組蛋白去甲基化酶NO66在常見(jiàn)腫瘤中的表達(dá)及臨床意義*

公利鑫，程雙華，段文芳，李靜怡,2，唐茂森

(1.成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院/核工業(yè)四一六醫(yī)院，四川 610051；2.成都醫(yī)學(xué)院，四川 610500)

癌癥是世界公眾健康主要問(wèn)題之一，自2010年以來(lái)癌癥已成為我國(guó)人民最主要的死亡原因。目前，癌癥的治療主要以手術(shù)為主，放化療為輔，療效與癌癥的種類(lèi)及癌癥進(jìn)展快慢密切相關(guān)。

最近有研究表明，組蛋白修飾在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用[1-2]。組蛋白修飾因子的改變導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄程序終止，從而導(dǎo)致細(xì)胞表型發(fā)生劇烈變化。已有文獻(xiàn)報(bào)道，組蛋白甲基化狀態(tài)與癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。組蛋白甲基化可由其甲基化位點(diǎn)不同影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)而不改變 DNA 序列，進(jìn)一步影響轉(zhuǎn)錄因子對(duì)基因啟動(dòng)子區(qū)域的訪問(wèn)，影響轉(zhuǎn)錄功能，最終影響基因表達(dá)。染色質(zhì)組蛋白修飾被認(rèn)為是調(diào)控基因表達(dá)的第二遺傳密碼，甲基化修飾通常發(fā)生在組蛋白N端，將被一系列特定蛋白所識(shí)別，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因表達(dá)的調(diào)節(jié)[4]。截止目前，已發(fā)現(xiàn)的組蛋白去甲基化酶(Jumonji domain-containing histone demethylase,JMJD)主要有兩類(lèi)，一類(lèi)是含 A-mino oxidase 結(jié)構(gòu)域的賴(lài)氨酸特異性去甲基化酶家族[5]；另一類(lèi)是含 Jumonji C特征結(jié)構(gòu)域的JMJD家族[6]。JMJD家族是一類(lèi)重要的去甲基化酶，可催化組蛋白H3多個(gè)位點(diǎn)賴(lài)氨酸的去甲基修飾，從而調(diào)節(jié)特定基因表達(dá)[7]。Jumonji C結(jié)構(gòu)域含氧蛋白屬于一個(gè)具有不同底物特異性的加氧酶家族，參與調(diào)控不同的生物過(guò)程，如基因轉(zhuǎn)錄、RNA加工和翻譯[8]。

NO66是JMJD家族成員之一，以四聚體形式組裝，在細(xì)胞核和核仁中均有發(fā)現(xiàn)[9]。識(shí)別賴(lài)氨酸4、36作為底物，并抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄基因[10]，且已有文獻(xiàn)報(bào)道，NO66與致癌轉(zhuǎn)錄因子——MYC原癌基因(MYC Proto-Oncogene，c-MYC)相互作用，促進(jìn)以c-MYC為中心的致癌轉(zhuǎn)錄程序[11]。c-MYC在大多數(shù)人類(lèi)惡性腫瘤中均高表達(dá)，而且其表達(dá)還與腫瘤的侵襲性密切相關(guān)[12]。此外，NO66還催化60S核糖體蛋白L8(ribosomal protein L8,RPL8)等蛋白質(zhì)的組氨酸羥基化[13]，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成。另有研究表明，NO66與zeste同源物2增強(qiáng)子相互作用，zeste同源物2是致癌多梳抑制復(fù)合物2的重要組成部分，并協(xié)調(diào)調(diào)控胚胎干細(xì)胞中的靶基因單元格[14]?；谶@些發(fā)現(xiàn)，可以設(shè)想NO66在人類(lèi)惡性腫瘤中作為一種腫瘤特異性組蛋白修飾物發(fā)揮作用。

目前，已有諸多研究表明，NO66在結(jié)直腸癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤中發(fā)揮著重要作用。在結(jié)腸癌細(xì)胞中敲除NO66基因后發(fā)現(xiàn)，癌細(xì)胞增殖能力及遷移能力顯著降低。數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，NO66與腫瘤的轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，但其機(jī)制并不清楚[15]。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的關(guān)鍵致瘤因子。敲低NO66基因后降低了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中EGFR的表達(dá)和細(xì)胞增殖能力。NO66是EGFR表達(dá)和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖所必需的，高水平NO66表達(dá)也可預(yù)測(cè)患者預(yù)后不良。NO66與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展已有相關(guān)報(bào)道，但其研究較少見(jiàn)，因此，NO66具有重要的研究意義。

1 材料與方法

1.1 材料

人前列腺癌細(xì)胞PC-3、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549、人肝癌細(xì)胞HepG2、 人膠質(zhì)瘤細(xì)胞LN229、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116均為本課題保種。收集結(jié)腸癌組織樣本20例，前列腺癌組織樣本14例，肝癌組織樣本18例，肺癌組織樣本20例，膠質(zhì)瘤樣本5例。鼠抗人NO66單克隆抗體、山羊抗鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自以色列BI公司，化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence，ECL)購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，蘇木素、伊紅均購(gòu)自武漢塞維爾公司，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)免疫組織化學(xué)(免疫組化)試劑盒購(gòu)自南京建成公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞置于DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)，生長(zhǎng)至90%左右融合度時(shí)傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2Western blot檢測(cè)細(xì)胞NO66蛋白水平

取收集的細(xì)胞加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白水平，取20 μg蛋白煮沸變性10 min，十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺電泳，轉(zhuǎn)入聚偏氟乙烯膜，加入脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗(1∶200)孵育過(guò)夜，加入二抗(1∶10 000)孵育2 h，以GAPDH為內(nèi)參，ECL法發(fā)光顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.2.3蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色

將臨床組織石蠟包埋樣本切片后通過(guò)烤片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇復(fù)水(無(wú)水乙醇-70%乙醇)、蘇木素染色3 min和伊紅染色1 min，中性樹(shù)脂封片。

1.2.4免疫組化染色

將臨床組織石蠟包埋樣本切片后烤片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇復(fù)水(無(wú)水乙醇-70%乙醇)、過(guò)氧化氫(3%)封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶30 min、抗原修復(fù)、胎牛血清封閉1 h、孵育一抗過(guò)夜、二抗1 h、DAB顯色、蘇木精染色、中性樹(shù)脂封片。病理評(píng)分由核工業(yè)四一六醫(yī)院病理科完成。

1.3 預(yù)后及臨床意義分析

通過(guò)腫瘤和癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)分析NO66表達(dá)高低與結(jié)腸癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、膠質(zhì)瘤患者生存率、腫瘤分級(jí)分期和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 5種常見(jiàn)腫瘤組織NO66蛋白表達(dá)

結(jié)腸癌組織NO66表達(dá)最高，前列腺癌組織NO66中度表達(dá)，肺癌、肝癌組織NO66不表達(dá)。見(jiàn)圖1、表1～4。由于膠質(zhì)瘤組織樣本較少，參考意義不大，但已有研究表明，NO66在膠質(zhì)瘤中具有重要作用。

A：HE染色(200×)；B：免疫組化(400×)。圖1 5種常見(jiàn)腫瘤組織NO66 HE染色、免疫組化結(jié)果

表1 結(jié)腸癌組織NO66蛋白表達(dá)及與病理特征的關(guān)系(n)

表2 前列腺癌組織NO66蛋白表達(dá)及與病理特征的關(guān)系(n)

表3 肝癌組織NO66蛋白表達(dá)及與病理特征的關(guān)系(n)

表4 肺癌組織NO66蛋白表達(dá)及與病理特征的關(guān)系(n)

續(xù)表4 肺癌組織NO66蛋白表達(dá)及與病理特征的關(guān)系(n)

2.2 5種常見(jiàn)腫瘤細(xì)胞NO66蛋白表達(dá)

結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞NO66高表達(dá)，前列腺癌PC-3細(xì)胞NO66表達(dá)次之，肺癌A549細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞NO66不表達(dá)。見(jiàn)圖2。

圖2 5種常見(jiàn)腫瘤細(xì)胞N066蛋白表達(dá)

2.3 33種腫瘤NO66表達(dá)分析

為探索NO66在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的作用，通過(guò)泛癌分析方法分析了NO66在33種腫瘤中的表達(dá)，見(jiàn)圖3A。與正常數(shù)據(jù)比較，14種腫瘤NO66表達(dá)明顯上調(diào)，包括結(jié)腸癌(COAD)、肝癌(LIHC)、肺鱗癌(LUSC)、肺腺癌(LUAD)和膠質(zhì)瘤(GBM)，3種腫瘤NO66表達(dá)明顯下調(diào)。除前列腺癌NO66表達(dá)無(wú)差異外，其余5種腫瘤NO66表達(dá)均明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3B～G。

A：NO66基于TCGA腫瘤與正常數(shù)據(jù)的表達(dá)分析；B～G：NO66基于TCGA與GTEx數(shù)據(jù)的表達(dá)分析；a：P<0.05，與正常數(shù)據(jù)比較。圖3 33種腫瘤NO66表達(dá)分析

2.4 NO66評(píng)估腫瘤患者預(yù)后的價(jià)值

NO66對(duì)結(jié)腸癌、前列腺癌、肝癌、肺鱗癌、肺腺癌、膠質(zhì)瘤等6種腫瘤患者總生存期(overall survival，OS)和無(wú)復(fù)發(fā)生存期(recurrence-free survival,RFS)的影響見(jiàn)圖4、5。6種腫瘤患者中只有膠質(zhì)瘤患者NO66表達(dá)增加，提示OS、RFS預(yù)后不良，見(jiàn)圖4F、5F。

圖4 NO66對(duì)6種腫瘤患者OS的影響

圖5 NO66對(duì)6種腫瘤患者RFS的影響

2.5 NO66在膠質(zhì)瘤中的臨床價(jià)值

NO66高表達(dá)腫瘤惡性程度高、預(yù)后差。見(jiàn)表5。

表5 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)確定的NO66與膠質(zhì)瘤的臨床基本信息

2.6 NO66與膠質(zhì)瘤中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系

不同拷貝數(shù)NO66在膠質(zhì)瘤(GBM)中的浸潤(rùn)程度見(jiàn)圖6A。不同拷貝數(shù)NO66在膠質(zhì)瘤的免疫細(xì)胞——T淋巴細(xì)胞與巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)水平有明顯變化。NO66表達(dá)水平與巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞浸潤(rùn)均呈明顯正相關(guān)。見(jiàn)圖6B～G。

A：不同拷貝數(shù)NO66在膠質(zhì)瘤(GBM)中的浸潤(rùn)程度；B～G：膠質(zhì)瘤NO66表達(dá)水平與B細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性。圖6 NO66與膠質(zhì)瘤中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系

3 討 論

JMJD蛋白家族中有17種酶被認(rèn)為是組蛋白去甲基化酶。盡管這些家族成員中的一些如JMJD2、JARID被認(rèn)為是有前途的候選靶點(diǎn)，但其在實(shí)體腫瘤中的有效性和不良反應(yīng)仍存在爭(zhēng)議。本研究重點(diǎn)探討了JMJD家族中的一種NO66，該酶已被證實(shí)與致癌轉(zhuǎn)錄因子——c-MYC協(xié)同工作[11]，并且與RPL8關(guān)系密切[16-17]，提示其可能是一種關(guān)鍵性的腫瘤標(biāo)志物。

本研究通過(guò)免疫組化方法確定NO66在腫瘤組織樣本中的基本表達(dá)情況后，后續(xù)又通過(guò)Western blot試驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證，得到NO66在結(jié)腸癌組織、前列腺癌組織中有較高表達(dá)的結(jié)論。后續(xù)的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果沒(méi)有達(dá)到預(yù)想的結(jié)果，反而在表達(dá)不高的膠質(zhì)瘤中具有一定的生物標(biāo)志物價(jià)值。但也不影響NO66作為一個(gè)重要標(biāo)志物參與癌癥的發(fā)生過(guò)程的結(jié)論。目前，對(duì)NO66的研究國(guó)內(nèi)外均較少見(jiàn)，作為一個(gè)新的標(biāo)志物，毫無(wú)疑問(wèn)其前途是很寬廣的，后續(xù)會(huì)繼續(xù)開(kāi)展相關(guān)研究，深入探討NO66的作用機(jī)制。

為進(jìn)一步了解NO66參與腫瘤發(fā)生中的過(guò)程，本研究統(tǒng)計(jì)了大量患者在生存率、病理分級(jí)、分期方面的數(shù)據(jù)，遺憾的是，NO66表達(dá)高低與以上病理指標(biāo)少有關(guān)系，得出的唯一結(jié)論是與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，NO66在膠質(zhì)瘤中通過(guò)激活EGFR和c-MYC的表達(dá)，促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖[18]。已知NO66是一個(gè)多聚體，多聚體的結(jié)構(gòu)是否是其發(fā)揮重要作用的必要條件，查閱文獻(xiàn)后得知，當(dāng)NO66以四聚體形式組裝時(shí)對(duì)RPL8的羥基化催化效率最高。以各種方式破壞四聚體組裝會(huì)導(dǎo)致催化活性的損失。NO66的低聚化可能會(huì)影響催化過(guò)程中每個(gè)亞基的運(yùn)動(dòng)，從而控制活性。大量研究證實(shí)，腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)可影響放化療和免疫治療的療效和患者預(yù)后[19-20]。本研究結(jié)果顯示，免疫細(xì)胞增多與NO66表達(dá)水平呈正相關(guān)，包括膠質(zhì)瘤中的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞。表明腫瘤免疫浸潤(rùn)可能部分揭示了NO66介導(dǎo)膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展，提示NO66可作為膠質(zhì)瘤一個(gè)關(guān)鍵的生物標(biāo)志物。

綜上所述，本研究闡述了NO66在多種類(lèi)型腫瘤中高表達(dá)(包括膠質(zhì)瘤)，并且與膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)。此外，本研究還表明，NO66可能通過(guò)增加腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)發(fā)揮致癌作用，然而這些結(jié)果還需在未來(lái)得到更多的基礎(chǔ)和臨床研究驗(yàn)證。