A型塞內(nèi)卡病毒VP1蛋白的原核表達(dá)及純化

杜文琪，夏立葉，李桂梅，2，3，單 虎，2，3

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，青島 266109；2.山東省新獸藥創(chuàng)制協(xié)同創(chuàng)新中心，青島 266109；3.山東省獸藥診斷試劑工程技術(shù)研究中心，青島 266109)

豬塞內(nèi)卡病毒病是由A型塞內(nèi)卡病毒(Seneca virus A,SVA)引起的豬發(fā)生水皰性相關(guān)疾病的傳染性疾病[1]。SVA可感染不同品種和年齡的豬，仔豬感染后死亡率高，成年豬感染后癥狀不明顯，育肥豬感染后出現(xiàn)生產(chǎn)停滯，飼料轉(zhuǎn)化率降低。SVA最早于2002年在美國(guó)首次分離到，早期研究顯示該病毒對(duì)人和動(dòng)物無(wú)致病性[2-3]。2008和2012年分別于加拿大和美國(guó)在感染了水皰病的豬中發(fā)現(xiàn)了SVA。2014和2015年，研究發(fā)現(xiàn)SVA感染與母豬水皰病(SVD)的暴發(fā)及巴西和美國(guó)的新生豬死亡率有關(guān)[2]。隨后美國(guó)、澳大利亞、意大利、巴西、哥倫比亞、泰國(guó)等均有相關(guān)報(bào)道[4]。2015年，中國(guó)廣東地區(qū)養(yǎng)豬場(chǎng)出現(xiàn)了豬塞內(nèi)卡病毒病，隨后湖南、河南、福建、黑龍江等地均有相關(guān)報(bào)道[5]。SVA是小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)塞內(nèi)卡病毒屬(Senecavirus)中唯一一種病毒，基因組長(zhǎng)約為7.3 kb,包括1個(gè)大的開放閱讀框(ORF)、5′-端非翻譯區(qū)(5′-UTR)和多腺苷酸化的3′-端非翻譯區(qū)(3′-UTR)[6]。SVA的衣殼蛋白主要由VP1、VP2、VP3和VP4 4種結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成,其中VP1和VP2蛋白決定塞內(nèi)卡病毒的細(xì)胞嗜性，VP1和VP3蛋白決定塞內(nèi)卡病毒的抗原性，此外VP2和VP4蛋白參與塞內(nèi)卡病毒的核酸包裝。VP1最具抗原性,可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[7]，常被用作SVA診斷試劑的研制。

SVA臨床癥狀與豬水皰病、口蹄疫(FMD)等水皰性疾病難以區(qū)分，且尚無(wú)商品化疫苗，給SVA的防控工作帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。目前，在血清學(xué)方面可用于SVA篩查的抗體檢測(cè)方法主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、間接免疫熒光抗體試驗(yàn)(indirect immunofluorescenct antibody test，IFA)和病毒中和試驗(yàn)(virus neutralization test，VN)，但耗時(shí)久、需樣本量大、花費(fèi)成本高，且在單個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)多種分析物的能力受到限制[8]。液相芯片也稱為微球體懸浮芯片，是1995年美國(guó) Luminex公司基于xMAP(flexible multi analyte profiling)技術(shù)研發(fā)的新型生物芯片技術(shù)平臺(tái)，其檢測(cè)更加開放靈活，能同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣品的多個(gè)目標(biāo)，可確保數(shù)小時(shí)內(nèi)獲得更靈敏的檢測(cè)結(jié)果，且僅需極少量的樣品，具有常規(guī)方法無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)[9]。本研究旨在原核表達(dá)可溶性SVA的VP1蛋白，將其純化后與熒光微球進(jìn)行偶聯(lián)，初步建立SVA抗體單重液相芯片檢測(cè)方法，以期為后續(xù)完成其評(píng)估性試驗(yàn)以及實(shí)現(xiàn)SVA與其他相似疾病的鑒別診斷奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(TaKaRa公司)；原核表達(dá)載體pCold TF質(zhì)粒由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 SanPrep 柱式質(zhì)粒DNA 小量抽提試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)；IPTG(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司)；His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒、增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)；抗His單克隆抗體、預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及SDS-PAGE上樣緩沖液(北京索來(lái)寶科技有限公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；磁珠檢測(cè)平底板、96 孔板避光封板膜、Bio-Plex 偶聯(lián)試劑盒、Bio-Plex 羧基磁珠(MC10044)、EDC和S-NHS、Bio-Plex 檢測(cè)反應(yīng)試劑盒(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司)；生物素化的抗His單克隆抗體(6×His Tag Monoclonal Antibody，Biotin)(Invitrogen公司)；SVA 陽(yáng)性血清及陰性血清均為青島農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 根據(jù)GenBank收錄的塞內(nèi)卡病毒VP1基因序列(登錄號(hào)：KY747514.1)，在不影響VP1蛋白氨基酸序列的前提下，對(duì)該序列進(jìn)行分析和密碼子優(yōu)化，同時(shí)構(gòu)建pColdⅠ-VP1重組載體，由中美泰和生物技術(shù)有限公司合成和測(cè)序。用NedⅠ和PstⅠ對(duì)pColdⅠ-VP1原核表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，37 ℃水浴酶切4 h，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離后回收目的基因VP1。利用連接酶將目的基因VP1連接于表達(dá)載體pCold TF中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素的LB平板過夜培養(yǎng)，挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，提取質(zhì)粒。構(gòu)建pCold TF-VP1原核表達(dá)質(zhì)粒，將采用雙酶切方法鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.2.2 VP1重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 將陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，加入LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)1 h。離心棄部分上清液，取100 μL混勻的細(xì)菌溶液涂布于含氨芐青霉素的LB平板37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，菌液于-80 ℃保存。按1∶100比例將空載體菌液和重組蛋白菌液接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)至D600 nm值為0.6～0.8，每管加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，16 ℃、220 r/min誘導(dǎo)表達(dá)9 h。同時(shí)設(shè)立對(duì)照。誘導(dǎo)結(jié)束后4 ℃、12 000 r/min離心15 min，分別收集菌體，加入適量PBS重懸菌體，分別取10 μL與4×SDS-PAGE上樣緩沖液混合均勻，煮沸10 min，進(jìn)行SDS-PAGE。

1.2.3 VP1重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化 將空載體菌液和VP1重組菌37 ℃、220 r/min 振蕩培養(yǎng)至D600 nm值為0.6～0.8。VP1重組菌分別加入終濃度為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.5 mmol/L的IPTG，空載體菌液加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，同時(shí)設(shè)立對(duì)照，誘導(dǎo)12 h后，收集菌液，處理樣品并進(jìn)行SDS-PAGE，分析最佳IPTG誘導(dǎo)濃度[10-12]。

將空載體菌液和重組蛋白菌液37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至D600 nm值為0.6～0.8。每管加入終濃度為1.2 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，同時(shí)設(shè)立對(duì)照。重組蛋白菌液分別于誘導(dǎo)后3、6、9、12、22和24 h取等量的菌液，處理樣品并進(jìn)行SDS-PAGE，分析最佳的誘導(dǎo)時(shí)間[9-10]。

1.2.4 VP1重組蛋白可溶性分析 使用優(yōu)化的誘導(dǎo)條件培養(yǎng)重組菌體，分別收集菌體加入適量PBS重懸后冰浴超聲破碎。超聲結(jié)束后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，分別收集上清液和菌體沉淀進(jìn)行SDS-PAGE[11-12]。

1.2.5 VP1重組蛋白純化及SDS-PAGE鑒定 在優(yōu)化的誘導(dǎo)條件下大量擴(kuò)增重組菌液，如1.2.4所述制備菌液上清。用Bradford 法測(cè)定蛋白濃度[11]。參照His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒說(shuō)明書純化VP1重組蛋白，收集洗脫峰并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定分析。

1.2.6 VP1重組蛋白Western blotting分析 將純化的VP1重組蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜。以抗His單克隆抗體作為一抗室溫孵育2 h，以山羊抗小鼠IgG作為二抗室溫室溫孵育2 h。用HRP-DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，用凝膠掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)[11-12]。

1.2.7 微球活化和蛋白偶聯(lián) 參照Bio-Plex胺偶聯(lián)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行兩步酰胺反應(yīng)。取100 μL微球(1.25×106珠)轉(zhuǎn)移到偶聯(lián)反應(yīng)管中，注意避光。旋渦混勻后瞬時(shí)離心，于磁力架上沉降1 min并棄掉上清，加入100 μL清洗緩沖液清洗微球，于磁力架上沉降1 min并棄掉上清，將微球重新懸浮在80 μL微球活化緩沖液中，加入10 μL 50 mg/mL EDC，隨后立即加入10 μL 50 mg/mL S-NHS 漩渦混勻。用鋁箔覆蓋偶聯(lián)反應(yīng)管，在室溫下振蕩孵育20 min。用PBS清洗并重懸微球。加入適量SVA VP1蛋白，用PBS定容至500 μL，漩渦混勻后，于4 ℃避光過夜偶聯(lián)。將偶聯(lián)的微球離心并用PBS清洗，加入250 μL的微球封閉緩沖液，在室溫下避光振蕩孵育30 min。PBS清洗微球后，懸浮在150 μL的微球儲(chǔ)存緩沖液中。

1.2.8 偶聯(lián)效率的驗(yàn)證 取2個(gè)偶聯(lián)反應(yīng)管并做好標(biāo)記，1個(gè)作為陰性對(duì)照，1個(gè)作為測(cè)試管。每管分別加入10 000 個(gè)偶聯(lián)的微球。測(cè)試管加入50 μL稀釋的生物素抗體，對(duì)照管中加入50 μL分析緩沖液。室溫避光反應(yīng)30 min。并于磁力架上沉降1 min，緩慢除去上清液。將50 μL稀釋的藻紅蛋白(P-phycoerythrin，PE)標(biāo)記的鏈霉親和素(streptavidin-PE，SA-PE)加入測(cè)試管中，在對(duì)照管中加入50 μL分析緩沖液，室溫避光孵育10 min。磁力架上沉降1 min，緩慢除去上清液。將微球重懸于125 μL微球貯存緩沖液中，并轉(zhuǎn)移到96孔板中，上機(jī)檢測(cè)。

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：陰性對(duì)照(背景)的中值熒光強(qiáng)度(median fluorescence intensity,MFI)<100，偶聯(lián)微球的熒光值>2 000 MFI可認(rèn)為偶聯(lián)成功。

1.2.9 最佳結(jié)合蛋白濃度的確定 將不同含量(6、9、12和15 μg/1.25×106珠)的SVA-VP1蛋白與1.25×106珠微球偶聯(lián)，確定最佳結(jié)合的蛋白濃度。

1.2.10 SVA抗體單重液相芯片檢測(cè)方法的建立 偶聯(lián)好的微球稀釋至5 000個(gè)/孔，96孔平板中每孔加入50 μL稀釋好的微球，于磁力架靜置1 min，使微球完全沉淀后甩去上清。微球清洗緩沖液清洗微球2次，樣本孔對(duì)應(yīng)加入50 μL SVA陰、陽(yáng)性血清，對(duì)照孔中加入50 μL分析緩沖液。避光貼封板，室溫震蕩孵育1 h。結(jié)束后，清洗微球，每孔加入50 μL稀釋好的生物素化的抗His單克隆抗體，避光貼封板，室溫振蕩孵育45 min，完成后清洗微球，每孔加入50 μL稀釋好的SA-PE，避光貼封板，室溫振蕩孵育10 min，完成后清洗微球，每孔加入125 μL儲(chǔ)存緩沖液充分重懸微球，上機(jī)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 6.0軟件分析，采用ANOVA分析。P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

重組質(zhì)粒pCold TF-VP1經(jīng)NedⅠ、PstⅠ雙酶切鑒定，載體片段大小為5 769 bp，目的片段大小為822 bp(圖1)，與預(yù)期大小一致，測(cè)序結(jié)果與目的基因序列一致，結(jié)果證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

M，DL10000 DNA Marker；1～5，重組質(zhì)粒 pCold TF-VP1

2.2 VP1重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

重組蛋白經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，對(duì)誘導(dǎo)前、后菌液及空載體誘導(dǎo)前、后菌液進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，在約82 ku處有一條目的條帶(含標(biāo)簽蛋白52 ku)(圖2)，與預(yù)期大小相符，表明VP1重組蛋白初步表達(dá)成功。

1,未誘導(dǎo)的空載體；2，誘導(dǎo)的空載體；3，未誘導(dǎo)的重組蛋白；4，誘導(dǎo)的重組蛋白；M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

2.3 VP1重組蛋白誘導(dǎo)條件優(yōu)化

由圖3可知，當(dāng)IPTG終濃度為1.2 mmol/L時(shí)，蛋白表達(dá)量最高。由圖4可知，誘導(dǎo)3 h后的蛋白表達(dá)量最高。說(shuō)明16 ℃、220 r/min、1.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)3 h時(shí)表達(dá)結(jié)果最佳。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，誘導(dǎo)的空載體；2，未誘導(dǎo)的空載體；3，未誘導(dǎo)的重組蛋白；4～9，IPTG濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.5 mmol/L

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，誘導(dǎo)的空載體；2，未誘導(dǎo)的空載體；3，未誘導(dǎo)的重組蛋白；4～9，誘導(dǎo)時(shí)間分別為3、6、9、12、22和24 h

2.4 VP1重組蛋白可溶性鑒定

VP1重組蛋白可溶性分析結(jié)果顯示，在約82 ku處有目的條帶，上清和沉淀中均有表達(dá)，且上清中表達(dá)量較高(圖5)，說(shuō)明該蛋白具有可溶性。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，誘導(dǎo)的空載體；2，未誘導(dǎo)的空載體；3，未誘導(dǎo)的重組蛋白全菌液；4，未誘導(dǎo)的重組蛋白上清；5，未誘導(dǎo)的重組蛋白沉淀；6，誘導(dǎo)的重組蛋白全菌液；7，誘導(dǎo)的重組蛋白上清；8，誘導(dǎo)的重組蛋白沉淀

2.5 VP1重組蛋白的純化

根據(jù)最佳誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)VP1重組蛋白大量表達(dá)并用蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化，分別收集洗脫峰進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示在約82 ku處有目的條帶(圖6)，表明成功純化VP1重組蛋白。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，未誘導(dǎo)的空載體；2，誘導(dǎo)的空載體；3，未誘導(dǎo)的重組蛋白；4，誘導(dǎo)的重組蛋白上清；5，流穿液；6，洗滌液；7～9,分別為洗脫液1、2和3

2.6 VP1重組蛋白Western blotting分析

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，純化后重組VP1蛋白能被His單克隆抗體識(shí)別，在約82 ku處有目的條帶(圖7)，與SDS-PAGE中重組VP1蛋白大小一致。

2.7 偶聯(lián)效率驗(yàn)證

偶聯(lián)效率驗(yàn)證結(jié)果顯示，陰性對(duì)照(背景)的平均MFI為17(<100)；測(cè)試孔的平均MFI為2 339.5(>2 000)，證明SVA VP1蛋白與微球偶聯(lián)成功。

2.8 最佳結(jié)合蛋白濃度的確定

將不同含量(6、9、12和15 μg/1.25×106珠)的SVA-VP1蛋白與1.25×106珠微球偶聯(lián)，結(jié)果顯示當(dāng)?shù)鞍诐舛?12 μg/1.25×106珠時(shí)，樣品中的MFI隨著VP1蛋白濃度增加而逐漸升高，當(dāng)?shù)鞍诐舛葹?2 μg/1.25×106珠時(shí)，平均MFI達(dá)到2 689.0，進(jìn)一步升高蛋白濃度并不能增加MFI。不同蛋白濃度下，背景對(duì)照的平均MFI均<100，由此確定出最佳結(jié)合的蛋白濃度為12 μg/1.25×106珠微球(表1)。

表1 不同濃度蛋白MFI

2.9 SVA抗體單重液相芯片檢測(cè)方法的建立

由圖8可知，背景對(duì)照MFI的平均值為23.5，SVA陽(yáng)性血清MFI的平均值為10 172，極顯著高于陰性血清MFI的平均值162.5(P<0.01)，說(shuō)明VP1蛋白偶聯(lián)的熒光微球可用于SVA抗體的檢測(cè)。

①BC，背景對(duì)照；NC，陰性血清；SVA-4×，4倍稀釋陽(yáng)性血清。②與BC相比，**，差異極顯著(P<0.01)

3 討 論

豬塞內(nèi)卡病毒病被認(rèn)為是一種新興的家畜傳染病，近年來(lái)持續(xù)引發(fā)關(guān)注[13]。作為豬水皰病的新病原體，SVA在不同地區(qū)、國(guó)家迅速進(jìn)化和傳播，但早期的塞內(nèi)卡病毒分離株對(duì)豬沒有明顯致病性，而近年來(lái)從巴西、美國(guó)、中國(guó)、加拿大、哥倫比亞和泰國(guó)等國(guó)家的相關(guān)病例報(bào)道可發(fā)現(xiàn)其致病性顯著增強(qiáng)[14-19]，表明塞內(nèi)卡病毒正朝著更強(qiáng)毒力的表型進(jìn)化，應(yīng)引發(fā)高度關(guān)注。為了更好地防控和檢測(cè)塞內(nèi)卡病毒病，開展塞內(nèi)卡病毒病檢測(cè)技術(shù)的相關(guān)研究十分必要[20]。

對(duì)于SVA的防控有賴于對(duì)其準(zhǔn)確快速的檢測(cè)，血清學(xué)方法因操作簡(jiǎn)單、成本較低，常用于流行病學(xué)研究或監(jiān)測(cè)。然而傳統(tǒng)的ELISA、IFA和VN檢測(cè)方法耗時(shí)久、所需樣本量大、且在單個(gè)反應(yīng)中很難同時(shí)將SVA感染與其他類似疾病區(qū)分開來(lái)，因此亟需建立一種靈敏、快速且高通量的抗體檢測(cè)技術(shù)。新型液相芯片技術(shù)的主要優(yōu)勢(shì)在于在簡(jiǎn)單檢測(cè)的基礎(chǔ)上增加了另一個(gè)維度，致力于多重分析技術(shù)。近年來(lái)，研究者致力于液相芯片檢測(cè)技術(shù)在動(dòng)物疫病檢測(cè)方面的研究和應(yīng)用，肖麗等[21]建立同步檢測(cè)偽狂犬病病毒(PRV)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)抗體的雙重液相芯片檢測(cè)方法，與ELISA法相比PRV和PRRSV抗體的最高血清檢出稀釋倍數(shù)分別提高66和32倍。本研究在檢測(cè)抗原的選擇上，SVA VP1蛋白具有高度保守性，且最具抗原性，可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[22-23]，可作為首選。在表達(dá)系統(tǒng)的選擇上，大腸桿菌作為最常用的原核表達(dá)系統(tǒng)，廣泛用于同源和異源蛋白質(zhì)的表達(dá)。重組蛋白在大腸桿菌中包含可溶性和包涵體兩種表達(dá)形式。由于包涵體難溶且不具天然生物活性，在純化過程中操作繁瑣且成本較高。因此本研究采用冷休克表達(dá)載體pCold TF對(duì)于VP1蛋白進(jìn)行表達(dá)，以期增加蛋白產(chǎn)量、純度及可溶性。

本研究利用原核表達(dá)載體對(duì)SVA VP1蛋白進(jìn)行了表達(dá)，并探索研究了誘導(dǎo)表達(dá)過程中誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG濃度幾個(gè)重要誘導(dǎo)條件，利用優(yōu)化后的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件，可在短時(shí)間內(nèi)對(duì)VP1蛋白大量表達(dá)，提高了VP1重組蛋白的表達(dá)效率。本試驗(yàn)借助重組載體多克隆位點(diǎn)攜帶的His標(biāo)簽對(duì)重組VP1蛋白成功進(jìn)行了純化。為了提高VP1蛋白的純化效率，在蛋白純化試驗(yàn)中將Bingding Buffer的咪唑濃度由10 mmol/L降至5 mmol/L，洗脫液中的咪唑濃度為500 mmol/L，獲得了純化效率較高的VP1重組蛋白。純化后SVA VP1蛋白與微球偶聯(lián)成功，本研究探討了VP1蛋白與熒光微球偶聯(lián)的最佳蛋白濃度，應(yīng)用偶聯(lián)成功的熒光微球，通過液相芯片檢測(cè)技術(shù)可對(duì)塞內(nèi)卡病毒陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，初步建立了SVA抗體液相芯片檢測(cè)技術(shù)。本試驗(yàn)結(jié)果為實(shí)現(xiàn)區(qū)分塞內(nèi)卡病毒病與其他類似癥狀的疾病及血清學(xué)檢測(cè)方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究利用pCold TF原核表達(dá)載體對(duì)SVA VP1蛋白進(jìn)行了高效可溶性表達(dá)與純化，純化后的VP1重組蛋白與熒光微球偶聯(lián)后，結(jié)合液相芯片技術(shù)可用于豬血清中塞內(nèi)卡病毒抗體的檢測(cè)。