鹿茸多糖對MC3T3-E1成骨細(xì)胞與BMSCs骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與分化的作用研究

張 博 馮天璞 劉元媛

錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121001

骨質(zhì)疏松為中老年人群常見慢性病，尤其是中老年女性骨質(zhì)疏松癥更為普遍，患病后容易出現(xiàn)骨質(zhì)疏松性疼痛，極大地增加了骨折的風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響中老年人群的生活質(zhì)量。目前治療骨質(zhì)疏松癥的常用藥物有抗骨代謝類藥物，如雌激素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、雙磷酸鹽類、降鈣素類等；促骨合成類藥物，如甲狀旁腺激素類藥物[1-2]。這些藥物雖然有一定療效，但是也存在著副作用的風(fēng)險(xiǎn)，如：雌激素與子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌之間的關(guān)系仍然存在著爭議；結(jié)合型雌激素會明顯升高HDL膽固醇水平；雙膦酸鹽類藥物容易產(chǎn)生頜骨壞死、肌肉骨骼痛、食道癌、腎功能衰竭不良反應(yīng)等。有研究[3-4]表明，中藥在提高骨密度、緩解骨質(zhì)疏松性疼痛等方面具有顯著作用，并且具有副作用小、適合長期服用等優(yōu)勢，因此，醫(yī)藥學(xué)界近年來對中藥治療骨質(zhì)疏松癥的研究尤為重視。

鹿茸作為中藥使用歷史悠久，《中國藥典》記載鹿茸具有壯腎陽、益精血、強(qiáng)筋骨、調(diào)沖任，托瘡毒等功效?，F(xiàn)代藥理研究[5]發(fā)現(xiàn)鹿茸具有恢復(fù)心肌功能、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)性功能、抗疲勞、防治骨質(zhì)疏松等多種活性。有研究[6]表明，鹿茸藥材中的多糖成分具有改善骨質(zhì)疏松癥狀的作用，因此，本文以鹿茸中的多糖成分為研究對象，探討鹿茸多糖對MC3T3-E1成骨細(xì)胞以及BMSCs骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與分化的影響，為進(jìn)一步闡明鹿茸抗骨質(zhì)疏松癥的有效成分和作用機(jī)制提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 酶標(biāo)儀(Bio-TeK，美國)；CKX41SF倒置顯微鏡( OLYMPU S，日本)；MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱(SANYO，日本)；800離心機(jī)(江蘇金壇市城西曉陽電子儀器廠)；101-(1)型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海路達(dá)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；MDF-192型超低溫冰箱(Sanyo，日本)；優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)(中國)；24 孔、96 孔培養(yǎng)板(greiner，德國)；15 mL 離心管(greiner，德國)；移液器(Select BioProducts，美國)；MLS-3780 高壓滅菌器(SANYO，日本)。

1.2 細(xì)胞 小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞、大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均購于賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 試藥 MEMα(含核苷)培養(yǎng)基、原代間充質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)體系購于賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司；胎牛血清FBS購于clark；青霉素、鏈霉素購于大連美侖生物技術(shù)有限公司；PBS 平衡鹽溶液購于武漢博士德生物工程有限公司；0.25%胰蛋白酶購于Gibco公司；CCK-8購于美國APExBIO生物科技有限公司；小鼠堿性磷酸酶(ALP)ELISA試劑盒、大鼠堿性磷酸酶(ALP)ELISA試劑盒均購于武漢博士康生物工程有限公司。

1.4 鹿茸多糖提取液的制備 鹿茸藥材粉碎，過80目篩，加10倍量石油醚(60～90 ℃)脫脂2次，殘?jiān)?0倍量水，80 ℃回流提取兩次，濾過，合并濾液，將濾液濃縮至適量，加乙醇調(diào)至含醇量為70%，靜置12 h，分取沉淀物，用乙醇洗滌2次，蒸干，精密稱取干燥提取物適量，加水溶解，使成濃度為30 mg/mL，無菌條件下以0.22 μm微孔濾膜過濾，即得。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 鹿茸多糖對小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞的影響

2.1.1 鹿茸多糖最佳起效量的確定 將生長狀態(tài)良好的小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，以4×104個(gè)/mL的濃度接種于96孔板上，每孔100 μL。實(shí)驗(yàn)分為6組，分別為給藥組1、2、3、4、5與空白對照組，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。24 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入不同量多糖提取液，再加入適量培養(yǎng)基，使終濃度分別為0.05 μg/μL、0.3 μg/μL、0.6 μg/μL、0.9 μg/μL、1.2 μg/μL，空白組只加培養(yǎng)基。藥物干預(yù)24 h后，每孔加CCK-8溶液10 μL，將培養(yǎng)板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h，取出，于酶標(biāo)儀450 nm波長處測定吸光度(OD)值。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析處理。

2.1.2 鹿茸多糖對小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖的影響[7-10]將生長狀態(tài)良好的小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，以4×104個(gè)/mL的濃度接種于96孔板上，每孔100 μL，共接種3板。實(shí)驗(yàn)分為兩組，分別為空白對照組與多糖組，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。24 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入多糖提取液，再加入適量培養(yǎng)基，使終濃度為0.9 μg/μL，空白組只加培養(yǎng)基，分別于藥物干預(yù)24 h、48 h、72 h后，每孔加CCK-8溶液10 μL，將培養(yǎng)板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h，取出，于酶標(biāo)儀450 nm波長處測定吸光度(OD)值。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析處理。

2.1.3 鹿茸多糖對小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞分化的影響[11-12]將生長狀態(tài)良好的小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，以5×104個(gè)/mL的濃度接種于24孔板上，每孔500 μL，共接種3板。實(shí)驗(yàn)分為兩組，分別為空白對照組與多糖組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。24 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入鹿茸多糖提取液，再加入適量培養(yǎng)基，使終濃度為0.9 μg/μL，空白組只加培養(yǎng)基。分別于藥物干預(yù)24 h、48 h、72 h后，棄去培養(yǎng)液，收集細(xì)胞，采用ELISA法對細(xì)胞內(nèi)ALP蛋白酶活性進(jìn)行檢測，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析處理。

2.2 鹿茸多糖對大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響

2.2.1 鹿茸多糖最佳起效量的確定 將生長狀態(tài)良好的大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，以5×104個(gè)/mL的濃度接種于96孔板上，每孔100 μL。實(shí)驗(yàn)分為6組，分別為給藥組1、2、3、4、5與空白對照組，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔。24 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入不同量的多糖提取液，再加入適量的培養(yǎng)基，使終濃度分別為0.3 μg/μL、0.6 μg/μL、0.9 μg/μL、1.2 μg/μL、1.8 μg/μL，空白組只加培養(yǎng)基。藥物干預(yù)24 h后，每孔加CCK-8溶液10 μL，將培養(yǎng)板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h，取出，于酶標(biāo)儀450 nm波長處測定吸光度(OD)值。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析處理。

2.2.2 鹿茸多糖對大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響 將生長狀態(tài)良好的大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，以5×104個(gè)/mL的濃度接種于96孔板上，每孔100 μL，實(shí)驗(yàn)分為兩組，分別為空白對照組與多糖組，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，共接種3板。24 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入多糖提取液，再加入適量的培養(yǎng)基，使終濃度為1.2 μg/μL，空白組只加培養(yǎng)基，分別于藥物干預(yù)24 h、48 h、72 h后，每孔加CCK-8溶液10 μL，將培養(yǎng)板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h，取出，于酶標(biāo)儀450 nm波長處測定吸光度(OD)值。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析處理。

2.2.3 鹿茸多糖對大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響[13-15]將生長狀態(tài)良好的BMSCs骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，以6×104個(gè)/mL的濃度接種于24孔板上，每孔500 μL，共接種3板，實(shí)驗(yàn)分為兩組，分別為空白對照組與多糖組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。24 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入多糖提取液，再加入適量培養(yǎng)基，使終濃度為1.2 μg/μL，空白組只加培養(yǎng)基，每3天換一次液，分別于藥物干預(yù)5 d、10 d、15 d后，棄去培養(yǎng)液，收集細(xì)胞，采用ELISA法對細(xì)胞內(nèi)ALP蛋白酶活性進(jìn)行檢測，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析處理。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 鹿茸多糖對小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞作用的最佳起效量確定 以鹿茸多糖提取液對小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞干預(yù)24 h后，細(xì)胞的活性隨著藥物濃度的增加而明顯增強(qiáng)，并且與空白對照組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在每孔加藥量達(dá)到0.9 μg/μL后，其增殖作用趨于穩(wěn)定，因此確定最佳起效量為0.9 μg/μL。結(jié)果見表1。

表 1 不同劑量鹿茸多糖作用于MC3T3-E1 24 h后OD值的變化

3.2 鹿茸多糖對小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖的影響 小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞經(jīng)鹿茸多糖提取液干預(yù)增殖24 h、48 h、72 h后，細(xì)胞活性隨著藥物作用時(shí)間的增加逐漸增強(qiáng)，并且不同時(shí)間點(diǎn)給藥組與空白對照組相比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見表2。

表2 鹿茸多糖作用于MC3T3-E1不同時(shí)間后OD值的變化

3.3 鹿茸多糖對小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞分化的影響 以鹿茸多糖提取液干預(yù)作用小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞24 h后，ALP蛋白酶活性顯著增強(qiáng)，并且與空白對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，作用48 h、72 h后ALP蛋白酶活性有所增強(qiáng)，但與空白組比較沒有顯著性差異。結(jié)果見表3。

表3 鹿茸多糖對MC3T3-E1成骨細(xì)胞中ALP(U/L)含量的影響

3.4 鹿茸多糖對大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作用的最佳起效量確定 以鹿茸多糖提取液干預(yù)大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞24 h后，細(xì)胞的活性隨著藥物濃度的增加而明顯增強(qiáng)，并且與空白對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在每孔加藥量達(dá)到1.2 μg/μL后增殖作用不再顯著增強(qiáng)，確定最佳起效量為1.2 μg/μL。結(jié)果見表4。

表4 不同劑量鹿茸多糖作用于BMSCs 24 h后OD值的變化

3.5 鹿茸多糖對大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響 鹿茸多糖提取液干預(yù)大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖24 h、48 h、72 h后，細(xì)胞活性增強(qiáng)作用逐漸減弱，但均強(qiáng)于空白對照組，并且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見表5。

表5 鹿茸多糖作用于BMSCs不同時(shí)間后OD值的變化

3.6 鹿茸多糖對大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的影響 以鹿茸多糖提取液干預(yù)大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞5 d和15 d后，細(xì)胞內(nèi)ALP蛋白酶活性有所增加，但與空白對照組沒有顯著性差異。結(jié)果見表6。

表6 鹿茸多糖對BMSCs骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中ALP (U/L)含量的影響

4 討論

成骨細(xì)胞是骨形成的基本功能單位，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化性的特點(diǎn)，在一定誘導(dǎo)條件下可以向成骨細(xì)胞分化。對成骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)是探索骨質(zhì)疏松癥機(jī)制的重要模型[16-17]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以鹿茸多糖提取液作用于成骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，以CCK-8法檢測細(xì)胞活力，均高于空白對照組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明鹿茸多糖能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖。

堿性磷酸酶(ALP)廣泛分布于人體組織和體液，其大部分由骨細(xì)胞產(chǎn)生，是成骨細(xì)胞成熟的特異性標(biāo)志，因此檢測堿性磷酸酶的活性對成骨研究具有重要意義[18]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鹿茸多糖提取液干預(yù)小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞24 h后，ALP蛋白酶活性增強(qiáng)，且與空白對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明鹿茸多糖能夠促進(jìn)小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞的成熟。以鹿茸多糖提取液干預(yù)作用大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞5 d、15 d后，ALP蛋白酶活性均有所增加，但與空白對照組比較沒有顯著性差異。由此可見，鹿茸多糖對大鼠BMSCs骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有增強(qiáng)分化的趨向，這對于促進(jìn)骨生成具有積極意義。

綜上所述，鹿茸多糖是鹿茸具有抗骨質(zhì)疏松作用的潛在有效物質(zhì)之一，能夠作用于成骨細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和分化等環(huán)節(jié)，這可能是鹿茸起到促進(jìn)骨生成、抗骨質(zhì)疏松作用機(jī)制之一。