者分別考察了不同提取方法(超聲提取、回流提取)、不同提取溶劑(10%、30%、50%、70%和100%甲醇-水)、不同液料比(10、20、30、40、50倍50%甲醇)、不同提取時長(0.5 h、1 h、1.5 h和2 h)對腎茶袋泡茶中迷迭香酸提取率的影響，并通過正交試驗進行了提取工藝優(yōu)化。結(jié)果顯示，采用20倍30%甲醇，回流提取60 min，為腎茶袋泡茶中迷迭香酸的的最佳提取工藝。

3.2 質(zhì)量標準性狀描述的改進 將原標準中腎茶袋泡茶的性狀“本品為袋泡茶，內(nèi)容物為植物莖、葉混合粗粉；氣微香，味微苦”改為“本品為袋泡茶，內(nèi)容物黃褐色至深褐色的粗粉及顆粒；氣微香，味微苦”，增加了色澤描述，使腎茶袋泡茶的性狀特征更完善。

3.3 質(zhì)量標準中TLC鑒別項的改進 以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(9∶4∶1)、正己烷-乙酸乙酯-甲酸 (3∶10∶0.2)、甲苯-乙酸乙酯-甲酸 -水(5∶4∶0.5∶0.5)、甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸 (2∶3∶4∶0.5∶2)、環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲酸(10∶2∶2∶0.5)，對展開劑進行了篩選，結(jié)果顯示：展開劑為環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲酸系統(tǒng)時，TLC圖譜中斑點清晰，分離度好。在方法學(xué)研究中，分別考察了溫度、濕度及不同廠家薄層板對迷迭香酸展開情況的影響，結(jié)果顯示，色譜斑點與分離度均符合要求，耐用性良好，確定環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲酸(10∶2∶2∶0.5)為腎茶袋泡茶的TLC鑒別條件。

3.4 HPLC含量測定方法的考察

3.4.1 流動相的選擇 通過查閱相關(guān)文獻資料，筆者主要考察了乙腈-0.1%乙酸(18∶82)，乙腈-0.1%乙酸(20∶80)和乙腈-0.1%乙酸(22∶78)等3種流動相對迷迭香酸出峰時間、峰形及樣品峰的影響。結(jié)果顯示，乙腈-0.1%磷酸溶液(20∶80)為流動相，迷迭香酸的出峰時間為21.9 min左右、峰形呈正態(tài)分布、分離度好、樣品峰的純度最優(yōu)。

3.4.2 流速的選擇 比較0.8 mL/min、1.0 mL/min和1.2 mL/min下對迷迭香酸出峰時間、峰形等的影響。結(jié)果所示，流速為1.0 mL/min時，樣品中迷迭香酸的保留時間為21.9 min左右，與其他雜鋒分離度較好；流速越低，保留時間越長，流速快則影響迷迭香酸的分離度。綜合以上因素，選擇流動相的流速為1.0 mL/min。

3.4.3 柱溫的選擇 比較28 ℃、30 ℃和32 ℃ 3種柱溫條件對樣品中迷迭香酸含量測定結(jié)果的影響。結(jié)果顯示，不同溫度條件下所測的樣品含量范圍為3.81～3.94 mg/g，RSD為1.18%，符合要求，綜合考慮操作條件的可控性，選擇檢測柱溫為30 ℃。

3.4.4 檢測波長的選擇 色譜圖和光譜圖的檢測結(jié)果顯示，迷迭香酸在328 nm、330 nm和332 nm處均有吸收，檢測結(jié)果的RSD為0.76%，符合要求。當檢測波長為330 nm時，色譜圖基線更平穩(wěn)、色譜峰分離度更好，靈敏度更高，因此確定檢測波長為330 nm。

3.5 含量限度的擬定 腎茶袋泡茶現(xiàn)行質(zhì)量標準WS-11108(ZD-1108)-2002中，每袋腎茶以熊果酸(C30H48O3)計，含量不得少于2.4 mg。為了使腎茶袋泡茶質(zhì)量標準更能與臨床應(yīng)用相結(jié)合，本試驗采用HPLC法建立了腎茶袋泡茶中迷迭香酸的檢測方法。根據(jù)腎茶袋泡茶的處方(腎茶3000 g)和制法(切段，粉碎成粗粉，過篩，混勻，滅菌后低溫干燥，分裝，制成袋泡茶1000袋，即得)，本研究對10批腎茶袋泡茶進行檢測，迷迭香酸含量范圍為8.13～11.54 mg/袋。平均含量為9.05 mg/袋，根據(jù)10批產(chǎn)品的含量測定結(jié)果及《中國藥典》2015版四部通則9000制定原則9101藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導(dǎo)原則七“原料藥和制劑含量測定，范圍一般為測定濃度的80%～120%”，以及公司對腎茶袋泡茶含量控制要求，暫定本品含量為平均含量的80%，即本品每袋含腎茶以迷迭香酸(C18H16O8)計，不得少于7.2 mg。

綜上，筆者在腎茶袋泡茶原有質(zhì)量標準基礎(chǔ)上修訂了性狀描述，改進了TLC檢測條件，并采用HPLC法測定了迷迭香酸的含量，方法簡便可行，準確性、重復(fù)性高，能夠有效地提高腎茶袋泡茶的質(zhì)量控制標準，為該制劑的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。