性成熟前不同日齡伊拉兔睪丸和附睪形態(tài)學與組織學特征

鐵雅楠，楊喜喜，王志亮，王欣榮

(甘肅農業(yè)大學動物科學技術學院，蘭州 730070)

睪丸是雄性動物最重要的生殖器官，具有產生精子、傳遞遺傳信息、分泌雄激素、刺激其他性器官發(fā)育以及維持機體正常第二性征的作用[1]。附睪則是由輸出小管將其與睪丸表層相連的附屬器官，它不僅是精子運輸的通道，還是精子濃縮，獲得運動能力、受精能力以及精子儲存的部位[2]。因此，雄性動物的性別分化、性發(fā)育、性成熟、繁殖力的維持均與睪丸、附睪的發(fā)育密切相關[3]。睪丸及附睪的發(fā)育狀況及組織學水平的研究可全面映射其結構與功能的變化規(guī)律。目前有不少關于動物睪丸組織結構的報道，如賈文玉等[4]研究表明隨月齡的增加，羔羊睪丸重量和體積不斷增大，在3月齡后增加顯著；李紅美等[5]研究表明隨著日齡增加，太湖豬睪丸曲細精管、精原細胞、初級精母細胞及精子細胞直徑均逐漸增加。另外關于馬[6]、雞[7]、小鼠[8]、牛[9]等動物睪丸組織結構的研究均有報道，但對伊拉兔睪丸的生長發(fā)育規(guī)律報道較少。

伊拉兔屬于中型肉兔，公兔在120日齡左右出現爬跨行為，達到初情期，150～160日齡達到性成熟，而體成熟較性成熟晚，一般在性成熟后1～2個月；但這些伊拉兔初情期及性成熟的判定依據大多以行為學觀察的結果為主[10-11]，而有關伊拉兔初情期及性成熟期出現的組織學、細胞學方面的證據較少。因此本試驗以伊拉兔為研究對象，結合兔行為學的基礎研究，采用解剖學和組織學方法，對性成熟前不同日齡伊拉兔的睪丸和附睪開展形態(tài)學和組織學研究，并測定其組織學參數，包括睪丸細胞、生精小管面積、生精上皮厚度、附睪管直徑、柱狀上皮細胞厚度及纖毛長度等，根據睪丸、附睪組織形態(tài)學變化、細胞學發(fā)育特點，以及組織學特征的出現，來判斷伊拉兔初情期和性成熟期達到的標志，為伊拉兔初情期、性成熟的確切時間提供直接研究證據，也可為家兔生殖特性的深入研究以及種兔選擇、種用價值評定提供相關參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣品采集

從甘肅某養(yǎng)殖公司購買30日齡體重為1.0 kg±0.2 kg的健康伊拉公兔45只，按照相同飼養(yǎng)標準飼養(yǎng)于甘肅農業(yè)大學動物飼養(yǎng)基地，按照日齡研究間隔(30、45、60、75、90、105、120、135、150日齡)共分為9組，每組5只，每隔15 d采集1組兔的樣品。采用耳緣靜脈注射空氣法將伊拉兔處死，采集不同日齡伊拉兔的睪丸和附睪。

1.2 主要試劑及儀器

蘇木精染液購自武漢谷歌生物科技有限公司；無水乙醇、二甲苯、鹽酸和中性樹膠均購自國藥集團化學試劑有限公司。石蠟切片機(Leica UC7)購自上海萊卡儀器有限公司；正置光學顯微鏡(Olympus dp-71)購自尼康公司；游標卡尺(0～150 mm)購自上海恒量量具有限公司；自動脫水機(JJ-12J)、包埋機(JB-P5)和凍臺(JB-L5)均購自武漢俊杰電子有限公司；組織攤片機(KD-P)購自浙江金華科迪儀器設備有限公司；電子天平(ME104E)購自深圳林濤儀器有限公司。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 睪丸和附睪物理參數測定 用電子天平稱量睪丸、附睪的重量；用游標卡尺測量睪丸縱軸長度為睪丸長徑，橫軸長度為睪丸短徑，與橫軸垂直的厚度為睪丸厚徑，睪丸指數按如下公式計算[12]。

睪丸指數=睪丸重(g)/活體重(kg)

1.3.2 睪丸和附睪組織切片制備及觀察 物理參數測定后，將睪丸和附睪在4%多聚甲醛中固定24 h，經脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、攤片、粘片和烤片，脫蠟至水后將切片用蘇木素染色、鹽酸分化、自來水返藍、水洗后依次投入濃度梯度為50%、75%、85%、95%的酒精中脫水，再加入伊紅染色，經無水乙醇、1/2二甲苯(酒精與二甲苯1∶1混合液)、純二甲苯中透明，最后用中性樹膠封片。將制作好的組織切片置于顯微鏡下觀察，并對3個以上的視野拍照，采集其整體或局部照片。

1.4 數據統(tǒng)計及分析

用Image Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計睪丸和附睪的物理參數。用SPSS 25.0軟件單因素方差分析和LSD法比較各組差異，結果用平均值±標準差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 不同日齡伊拉兔睪丸形態(tài)學和組織學變化

2.1.1 睪丸的物理參數 由表1可知，隨日齡的增加，睪丸指數、睪丸重、睪丸長徑、睪丸短徑、睪丸厚徑等指標逐漸增加，且150日齡的睪丸指數、睪丸重、睪丸長徑、睪丸厚徑均顯著大于其他各組(P<0.05)，而105、120、135、150日齡組睪丸短徑顯著大于其他各組(P<0.05)；105、120、135日齡組睪丸指數、睪丸重、睪丸厚徑顯著大于30、45、60、75、90日齡組(P<0.05)；90日齡組睪丸指數、睪丸重顯著高于30、45、60日齡組(P<0.05)；60、75、90、105、120、135日齡睪丸長徑顯著大于30、45日齡組(P<0.05)，其余各日齡之間差異不顯著(P>0.05)。

表1 不同日齡伊拉兔睪丸的物理參數

2.1.2 睪丸生精小管的物理參數 由表2可知，135、150日齡組生精小管直徑顯著大于30、45、60、75、90、105日齡組(P<0.05)，90、105、120日齡組顯著大于30、45、60、75日齡組，75日齡組顯著大于30、45、60日齡組(P<0.05)；生精小管面積、上皮厚度在120、135、150日齡組顯著大于其他日齡組(P<0.05)，在75、90、105日齡組顯著大于30、45、60日齡組(P<0.05)；支持細胞數在90、105、120、135、150日齡組顯著大于30、45日齡組(P<0.05)；135、150日齡組間質細胞數顯著大于30日齡組(P<0.05)，其余各日齡間差異不顯著(P>0.05)。

表2 不同日齡伊拉兔睪丸生精小管的物理參數

2.1.3 睪丸組織學觀察 由圖1可知，在光鏡下觀察到30、45、60日齡睪丸內生精小管排列稀疏，而60日齡較30、45日齡排列緊密，生精小管外可見基膜和梭形肌樣細胞，間質組織較多，間質內可見單個或成群分布的間質細胞，生精小管管腔為實心組織，生精小管界膜清晰，僅有1～2層細胞緊貼于基膜上，只能看見精原細胞與支持細胞，精原細胞胞體小、核圓形、著色較深；支持細胞為卵圓形、核仁清晰(圖1A～1C)。75、90、105日齡睪丸內生精小管排列緊密，間質成分逐漸增多，生精小管明顯逐漸增粗，管腔逐漸形成，生精細胞層數增多，為2～4層，除精原細胞與支持細胞外，生精小管中出現初級精母細胞，位于生精上皮的中層，胞體大，核圓形，著色深；在90、105日齡分別出現圓形精子細胞和長形精子細胞，但無成型精子出現(圖1D～1F)。鏡下觀察120、135、150日齡的睪丸組織，發(fā)現其生精小管排列緊密，間質細胞數逐漸增多并成群分布，生精小管增粗明顯，管腔腔隙逐漸增大，生精上皮厚度明顯增厚，生精細胞層數逐漸增多，細胞自基膜向管腔面有序排列為4～6層，可見各級不同的生精細胞和支持細胞，精原細胞和處于不同分裂期的初級精母細胞明顯增多，另外在近管腔面出現較多的精子細胞和變形的精子(圖1G～1I)。

①A～I，分別為30、45、60、75、90、105、120、135和150日齡睪丸組織切片。②A，A型精原細胞；B，B型精原細胞；Sc，Sertoli細胞；ST，生精小管；IT，間質；PC，管周肌樣細胞；Ley，Leyding細胞；ps，初級精母細胞；Es，長形精子細胞；Rs，圓形精子細胞；sp，精子；V，血管

2.2 不同日齡伊拉兔附睪形態(tài)學和組織學變化

2.2.1 附睪不同部位管徑 由表3可知，120、135、150日齡組伊拉兔附睪頭、體、尾的管腔外徑均顯著大于其他各日齡組，且150日齡組顯著大于120、135日齡組(P<0.05)；105日齡組附睪頭、尾管腔外徑及內徑顯著大于30、45、60、75、90日齡組(P<0.05)；60、75日齡組附睪頭管腔外徑及附睪體、附睪尾內徑顯著大于30、45日齡組(P<0.05)；45日齡組附睪頭、體、尾外徑及附睪體、尾內徑顯著大于30日齡組(P<0.05)；75、90日齡組附睪頭、體的管腔外徑及附睪體、尾內徑顯著大于30、45日齡組(P<0.05)；45、60、75、90日齡組附睪頭、體、尾管腔外徑及附睪體、尾管腔內徑顯著大于30日齡組(P<0.05)；60日齡組附睪頭管腔外徑、附睪體、尾管腔內徑顯著大于30、45日齡組(P<0.05)，其余各日齡間差異不顯著(P>0.05)。

表3 不同日齡伊拉兔附睪組織不同部位管腔內徑與外徑長度

2.2.2 附睪不同部位上皮厚度和纖毛長度 由表4可知，105、120、135、150日齡組附睪頭柱狀上皮厚度顯著大于其他各日齡組(P<0.05)，且60、75、90日齡組顯著大于30、45日齡組(P<0.05)；90、105、120、135、150日齡組附睪尾柱狀上皮厚度顯著大于其他各日齡組(P<0.05)；75、90、105、120、135、150日齡組附睪體柱狀上皮厚度顯著大于30、45、60日齡組(P<0.05)，60日齡組顯著大于30日齡組(P<0.05)；60、75日齡組附睪尾的柱狀上皮厚度顯著大于30、45日齡組(P<0.05)，45日齡組顯著大于30日齡組(P<0.05)；其余各日齡間差異不顯著(P>0.05)。

表4 不同日齡伊拉兔附睪不同部位柱狀上皮厚度和纖毛長度

在纖毛長度方面，135、150日齡組附睪頭的纖毛長度顯著大于30、45、60、75、90日齡組(P<0.05)，135日齡組顯著大于30、45、60、75、90、120日齡組(P<0.05)；150日齡組附睪體纖毛長度顯著大于其他各日齡組(P<0.05)，90、105、120日齡組顯著大于30、45、60日齡組(P<0.05)；75、90、105、120、135、150日齡組附睪尾的纖毛長度顯著大于30、45日齡組(P<0.05)；其余各日齡間差異不顯著(P>0.05)。

2.2.3 附睪組織學觀察 由圖2可知，附睪管上皮主要由主細胞、基細胞、暈細胞、頂細胞及管周肌樣細胞組成，上皮可見2～4層的細胞。管周肌樣細胞核呈長梭形環(huán)繞于附睪管固有膜外周，基細胞呈單層狀分布，緊貼于附睪管固有膜底部，而主細胞呈長柱狀分布于上皮中，平滑肌纖維排列整齊，環(huán)繞于附睪管外周(圖2A～2I)。隨日齡的增加，30～150日齡附睪管管徑不斷增大，柱狀上皮厚度不斷增厚，纖毛也隨之增長，部分纖毛發(fā)生脫落現象(圖2A～2I)。隨日齡的增長，附睪管逐漸排列緊密，在30～105日齡附睪管管腔中未出現精子(圖2A～2E)，有脫落的柱狀上皮細胞。120日齡管腔中出現精子，數量較少(圖2F)，135、150日齡管腔中有大量精子存在，密集分布于管腔腔隙中(圖2H～2I)。

①A～I，分別為30、45、60、75、90、105、120、135和150日齡附睪組織切片。②SMF，平滑肌纖維；SCE，單復層柱狀上皮；PCE，假復層柱狀上皮；BC，基細胞；MC，主細胞；MV，微絨毛；ED，附睪管；V，血管；SZ，精子；PC，管周肌樣細胞；RBC，紅細胞

3 討 論

3.1 不同日齡伊拉兔睪丸的形態(tài)學與組織學特征

睪丸可分泌雄激素，對雄性生殖系統(tǒng)的發(fā)育起著重要作用[13]，而睪丸指數在一定程度反映其所處的發(fā)育階段和生理狀況[14]。本研究發(fā)現，隨著日齡的增加，伊拉兔睪丸指數、睪丸重均呈現遞增趨勢，且在135～150日齡階段增長速率相對較快，150日齡達到峰值，說明此階段睪丸生長發(fā)育迅速，可能是其性腺發(fā)育的關鍵期，這與前人的研究結果一致[15]。另外，本研究發(fā)現，隨著日齡的增加，伊拉兔的睪丸長徑、睪丸短徑、睪丸厚徑均顯著增長，且在150日齡性成熟時均達到峰值。生精小管形態(tài)結構及睪丸內相關細胞增殖分化是睪丸發(fā)育的標志，睪丸重量的增加與生精小管上皮的發(fā)育有直接關系[16]。本研究中，隨著日齡的增加，生精小管直徑、橫截面積及生精上皮厚度顯著增長。研究表明，大鼠出生后生精小管直徑顯著增大是因支持細胞的快速增長，且生精小管面積在3月齡達到最大[17]。本研究中，隨支持細胞和生精細胞的增加，在150日齡時生精小管的直徑達到最大。在公牛上的研究表明，新生及6～10周公牛睪丸支持細胞的數量決定了成年后睪丸的大小、生精細胞數量及精子數量[18]；對香豬睪丸的研究也證明，支持細胞在初情期前停止增殖，此后支持細胞數量維持穩(wěn)定[19]。本研究發(fā)現，隨著日齡的增加和生精上皮的發(fā)育，支持細胞數不斷增多，且在120～150日齡階段支持細胞的增長維持相對穩(wěn)定，表明伊拉兔在120日齡達到初情期。此外在30～60日齡階段，睪丸內生精小管排列稀疏，間質組織較多，生精小管管腔為實心組織，說明此時睪丸分泌的睪酮較少，生精小管管腔未被刺激分化形成。賈書花等[20]研究發(fā)現，從胚胎睪丸形成到青春期前，睪丸沒有得到激素刺激，生精細胞不發(fā)育，曲細精管的生精上皮由精原細胞和支持細胞組成，幾乎無管腔，而動物進入青春期后，睪丸受垂體分泌的促黃體生成素(LH)和促卵泡素(FSH)以及睪丸間質細胞分泌的睪酮(T)調控，生精細胞開始發(fā)育，管腔逐漸形成并產生精子，這與本試驗結果一致。本研究發(fā)現，在伊拉兔75日齡時，睪丸上皮逐漸發(fā)育，初級精母細胞、圓形精子細胞均出現，生精小管管腔逐漸形成，且在150日齡時生精小管管腔達到最大，管腔內有大量的精子出現。有研究進一步表明，小鼠在出生后35 d其生精小管內可見大量精子，同時附睪中的精子數量也增多，并且具有受精能力，表明此時小鼠已達到性成熟[21]，與本研究伊拉兔在150日齡時結果一致，說明伊拉兔此時基本達到性成熟。間質細胞分泌的睪酮是影響精子發(fā)生和性功能的主要激素[22]。本研究中隨伊拉兔日齡的增加，其睪丸間質細胞數也隨之增加，且在150日齡達到最大值，說明隨著日齡增加伊拉兔睪丸不斷發(fā)育，150日齡時基本發(fā)育成熟。

3.2 不同日齡伊拉兔附睪的形態(tài)學與組織學特征

附睪是附著在睪丸背部且含有大量高度卷曲附睪管的器官，連接著睪丸和輸出小管，睪丸產生的精子先到達附睪，通過附睪的運輸，最后將精液輸出到輸精管。附睪在解剖學上可大致分為頭、體和尾3部分，具有特定功能和形態(tài)特征的上皮細胞位于這些區(qū)域中，它們形成了血—表皮屏障，為精子的濃縮、成熟和儲存建立了獨特的管腔微環(huán)境[23]。相關研究顯示，附睪各部分管壁上皮細胞主要由主細胞、基細胞、頂細胞和暈細胞及管周肌樣細胞組成，由于其有獨特的上皮細胞類型和功能特點，組織學也有明顯差異[24]。本研究結果顯示，伊拉兔附睪管周肌樣細胞核呈長梭形環(huán)繞于附睪管固有膜外周，基細胞呈單層狀分布，緊貼于附睪管固有膜底部，而主細胞呈長柱狀分布于上皮中，平滑肌纖維排列整齊，環(huán)繞于附睪管外周。隨著日齡的增加，附睪頭、附睪體和附睪尾管腔外徑、內徑均顯著增長，在150日齡均達到最大。研究表明，棕色田鼠附睪管腔直徑隨日齡而變化，45日齡附睪管腔顯著增大，60日齡附睪管腔直徑達到最大[25]；楊棟慧等[26]研究發(fā)現，從附睪頭到附睪尾，附睪的管腔直徑逐漸增加，上皮厚度逐漸減小，平滑肌厚度逐漸增厚，這些研究結果與本試驗在伊拉兔上的結果一致。

研究顯示，附睪上皮具有吸收和分泌功能，可以分泌甘油磷酸膽堿和糖蛋白，有助于維持精子的活力[27]。精子在附睪內缺乏運動能力，精子從附睪頭到附睪尾是依靠附睪管纖毛上皮的擺動，以及平滑肌的協(xié)助收縮作用，推動精子進入輸精管[28]。在棕色田鼠60日齡的附睪中發(fā)現大量精子，且纖毛長度達到最長，表明棕色田鼠已達到性成熟[25]。本研究發(fā)現，隨著伊拉兔日齡的增加，附睪頭、體和尾部的柱狀上皮均極顯著增長，附睪管中的纖毛也隨之增長，在150日齡均達到最大值。在30～105日齡階段的附睪管中尚未出現精子，僅有部分管腔中有脫落的柱狀上皮細胞，而在120日齡的附睪管中發(fā)現少量精子，且在135、150日齡的附睪管中發(fā)現大量精子，這說明伊拉兔達到初情期大約在120日齡，而性成熟大約在150日齡。

4 結 論

本研究結果發(fā)現，隨著伊拉兔日齡的增加，睪丸和附睪的發(fā)育是同步的，睪丸支持細胞的增加在120日齡趨于相對穩(wěn)定，且附睪中有精子出現，說明伊拉兔在120日齡達到初情期。在150日齡時，睪丸生精小管、附睪管直徑均達到最大值，管腔中有大量精子出現，說明此時睪丸和附睪已發(fā)育成熟，伊拉兔基本達到性成熟。