基于高通量測序構(gòu)建碘難治性分化型甲狀腺癌ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

羅瑩瑩，盧其騰，韋智曉

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學科，廣西 南寧 530021)

0 引言

甲狀腺癌(Thyroid cancer，TC)是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，占所有癌癥的3.1%[1]。目前，手術(shù)+131I+TSH抑制治療是分化型甲狀腺癌(Differentiated thyroid cancer,DTC)的主要治療手段，據(jù)SEER數(shù)據(jù)庫顯示美國甲狀腺癌患者的5年生存率高達98.3%[2]。然而，約5%的患者應(yīng)用131I治療的效果較差，導致患者死亡，這部分患者的腫瘤細胞形態(tài)和功能發(fā)生退行性改變，濃聚碘的能力喪失，稱之為碘難治性分化型甲狀腺癌[3]。一項長期研究結(jié)果顯示，遠處轉(zhuǎn)移的DTC患者對碘顯著攝取的10年生存率約為56%，而沒有顯著碘攝取能力的患者10年生存率僅為10%[4]。因此，挖掘早期診斷RAIR-DTC的生物學標志物，明確RAIR-DTC的潛在發(fā)病機制，尋找新的治療靶點，具有重要的臨床意義。

長鏈非編碼RNA (Long noncoding RNAs, lncRNA)是一類長度超過200 nt的RNA轉(zhuǎn)錄本，可干擾mRNA的剪切，直接結(jié)合蛋白調(diào)節(jié)其活性或者改變蛋白定位，以及作為ceRNA參與重組基因的表達，在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和翻譯等多個水平上調(diào)控基因表達[5]。2011年Salmena等[6]提出ceRNA假說，認為lncRNA可以通過miRNA應(yīng)答元件(MRES)吸附miRNA，抑制miRNA發(fā)揮作用，進而間接調(diào)控靶mRNA的表達。多項研究表明，lncRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，F(xiàn)eng等人[7]發(fā)現(xiàn)lncRNAn384546通過作為miR-145-5p的競爭性內(nèi)源性RNA調(diào)控AKT3來促進甲狀腺乳頭狀癌的進展和轉(zhuǎn)移；而Guo Q等人[8]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA AB074169通過靶向KHSRP介導的p21表達抑制PTC腫瘤細胞增殖。然而，lncRNA及ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在RAIR-DTC的研究鮮有報道。因此，本研究充分利用高通量測序數(shù)據(jù)，篩選RAIR-DTC中l(wèi)ncRNA和mRNA的差異表達譜，構(gòu)建lncRN-miRNA-mRNA的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，探索lncRNA在RAIR-DTC中潛在的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 參與者和樣本收集

本研究共收集在2013年至2019年在廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院行131I治療的72例患者，納入標準：①經(jīng)病理確診為DTC；②至少接受2次131I治療。排除標準：①抗甲狀腺球蛋白抗體陽性；②放化療史；③其他惡性腫瘤病史。根據(jù)影像學和血清學檢查[3]分為RAIR-DTC組37例和NRAIR-DTC組35例，其中RAIR-DTC：①轉(zhuǎn)移灶在清甲成功后的首次131I治療后全身顯像中即表現(xiàn)為不攝碘，致其無法從后續(xù)的131I治療中獲益。②原本攝碘的功能性轉(zhuǎn)移灶經(jīng)131I治療后逐漸喪失攝碘能力。③部分轉(zhuǎn)移灶攝碘，而部分轉(zhuǎn)移灶不攝碘。④攝碘轉(zhuǎn)移灶在經(jīng)過多次131I治療后雖然保持攝碘能力但仍在1年內(nèi)出現(xiàn)病情進展。NRAIR-DTC的判斷標準包括治愈和好轉(zhuǎn)。分別從兩組中隨機選取3例患者的血液樣本(3例RAIRDTC組和3例NRAIR-DTC組)，分離血液中的單核細胞送至華大基因組學研究所進行RNA測序。本研究參與者均簽署知情同意書，并獲得了廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 總RNA提取和lncRNA測序

根據(jù)制造商的說明，使用總RNA血液提取試劑盒(離心式，BioTeke公司)從全血中提取RNA，使 用Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies)測定RNA樣品的濃度和純度，并使用100 ng RNA進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳以進行初步質(zhì)量控制。RNA樣品滿足以下標準：濃度＞80ng/uL，RIN≥7以及A260/280值在1.9和2.2之間。瓊脂糖凝膠電泳的完整性要求清晰可見的28S/18S條帶無明顯降解。

將采集到的細胞進行cDNA文庫構(gòu)建和RNA測序。使用DNBSEQ平臺進行l(wèi)ncRNA測序，并將高質(zhì)量讀數(shù)與人類參考基因組(GCF_000001405.39_GRCh38.p13)進行比對。通過期望最大化(RSEM)，將基因表達標準化為每百萬映射讀數(shù)(FPKM)每千堿基外顯子模型的片段。

1.3 DElncRNAs和DEmRNAs的篩選

根據(jù)Michael I, et al.[9]中描述的方法，通過DEseq2軟件分析并鑒定差異表達基因(DEGs)，對編碼蛋白的lncRNA和mRNA進行差異分析，設(shè)置|log2FC|＞1，Qvalue＜0.05，并對存在差異的lncRNA和mRNA繪制差異熱圖、火山圖。

1.4 lncRNA、miRNA、mRNA互作預測

根據(jù)篩選出的lncRNA，應(yīng)用mir-code數(shù)據(jù)庫篩選與差異lncRNA相互作用的miRNA，再從miRTarBase、TargetScan、miRDB這3個miRNA靶基因預測數(shù)據(jù)庫中取3個數(shù)據(jù)庫均能預測到的靶基因，與步驟1.3所獲得的差異mRNA取交集?；谏鲜龊Y選的lncRNA、miRNA、mRNA，整合得到lncRNA-miRNA-mRNA互作網(wǎng)絡(luò)，并導入Cytoscape(版本：v3.9.0)繪制ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖。使用Cytoscape核心插件cytohubba篩選degree數(shù)最高的10個靶基因，最終選取5個關(guān)鍵基因進行后續(xù)分析。

1.5 靶基因GO功能及KEGG信號通路分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對差異基因進行GO功能和KECG通路富集分析，研究RAIR-DTC的主要生物功能和信號通路，Q＜0.05代表富集結(jié)果顯著。利用R語言繪制GO和 KEGG富集分析氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 一般資料及RNA提取

隨機收集3例RAIR-DTC患者和3例NRAIRDTC患者的全血樣本進行l(wèi)ncRNA測序分析，女4例，男2例，平均年齡(42.83±15.20)歲。6份送檢樣本的提取結(jié)果情況如表1。

表1 RNA提取結(jié)果表

2.2 DEGs的鑒定

本研究在RAIR-DTC和NRAIR-DTC之間共鑒定出21個DEGs，上調(diào)12個，下調(diào)9個。共包括14個差異表達的lncRNA，上調(diào)9個，下調(diào)8個，其中有6個已知的lncRNA，8個新發(fā)現(xiàn)待注釋的lncRNA；共有7個差異表達的mRNA，上調(diào)3個，下調(diào)4個(圖1、表2、表3)。

表2 已知差異基因(lncRNA、mRNA)匯總表

表3 新lncRNA匯總表

2.3 ceRNA網(wǎng)絡(luò)

利用mircode等數(shù)據(jù)庫共預測到168個miRNA和3079個mRNA，將預測到的mRNA與7個差異mRNA取交集，再刪除不在該互作關(guān)系中的miRNA、lncRNA，整合后得到lncRNA-miRNAmRNA互作網(wǎng)絡(luò)，繪制ceRNA網(wǎng)絡(luò)(圖2)。ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中共包括174個節(jié)點(由5個lncRNA、168個miRNA、1個mRNA構(gòu)建)和254條邊，每條邊表示lncRNA 與miRNA，miRNA與mRNA之間的關(guān)系。

圖2 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

通 過Cytoscape中 的“cytohubba”插 件，選擇“degree”top10的 基 因 作 為 關(guān) 鍵 基 因(圖3)，發(fā)現(xiàn)在關(guān)鍵度最高的5個lncRNA中，TMPOAS1、LOC107987228表達上調(diào)，其余3個lncRNA (LOC101060400、FAM239B、SLC5A4-AS1)均表達下調(diào)(圖4)。通過ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖分析lncRNA-miRNAmRNA之間的交互關(guān)系(表4)，發(fā)現(xiàn)其中4個關(guān)鍵lncRNA (LOC101060400、FAM239B、SLC5A4-AS1、TMPO-AS1)與同一個miRNA(hsa-miR-1587)共同競爭靶mRNA(SLC1A7)的結(jié)合位點。

表4 ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機制

圖3 鑒定到的關(guān)鍵基因

圖4 關(guān)鍵基因在RAIR-DTC的表達水平

2.4 DEGs的GO功能和KEGG信號通路分析

本研究共獲得30個富集的GO_CC、26個富集的GO_MF、63個富集的GO_BP及14條KEGG信號通路(圖5)。GO分析結(jié)果顯示：在細胞組成(cellular composition,CC)中，靶基因主要在白細胞介素-5受體復合物、RNA聚合酶II、全酶受體復合體富集(圖5A)；在分子功能(molecular function,MF)中，靶基因主要富集在細胞因子受體活性、白細胞介素-5受體活性、血管內(nèi)皮生長因子活性(圖5B)；在生物過程(biological process,BP)中，靶基因主要在白細胞穩(wěn)態(tài)、骨髓祖細胞分化、pro-B細胞分化、白細胞分化富集(圖5C)。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，靶基因主要富集在造血細胞譜系、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)等信號通路(圖5D)。

圖5 靶基因的GO和KEGG富集分析

3 討論

lncRNA在細胞的正常生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用，越來越多的研究表明，lncRNA的失調(diào)與甲狀腺癌的發(fā)病機制密切相關(guān)，如lncRNANEAT1、lncRNA XIST、lncRNA SLC26A4-AS1等[10-12]。miRNA是一類高度保守的內(nèi)源性非編碼小RNA，已發(fā)現(xiàn)多種miRNA與甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如miRNA-21、miRNA-214、miR-98-5p等[10,13]。lncRNA相關(guān)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在腫瘤進展中發(fā)揮重要作用，已經(jīng)在胃癌、乳腺癌等多種腫瘤中對ceRNA網(wǎng)絡(luò)進行了系統(tǒng)分析，目前對RAIR-DTC中l(wèi)ncRNA相關(guān)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)缺乏研究，其在RAIR-DTC中的表達模式和機制有待進一步探索。因此，本研究通過分析RAIR-DTC非編碼RNA高通量測序數(shù)據(jù)，在RAIR-DTC中共鑒

定了特異性表達的14個lncRNA和7個mRNA，基于ceRNA假說成功構(gòu)建了由5個lncRNA、168個miRNA、1個mRNA組成的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進一步篩選出5個關(guān)鍵lncRNA，并通過GO和KEGG通路分析預測了RAIR-DTC中差異表達基因的功能，為RAIR-DTC臨床診斷和治療提供新靶標。

本研究結(jié)果顯示，在ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的5個關(guān)鍵lncRNA中，除TMPO-AS1、LOC107987228外，其他差異表達的lncRNA均下調(diào)。TMPO-AS1作為新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，其功能是致癌的lncRNA，許多研究證實其在各種人類惡性腫瘤中異常高表達并與預后不良相關(guān)，如肺癌、肝細胞癌、甲狀腺癌等[14-15]。Li Z等[16]研究結(jié)果表明TMPO-AS1在甲狀腺癌組織和細胞系中高表達，并且TMPO-AS1通過海綿miR-498調(diào)節(jié)TMPO促進甲狀腺癌的細胞增殖，我們的研究也同樣發(fā)現(xiàn)TMPO-AS1在RAIR-DTC中高表達，因此，其可能在RAIR-DTC中發(fā)揮重要的生物學作用。而另外四個lncRNA(LOC107987228、LOC101060400、FAM239B、SLC5A4-AS1)此前均未報道與甲狀腺癌相關(guān)，且與其他癌癥的研究也未見報道，雖然這四個lncRNA在我們的研究中首次被報道為RAIR-DTC的潛在生物標志物，但相關(guān)證據(jù)仍不充分，未來需要進行深入研究。

miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它通過與靶基因的非轉(zhuǎn)錄區(qū)結(jié)合調(diào)控靶基因的表達，進而影響細胞的生化過程和信號轉(zhuǎn)導通路，導致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在我們的研究中，發(fā)現(xiàn)miR-1587在RAIRDTC的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。miR-1587是近年來發(fā)現(xiàn)的一種富含G序列的新型miRNA，在其他疾病中有相關(guān)的研究。Tu D等[17]的研究揭示了miR-1587 / IRF7軸介導了M2巨噬細胞誘導的乳腺癌進展。Liu R等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-1587過表達增強了DNA雙鏈斷裂的形成，阻止了結(jié)直腸癌(CRC)細胞的生長，并通過直接抑制LIG4表達增強了CRC細胞的放射敏感性，揭示了miR-1587是CRC放射治療的潛在靶標，并確定miR-1587是一種有效的電離輻射(IR)敏化劑。miR-1587在DTC/RAIR-DTC中的研究有限，值得我們進一步研究。

在參與ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的基因中，KEGG分析顯示，這些基因主要富集在兩條通路中：造血細胞譜系通路和癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)信號通路。Sun T團隊[19]經(jīng)大樣本生信分析研究發(fā)現(xiàn)，癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)信號通路在PTC發(fā)病機制中發(fā)揮重要功能的途徑。Zhao L等[20]的最新研究表明，在甲狀腺癌中異常甲基化的DEGs主要與癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、MAPK信號通路和TC中的內(nèi)在凋亡信號通路有關(guān)。在本研究中確定的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)為進一步研究提供了有用的線索。

在本研究中，我們構(gòu)建了lncRNA-miRNAmRNA的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，鑒定了與RAIR-DTC相關(guān)的差異表達lncRNA和mRNA，其中一些RNA(如TMPO-AS1)可能代表RAIR-DTC臨床診斷的新型候選生物標志物，但需要進一步驗證和研究。此外，我們還需要進一步的功能實驗研究，以確定ceRNA網(wǎng)絡(luò)的組成部分在RAIR-DTC中的具體功能作用。