非小細(xì)胞肺癌中PD1/PD-L1信號通路與EGFR突變的相關(guān)性研究*

孔令慧,王金花△,郭志娟,呼斯冷,牟永平,楊鵬杰

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院 1.病理科；2.檢驗科；3.胸外科，呼和浩特 010020)

非小細(xì)胞肺癌(nonsmall-cell lung cancer，NSCLC)是肺癌的主要類型，隨著靶向治療藥物的研發(fā)，NSCLC患者生存期延長，但受多方面因素影響，部分中晚期NSCLC患者短期病死率仍較高。有研究表明，表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)是NSCLC重要的驅(qū)動基因，EGFR突變可引起腫瘤細(xì)胞生長、繁殖及修復(fù)，并可促進(jìn)新生血管生成，增加化療難度，為腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移提供有利條件[1-2]。而目前有關(guān)EGFR基因突變的發(fā)生機(jī)制及誘因尚未明確，不利于靶向治療的合理實施。探討與EGFR突變相關(guān)的指標(biāo)對及早評估患者腫瘤進(jìn)展風(fēng)險并實施針對性治療具有重要意義。大量研究證實，免疫系統(tǒng)在NSCLC患者治療獲益及預(yù)后中發(fā)揮著重要作用，可誘發(fā)腫瘤驅(qū)動基因突變，引起藥物耐受，增加腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力[3-4]。由此推測，腫瘤免疫相關(guān)分子水平與腫瘤驅(qū)動基因突變具有一定的關(guān)系。基于此，本研究觀察了NSCLC中細(xì)胞程序性死亡分子1/細(xì)胞程序性死亡分子1配體(PD1/PD-L1)信號通路與EGFR突變的相關(guān)性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月至2020年6月本院收治的NSCLC患者113例作為研究對象，其中男79例，女34例；年齡56～79歲，平均(65.94±5.49)歲；有吸煙史85例；有飲酒史81例；有高血壓史12例；有糖尿病史11例；有高血脂史17例；分型：腺癌69例，鱗癌32例，腺鱗癌12例；TNM分期[5]：Ⅱ期20例，Ⅲ期58例，Ⅳ期35例；病程1～3年，平均(1.85±0.57)年；腫瘤最大徑2～6 cm，平均(3.97±0.44)cm；合并胸內(nèi)播散11例；合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移6例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，并經(jīng)手術(shù)標(biāo)本病理學(xué)檢查確診；(2)初次發(fā)病；(3)意識清晰，可配合完成相關(guān)治療及檢查；(4)對本研究知情，并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)入組前接受過免疫治療、靶向治療；(2)合并自身免疫系統(tǒng)疾病；(3)入組前接受過放療或化療；(4)合并慢性或急性感染；(5)合并其他部位腫瘤。本研究獲醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1資料收集

于患者入院時收集患者一般資料，包括年齡、性別、吸煙史、分型、TNM分期、病程、腫瘤最大徑、合并胸內(nèi)播散情況、合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況等。其中TNM分期、合并胸內(nèi)播散情況、合并遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況通過病理學(xué)檢查結(jié)合X線檢查評估，腫瘤最大徑通過X線片及術(shù)后病理檢查評估。

1.2.2PD1/PD-L1檢測

取患者癌組織甲醛固定、石蠟包埋標(biāo)本，以4 μm連續(xù)切片，烤片，脫蠟。在0.3%過氧化氫溶液中孵育10 min，置于枸櫞酸鹽緩沖液中修復(fù)。采用北京中杉金橋公司提供的En Vision免疫組織化學(xué)試劑盒及抗體檢測PD1/PD-L1，采用En Vision二步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測，操作按試劑盒說明書進(jìn)行，以磷酸鹽緩沖溶液代替一抗作為空白對照。染色結(jié)果由2名經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師進(jìn)行評估，陽性細(xì)胞百分比計分標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞比例小于10%計1分，10%～50%計2分，>50%計3分。染色強(qiáng)度計分標(biāo)準(zhǔn)：無著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。二者評分乘積大于或等于3分為陽性表達(dá)，<3分陰性表達(dá)。

1.2.3EGFR突變評估

取患者癌組織甲醛固定、石蠟包埋標(biāo)本評估EGFR突變情況，DNA提取試劑盒由美國Omega公司提供，采用Primer5.0軟件設(shè)計引物，引物序列參照DNA提取試劑盒，設(shè)計好的引物由上海Invitrogen公司合成。設(shè)計出的引物序列為21外顯子上游引物：5′-GCT CAG AGC CTG GCA TGA AC-3′下游引物：5′-CAT CCT CCC CTG CAT GTG TT-3′。19外顯子上游引物：5′-GTG CAT CGC TGG TAA CAT CC-3′，下游引物：5′-TCT GGA GAT GAG CAG GGT CT-3′。18外顯子上游引物：5′-TCC AAA TGA GCT GGC AAG TG-3′，下游引物：5′-TCC CAA ACA CTC AGT GAA AC-3′。提取癌組織DNA后檢測DNA濃度與純度，采用美國ABI97型聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增儀檢測EGFR基因突變情況，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照儀器說明書，反應(yīng)體系：2.5 Utaq DNA，250 μm脫氧核糖核苷三磷酸，2 mmol/L氯化鎂，上下游引物各0.3 μmol/L。反應(yīng)條件：94 ℃反應(yīng)5 min，94 ℃反應(yīng)60 s，57 ℃退火60 s，72 ℃反應(yīng)1 min，反復(fù)循環(huán)30次。取反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，以2%瓊脂糖凝膠電泳觀察各條帶大小，剪取正確條帶，純化后行酶切反應(yīng)。反應(yīng)體系：0.15 μL Exon-1酶，0.35 μL雙蒸水，4 μL反應(yīng)產(chǎn)物，0.5 μL 蝦堿酶，酶切條件：37 ℃恒溫反應(yīng)60 min，72 ℃反應(yīng)15 min。循環(huán)反應(yīng)后進(jìn)行測序分析，統(tǒng)計EGFR突變情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

表1 自變量賦值情況

2 結(jié) 果

2.1 一般資料及PD1/PD-L1水平

113例患者中發(fā)生EGFR突變41例(36.28%，EGFR突變組)，未發(fā)生EGFR突變72例(63.72%，未發(fā)生EGFR突變組)，EGFR突變組患者中21號外顯子突變22例，18號外顯子突變12例，19號外顯子突變5例，18號和19號外顯子共突變2例；EGFR突變組TNM分期與未發(fā)生EGFR突變組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；EGFR突變組患者女性、合并胸內(nèi)播散、PD1/PD-L1陽性占比均高于未發(fā)生EGFR突變組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩組患者年齡、吸煙史、飲酒史、高血壓史、糖尿病史、高血脂史、腫瘤分型、病程、腫瘤最大徑、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組患者一般資料及PD1/PD-L1水平比較

續(xù)表2 兩組患者一般資料及PD1/PD-L1水平比較

2.2 PD1/PD-L1信號通路與EGFR突變的關(guān)系

性別(女性)、TNM分期(Ⅳ期)、合并胸內(nèi)播散、PD1/PD-L1陽性均與EGFR突變的發(fā)生有關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 PD1/PD-L1信號通路與EGFR突變的關(guān)系

2.3 EGFR突變的相關(guān)因素

性別、TNM分期、胸內(nèi)播散、PD1/PD-L1均與EGFR突變的發(fā)生相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 EGFR突變的相關(guān)因素(r)

2.4 PD1/PD-L1信號通路對EGFR突變的預(yù)測效能

PD1/PD-L1用于預(yù)測EGFR突變的AUC為0.772(95%可信區(qū)間：0.683～0.861，P=0.001)。見圖1。特異度為0.045，靈敏度為0.878，約登指數(shù)為0.667。

圖1 PD1/PD-L1信號通路預(yù)測EGFR突變的ROC曲線

3 討 論

免疫系統(tǒng)與惡性腫瘤的發(fā)病及病情發(fā)展均密切相關(guān)，免疫系統(tǒng)可影響惡性腫瘤患者治療獲益及預(yù)后，主要機(jī)制為免疫系統(tǒng)可發(fā)揮免疫效應(yīng)，對腫瘤細(xì)胞具有殺傷效果，可協(xié)助治療，共同清除腫瘤細(xì)胞[7-8]。此外，腫瘤細(xì)胞具有免疫逃逸機(jī)制，可抵抗免疫系統(tǒng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果[9]。免疫檢查點(diǎn)對控制免疫反應(yīng)具有關(guān)鍵作用，可為腫瘤的靶向治療提供新靶點(diǎn)。

有研究表明，PD1/PD-L1是NSCLC患者的有效免疫治療靶點(diǎn)之一，并可反饋患者驅(qū)動基因突變的靶向治療敏感程度[10]。因此，對PD1/PD-L1進(jìn)行研究尤為必要。本研究結(jié)果顯示，EGFR突變組PD1/PD-L1陽性占比明顯高于未發(fā)生EGFR突變組，經(jīng)回歸分析檢驗結(jié)果顯示，女性、TNM分期為Ⅳ期、合并胸內(nèi)播散、PD1/PD-L1陽性均與EGFR突變的發(fā)生有關(guān)；經(jīng)Kendall′s tau-b相關(guān)性分析檢驗結(jié)果顯示，性別、TNM分期、胸內(nèi)播散、PD1/PD-L1均與EGFR突變的發(fā)生密切相關(guān)。其中女性被證實有更高風(fēng)險發(fā)生EGFR突變，但相關(guān)機(jī)制尚未明確，可能與遺傳、環(huán)境暴露、激素改變等多種因素有關(guān)[11-12]。TNM分期高及合并胸內(nèi)播散患者腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力強(qiáng)，并有新生血管形成，存在相關(guān)基因突變的風(fēng)險較高[13]。而EGFR突變被證實是NSCLC突變的最常見基因之一，與上述病理特征的聯(lián)系較密切[14]。而相關(guān)研究表明，有一定比例女性NSCLC患者、高分期患者或胸內(nèi)播散患者經(jīng)檢測證實未發(fā)生EGFR突變，因此，性別比例及病理特征仍不能用于有效預(yù)測EGFR突變風(fēng)險，仍有待于探討其他有效指標(biāo)[15-16]。

PD-1屬免疫球蛋白B7-CD28家族成員，在人體的活化免疫細(xì)胞中表達(dá)，包括自然殺傷T淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等[17]。在惡性腫瘤患者中PD-1可呈異常高表達(dá)。PD-L1是PD-1的主要配體，在腫瘤細(xì)胞中也呈異常高表達(dá)。國外有研究已證實，EGFR突變與PD-1及PD-L1密切相關(guān)[18]。PD-1可與PD-L1結(jié)合，通過PD1/PD-L1通路降低CD8+T淋巴細(xì)胞及CD4+T淋巴細(xì)胞活性，并抑制二者增殖，進(jìn)而抑制腫瘤局部微環(huán)境中T淋巴細(xì)胞發(fā)揮作用，對腫瘤的免疫殺傷功能降低，腫瘤易發(fā)生免疫逃逸[19-20]。因此，PD1/PD-L1陽性說明患者腫瘤細(xì)胞免疫耐受能力強(qiáng)，進(jìn)展為突變腫瘤細(xì)胞的風(fēng)險較高。

基于上述分析，推測PD1/PD-L1可用于預(yù)測EGFR突變風(fēng)險，本研究繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者PD1/PD-L1用于預(yù)測EGFR突變的AUC≥0.70，具有一定的預(yù)測價值，證實假設(shè)成立。臨床醫(yī)師可根據(jù)患者PD1/PD-L1檢測結(jié)果，對PD1/PD-L1陽性患者應(yīng)用免疫治療藥物及EGFR靶向藥物，以進(jìn)一步提高患者治療獲益。此外，有關(guān)研究還表明，不吸煙或輕度吸煙與惡性腫瘤患者EGFR突變的發(fā)生密切相關(guān)，組織學(xué)分型與EGFR突變的發(fā)生也有關(guān)[21]。而本研究結(jié)果顯示，EGFR突變組無吸煙史、肺腺癌者占比與未發(fā)生EGFR突變組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，可能與本研究納入整體樣本中有吸煙史者占比較高、肺腺癌者納入較少有關(guān)，未來還應(yīng)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步得出研究結(jié)論。因本研究未能觀察NSCLC患者間變性淋巴瘤激酶、大鼠肉瘤病毒癌基因同源物基因突變發(fā)生情況，故結(jié)論尚有局限性，未來還應(yīng)納入NSCLC患者觀察多基因突變情況，并分析相關(guān)指標(biāo)，以進(jìn)一步為臨床靶向藥物的應(yīng)用提供參考。

綜上所述，NSCLC患者EGFR突變風(fēng)險較高，與PD1/PD-L1陽性密切相關(guān)，可將PD1/PD-L1作為EGFR突變的預(yù)測因子，并指導(dǎo)針對性治療的實施，可能對提高NSCLC患者整體治療獲益具有積極意義。