4種中草藥微波提取物制備及其抗真菌和生根活性性能

陳蔚燕

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)院,山東 青島266109)

我國(guó)中草藥資源相當(dāng)豐富,目前使用的中藥已達(dá)5 000種左右,把各種藥材相配伍而形成的方劑,更是數(shù)不勝數(shù)。中草藥在我國(guó)消炎方面的用處已有很久的歷史,中草藥制劑具有成分多樣且結(jié)構(gòu)復(fù)雜、毒副作用較小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)[1-4]。中草藥作為殺菌抑菌劑也呈現(xiàn)出明顯的效果,而且有較大的開(kāi)發(fā)潛力,在2020年新冠肺炎科研攻關(guān)和診療救治工作時(shí),上海市衛(wèi)生健康委員會(huì)和上海市中醫(yī)藥管理局聯(lián)合發(fā)文,在提出的“要加快藥物研發(fā)進(jìn)程,堅(jiān)持中西醫(yī)結(jié)合、中西藥并用”的要求,要在新冠肺炎防治中充分發(fā)揮中醫(yī)藥作用,可見(jiàn),中草藥制劑的臨床應(yīng)用價(jià)值巨大[5-9]。目前,中草藥在真菌的抑制、醫(yī)療及禽畜類(lèi)飼料添加方面有研究[10-15],中草藥對(duì)種子萌發(fā)、土壤理化性質(zhì)、幼苗生長(zhǎng)等方面也有重要影響[16-18]。有研究表明中草藥中的次生代謝物質(zhì)具有一定的植物調(diào)節(jié)活性[19-21],然而關(guān)于中草藥提取物應(yīng)用于植物調(diào)節(jié)作用的研究較少,因此,研究中草藥的提取物對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響,對(duì)中草藥進(jìn)行全方位的研究有助于豐富中草藥數(shù)據(jù)。

有文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)半枝蓮、木通、忍冬藤和連翹在傳統(tǒng)提取工藝下活性物質(zhì)的含量,并對(duì)其活性物的作用進(jìn)行了研究[22-25],本研究采取微波提取方式對(duì)半枝蓮,木通,忍冬藤和連翹4味中草藥進(jìn)行粗提取,研究其微波提取物對(duì)不同真菌的抑制效果,并以小麥種子為研究對(duì)象,研究提取液對(duì)小麥種子的促生作用,旨在為新型生物農(nóng)藥開(kāi)發(fā)提供依據(jù),為中草藥利用提供新思路,更深入的去探索中藥的有效成分和價(jià)值。

連翹(Forsythia suspense),吉林;忍冬藤(Lonicera japonicaThunb),山東;半枝蓮(Barbed skullcap),江蘇;木通(Akebia quinate),湖北,均購(gòu)于青島宏仁堂大藥房,磨細(xì)過(guò)孔徑0.150 mm 篩備用。

葡萄糖、瓊脂,均為分析純,阿拉丁試劑公司。柑橘炭疽病菌、棉花枯萎病菌、小麥全蝕病菌,以上3種植物病原真菌的菌種均從山東省農(nóng)業(yè)仿生應(yīng)用工程技術(shù)研究中心獲得。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高速萬(wàn)能粉碎機(jī),FW100型,天津市泰斯特儀器有限公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋,LDZM-80KCS型,上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng);凈化工作臺(tái),SW-CG-2FD型,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;微波萃取儀,MDS-8G 型,武漢中諾儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

微波提取方法:采用MDS-8G 型微波萃取系統(tǒng),根據(jù)文獻(xiàn)[26]的正交水平和因素,用表1和表2的設(shè)計(jì)進(jìn)行微波萃取,萃取完成后,稍冷,旋蒸濃縮至干,備用。

表1 正交設(shè)計(jì)各因素Table 1 Factors of orthogonal design

表2 正交設(shè)計(jì)表Table 2 Orthogonal design table

1.3 抑菌活性測(cè)定方法

實(shí)驗(yàn)采用抑制菌絲生長(zhǎng)速率法來(lái)測(cè)定提取物的室內(nèi)抑菌活性[27]。在超凈工作臺(tái)上將培養(yǎng)基(帶藥),倒入直徑為6 cm 的培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板備用,并用4 mm 打孔器在事先準(zhǔn)備好的菌種邊緣打孔,用接種針把打好孔的活化菌接到制備好的培養(yǎng)皿內(nèi),每次重復(fù)處理3次,用塑料薄膜包好,放入恒溫27℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d左右,并做對(duì)照(20%乙醇)處理。待空白對(duì)照的菌落長(zhǎng)滿(mǎn)平板的2/3時(shí),用十字交叉法進(jìn)行測(cè)量各個(gè)菌落直徑,并計(jì)算各藥劑對(duì)病菌的抑制率。本部分中草藥微波提取物的濃度均為8.00 mg·m L－1(用20%乙醇配置)。

半致死濃度EC50的測(cè)定:取連翹和忍冬藤的微波提取物加入滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基中,配制含藥濃度分別為1.00,2.00,4.00,6.00,8.00,10.00 mg·m L－1的含藥平板,采用上述的菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定抑菌活性。

1.4 生根活性測(cè)定方法

采取室內(nèi)瓊脂生根法進(jìn)行[28]。挑選子粒大小均勻飽滿(mǎn)的種子,用相應(yīng)的藥劑溶液浸種處理10 h。藥劑浸種處理完后置于紙床上,放入全智能氣候植物箱中處理24 h,待種子主根露白而側(cè)根剛冒尖。同時(shí)制備出空白培養(yǎng)基,將催好芽的種子種在已經(jīng)凝固的培養(yǎng)基中,然后放入全智能氣候植物箱中繼續(xù)培養(yǎng),待到CK(清水對(duì)照)種子主根觸及杯底時(shí)用卡尺測(cè)量種子的主根、側(cè)根、莖高,每次重復(fù)處理3次。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel計(jì)算抑菌率的平均值及抑菌率,使用origin 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波提取條件下中草藥抑菌數(shù)據(jù)

2.1.1 微波提取條件下半枝蓮抑菌數(shù)據(jù)

半枝蓮微波提取液在8.00 mg·m L－1濃度下對(duì)真菌抑制結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可以看出,半枝蓮在微波功率為800 W,提取時(shí)間為3 min,料液比(g·m L－1)為5∶100,溶劑為丙酮時(shí),提取物濃度配置為8.00 mg·m L－1下,對(duì)柑橘炭疽真菌的抑菌率達(dá)到90.4%,對(duì)棉花枯萎真菌的抑菌率達(dá)到88.6%,對(duì)小麥全蝕真菌的抑菌率達(dá)到85.4%。從表3可以看出來(lái),影響微波提取最大的因素是溶劑,可見(jiàn)不同溶劑的使用對(duì)微波提取物的抑菌效果產(chǎn)生了很大的影響。

表3 半枝蓮微波提取物(8.00 mg·mL－1)的抑菌數(shù)據(jù)Table 3 Antimicrobial data of microwave extracts from Forsythia suspensa(8.00 mg·m L－1)

2.1.2 微波提取條件下木通抑菌數(shù)據(jù)

木通微波提取液在8.00 mg·m L－1濃度下對(duì)真菌抑制結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出,在微波功率為400 W,提取時(shí)間為5 min,料液比為5∶70,溶劑為丙酮時(shí),提取物濃度配置為8.00 mg·m L－1下,對(duì)柑橘炭疽真菌的抑菌率達(dá)到88.5%,對(duì)棉花枯萎真菌的抑菌率達(dá)到88.3%,對(duì)小麥全蝕真菌的抑菌率達(dá)到87.7%。從表4數(shù)據(jù)分析,影響微波提取最大的因素也是溶劑,即溶劑對(duì)提取液抑菌影響的較大。

表4 木通(8.00 mg·m L－1)微波提取物的抑菌數(shù)據(jù)Table 4 Bacteriostatic data of microwave extracts fromLonicera japonica(8.00 mg·m L－1)

2.1.3 微波提取條件下連翹抑菌數(shù)據(jù)

連翹微波提取液在8.00 mg·m L－1濃度下對(duì)小麥全蝕真菌抑制結(jié)果見(jiàn)表5。從表5可以看出,連翹微波提取物對(duì)小麥全蝕真菌和柑橘炭疽真菌的抑制效果較好,在溶劑為丙酮時(shí),抑菌率均達(dá)到100%。

表5 連翹(8.00 mg·m L－1)微波提取物對(duì)XMQS的抑菌數(shù)據(jù)Table 5 Antimicrobial data of microwave extracts from Forsythia suspensa(8.00 mg·m L－1)

2.1.4 微波提取條件下忍冬藤抑菌數(shù)據(jù)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案選用3水平4因素正交設(shè)計(jì),忍冬藤微波提取液在8.00 mg·m L－1濃度下對(duì)小麥全蝕真菌抑制結(jié)果見(jiàn)表6。其中從表6可以看出,在用丙酮作為溶劑時(shí),忍冬藤微波提取物對(duì)3種真菌的抑菌率均達(dá)到了100%,可見(jiàn),溶劑對(duì)本研究提取物的抑菌具有很大的影響。

表6 忍冬藤(8.00 mg·m L－1)微波提取物對(duì)XMQS的抑菌數(shù)據(jù)Table 6 Bacteriostatic data of microwave extracts from Lonicera japonica(8.00 mg·m L－1)

2.2 中草藥微波提取物最優(yōu)條件下抑菌效果

2.2.1 半枝蓮微波提取物最優(yōu)條件下抑菌效果

采用上述半枝蓮微波提取物的最優(yōu)條件,研究半枝蓮提取液的濃度分別在1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg·m L－16個(gè)濃度下對(duì)小麥全蝕真菌的抑制結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可以看出,隨著濃度的增大,抑菌率升高,但擬合數(shù)據(jù)可以看出,數(shù)據(jù)并沒(méi)有很好的符合線(xiàn)性關(guān)系。

圖1 半枝蓮濃度對(duì)抑菌率的影響Fig.1 Effect of optimum concentration of Scutellaria barbata on Bacteriostatic rate

2.2.2 木通微波提取物最優(yōu)條件下抑菌效果

采用上述木通微波提取物的最優(yōu)條件,研究木通提取液的濃度 分 別在1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg·m L－16 個(gè)濃度下對(duì)小麥全蝕真菌的抑制結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可以看出,隨著濃度的增大,抑菌率升高。

圖2 最優(yōu)條件木通濃度對(duì)抑菌率的影響Fig.2 Effect of the optimum concentration of Akebia quinate on the bacteriostatic rate

2.2.3 連翹微波提取物半致死濃度的求算

取連翹微波最優(yōu)方案提取液,在1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg·m L－16個(gè)濃度下對(duì)小麥全蝕真菌進(jìn)行抑制。通過(guò)濃度對(duì)數(shù)X與抑菌率機(jī)率值Y的關(guān)系做出的線(xiàn)性回歸分析,見(jiàn)圖3。從圖3可以看出,當(dāng)R2＝0.977 3時(shí),可得到線(xiàn)性回歸方程Y＝3.673 1X＋3.298 0。當(dāng)抑菌率機(jī)率值Y＝5時(shí),可得到濃度對(duì)數(shù)X＝0.463 4,即EC50(有效中濃度)為2.91 mg·m L－1。從EC50來(lái)分析,連翹對(duì)小麥全蝕真菌抑制效果較好。

圖3 連翹濃度對(duì)數(shù)X 與抑制率機(jī)率值Y 的關(guān)系Fig.3 Relation between logarithm X of Forsythia suspensa concentration and probability Y of inhibition rate

2.2.4 忍冬藤微波提取物半致死濃度的求算

取忍冬藤微波最優(yōu)方案提取液,在1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mg·m L－16 個(gè)濃度下對(duì)小麥全蝕真菌的抑制結(jié)果如圖4。從圖4可以看出來(lái),忍冬藤丙酮提取液對(duì)小麥全蝕真菌都隨著濃度的提高抑制作用逐漸增強(qiáng),當(dāng)濃度達(dá)到10.00 mg·m L－1時(shí)對(duì)小麥全蝕真菌都能達(dá)到97%以上。

從圖4可以看出,當(dāng)R2＝0.932 0時(shí),可得到線(xiàn)性回歸方程Y＝3.219 4X＋3.566 5。當(dāng)抑菌率機(jī)率值Y＝5時(shí),可得到濃度對(duì)數(shù)X＝0.445 3,EC50(有效中濃度)為2.79 mg·mL－1。從EC50來(lái)分析,忍冬藤丙酮微波提取物對(duì)小麥全蝕抑菌效果最好。

圖4 忍冬藤濃度對(duì)數(shù)X 與抑制率機(jī)率值Y 的關(guān)系Fig.4 Relation between logarithm X of Lonicera japonica concentration and probability Y of inhibition rate

2.3 生根活性數(shù)據(jù)

采取8.00 mg·m L－1的中草藥提取液進(jìn)行稀釋200 倍液,對(duì)種子進(jìn)行萌發(fā)生根,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表7。從表7的數(shù)據(jù)可以看出,4種中草藥提取液對(duì)小麥種子的生根具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用,在主根長(zhǎng)和側(cè)根長(zhǎng)上,半枝蓮提取液的效果最高,主根促進(jìn)率達(dá)到11.11%,側(cè)根長(zhǎng)促進(jìn)率達(dá)到9.81%。在種子的莖高上呈現(xiàn)出的促進(jìn)作用并不明顯,甚至忍冬藤在莖高上出現(xiàn)了負(fù)增長(zhǎng)。

表7 中草藥微波提取物對(duì)小麥種子生根數(shù)據(jù)Table 7 Effect of microwave extract of Chinese herbal medicine on rooting of wheat seeds

3 結(jié) 論

以4種中草藥為試材,以抑菌活性和生根活性為指標(biāo),采用微波提取方式進(jìn)行提取,采用室內(nèi)抑制菌絲生長(zhǎng)速率法對(duì)各個(gè)提取物進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),采取瓊脂生根法對(duì)提取液進(jìn)行生根活性測(cè)定,結(jié)果表明,4種中草藥提取物的抑菌活性在不同微波條件下抑菌率不等,忍冬藤微波提取物對(duì)3種真菌的抑制在丙酮作為溶劑時(shí)達(dá)到了100%,其中連翹微波提取物對(duì)小麥全蝕真菌的半致死率濃度為2.91 mg·m L－1,忍冬藤微波提取物對(duì)小麥全蝕真菌的半致死率濃度為2.79 mg·m L－1。半枝蓮微波提取物對(duì)柑橘炭疽真菌的抑菌率也可達(dá)90.4%,木通微波提取物對(duì)柑橘炭疽真菌的抑菌率可達(dá)88.5%,對(duì)小麥全蝕真菌的抑菌率可達(dá)87.7%。4味中草藥提取液對(duì)種子的萌發(fā)生根具有較強(qiáng)的活性,這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)可以為中草藥應(yīng)用于農(nóng)業(yè)殺菌劑提供有利的數(shù)據(jù)支持。