原佳慧,張鵬翔,吉樹森,盧嘉茵,羅小毛,閆 藝,王海東
(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,太谷 030801)
肌內(nèi)脂肪是反映動物肉品質(zhì)的重要指標(biāo),其含量直接影響動物肉的風(fēng)味、嫩度、多汁性及大理石花紋的分布[1]。脂肪組織是動物體內(nèi)重要的分泌組織,脂肪細(xì)胞會分泌瘦素、脂聯(lián)素等[2-3]。哺乳動物脂肪組織主要分為白色脂肪組織、棕色脂肪組織和米色脂肪組織。3種脂肪組織來源不同,功能也各不相同。白色脂肪組織內(nèi)含有較多的甘油三酯,可以儲存機(jī)體多余的能量。由于白色脂肪細(xì)胞中線粒體含量較低,所以其雖儲存能量能力較強(qiáng),但脂肪消耗能量的能力較差[4-5]。因此,脂肪干細(xì)胞的形成及代謝過程的直接或間接調(diào)控因子已成為研究熱點(diǎn)。
多種miRNA可直接或間接參與脂肪細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄與翻譯過程,且其可通過與下游靶基因結(jié)合的方式參與調(diào)控脂肪干細(xì)胞的分化及發(fā)育[6]。研究表明,內(nèi)源性miR-140-5p在小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(ST2)分化過程中表達(dá)較高,miR-140-5p可靶向轉(zhuǎn)化生長因子β受體Ⅰ(TGFBR1)調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化[7],miR-140-5p能夠靶向且正調(diào)控長鏈非編碼RNA 核副斑點(diǎn)裝配轉(zhuǎn)錄物1(LnoRNA NEAT1)促進(jìn)脂肪衍生干細(xì)胞(ADSCs)成脂分化[8]。此外,研究表明,CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白家族(C/EBPs)與miR-140-5p的近端啟動子結(jié)合正調(diào)控miR-140-5p的表達(dá)[7],表明miR-140-5p與C/EBPs可能是正反饋模式,miR-140-5p可能在脂肪分化過程中發(fā)揮著重要的作用。通過查找miRBase等網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)了可能靶向miR-140-5p的基因,一部分已經(jīng)被驗(yàn)證參與脂肪干細(xì)胞的分化過程,其中P300/CBP相關(guān)因子(PCAF)又名KAT2B,是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶,具有乙酰轉(zhuǎn)移活性,能通過乙?;M蛋白和非組蛋白的方式參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[9]。P300/CBP與細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡和癌癥的發(fā)生有著直接的關(guān)系[10]。研究表明,PCAF基因在3T3-L1細(xì)胞成脂分化過程中具有重要作用[11],同時關(guān)于PCAF基因在成脂分化方面相關(guān)文獻(xiàn)較少,PCAF基因影響成脂分化的具體機(jī)制還不清晰。
過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)是調(diào)節(jié)目標(biāo)基因表達(dá)的核內(nèi)受體轉(zhuǎn)錄因子超家族成員。PPAR可分為α、β(或δ)和γ 3種類型,其中PPARγ主要表達(dá)于脂肪組織及免疫系統(tǒng),與脂肪細(xì)胞分化、機(jī)體免疫及胰島素抵抗關(guān)系密切,是一種可由多種脂肪酸及其衍生物激活的核轉(zhuǎn)錄因子[12]。PPARγ參與脂肪細(xì)胞分化,并與肥胖密切相關(guān),是公認(rèn)的脂肪分化的標(biāo)志因子[13]。C/EBPs家族是堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族的一個亞家族,具有多種功能,在細(xì)胞增殖、分化、信號傳導(dǎo)、腫瘤發(fā)生及機(jī)體的免疫、應(yīng)激反應(yīng)、能量代謝、血液生成等方面發(fā)揮著重要的作用[14-15]。目前發(fā)現(xiàn)的C/EBPs家族有C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPγ、C/EBPδ、C/EBPε、C/EBPζ 6類,且C/EBPs家族是第一個被證明在脂肪細(xì)胞分化過程中起重要作用的家族[16]。研究表明,在前脂肪細(xì)胞3T3-L1分化過程中C/EBPβ的表達(dá)在脂肪分化初期瞬時增強(qiáng),而后C/EBPα與PPARγ轉(zhuǎn)錄激活[17]?;赑PARs與C/EBPs家族互相影響且在細(xì)胞成脂分化中起到重要的作用,本試驗(yàn)選擇C/EBPβ、C/EBPδ與PPARγ作為3T3-L1細(xì)胞成脂分化機(jī)制的下游基因進(jìn)行深入研究,探索miR-140-5p對3T3-L1細(xì)胞成脂分化的調(diào)控作用。
高糖DMEM購自上海帝博思生物科技有限公司;胎牛血清(FBS)購自Sciencell公司;Promega Dual-Luciferase?Reporter Assay System E1910購自Abcam公司;Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑、質(zhì)粒中提試劑盒均購自Thermo公司;PGLO載體、PGLO-PCAF 3′-UTR載體、PEGFP-N1載體、PEGFP-N1-PCAF載體均購自武漢淼靈生物科技有限公司;RNAiso Plus,PrimeScriptTMRT Reagent Kit、SYBR?Primix ExTaqⅡ均購自TaKaRa公司;BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司;PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser、Adipogenesis Assay試劑盒均購自Abcam公司;PCAF、C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ抗體購自Proteintech Group公司;限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、KpnⅠ、NheⅠ均購自NEB公司;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自深圳康體生命科技有限公司。
1.2.1 miR-140-5p模擬物、抑制物的合成 根據(jù)miRBase網(wǎng)站miR-140-5p全序列(登錄號:KT921569.1),由吉瑪基因公司設(shè)計(jì)并合成miR-140-5p的模擬物、抑制物及對照序列(miR-140-5p mimics、inhibitor、NC)(表1)。
表1 模擬物、抑制物及siRNA信息
1.2.2 siRNA設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank中PCAF基因完整CDS區(qū)序列(登錄號:NM_001190846.1),由吉瑪基因公司設(shè)計(jì)并合成PCAF基因的3條siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3)(表1)。
1.2.3 載體構(gòu)建 根據(jù)GenBank中PCAF基因完整CDS區(qū)序列(登錄號:NM_001190846.1),采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCAF過表達(dá)引物,以3T3-L1細(xì)胞cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50 μL:cDNA 5 μL,2×TaqMasterMix 25 μL,上、下游引物各1.5 μL,ddH2O 17 μL。PCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸15 s,共35個循環(huán);72 ℃終延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后膠回收,與PEGFP-N1空載體同時使用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、KpnⅠ雙酶切,將二者雙酶切產(chǎn)物連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,對轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌進(jìn)行搖菌、涂板、挑單克隆菌、搖菌,將得到的菌液送往生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序,測序成功后對菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取,重組質(zhì)粒命名為PEGFP-N1-PCAF。
根據(jù)miRDB網(wǎng)站得到PCAF基因的3′-UTR序列,采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)PCAF 3′-UTR引物(表2),其中包含miR-140-5p與PCAF基因預(yù)測結(jié)合位點(diǎn),使用上述方法構(gòu)建PGLO-PCAF 3′-UTR載體。
1.2.4 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)miRBase、GenBank中miR-140-5p、PCAF、C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ基因序列,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時熒光定量PCR引物,引物信息見表2。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
表2 引物信息
1.3.1 3T3-L1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分化 3T3-L1細(xì)胞解凍后用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),按照2×105/mL接種到6孔板中,待匯合度達(dá)到70%左右時進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。用250 μL DMEM培養(yǎng)基(不含血清和雙抗)分別稀釋miR-140-5p mimics(mimics)、NC和Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑,室溫靜置5 min,將NC與miR-140-5p mimics分別與轉(zhuǎn)染試劑混勻后靜置20 min;靜置期間,將6孔板里的舊培養(yǎng)基棄掉,用PBS清洗細(xì)胞2次,加入800 μL新鮮DMEM培養(yǎng)基(不含血清和雙抗);靜置結(jié)束后將500 μL轉(zhuǎn)染混合液均勻滴加到培養(yǎng)板中,輕輕晃動培養(yǎng)板使溶液混合均勻;培養(yǎng)箱中靜置6 h,更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(不含雙抗)繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度達(dá)70%時進(jìn)行誘導(dǎo)分化,將完全培養(yǎng)基換為誘導(dǎo)培養(yǎng)基(將胰島素、IBMX、地塞米松試劑按照說明書1 000倍稀釋,1 mL完全培養(yǎng)基加入1 μL各試劑配制誘導(dǎo)培養(yǎng)基),誘導(dǎo)3 d后換為分化培養(yǎng)基(將胰島素試劑按照說明書1 000倍稀釋,1 mL完全培養(yǎng)基加入1 μL配制分化培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng),2 d換1次分化液。
1.3.2 油紅O染色鑒定 在誘導(dǎo)分化第7天進(jìn)行油紅O染色。將3T3-L1細(xì)胞每孔加入100 μL稀釋的脂滴分析固定劑,并孵育15 min;用100 μL洗滌液洗2次,每次5 min;干燥培養(yǎng)板;將75 μL油紅O工作液添加到所有孔中,包括不含細(xì)胞的空白孔,并孵育20 min;移除所有油紅O溶液,用蒸餾水清洗細(xì)胞數(shù)次,至蒸餾水清澈;用100 μL洗滌液洗2次,每次5 min。顯微鏡下觀察并拍照。
1.3.3 實(shí)時熒光定量PCR檢測基因的表達(dá) 在誘導(dǎo)分化的第―1(分化前1 d)、0、1、2、3、5、7天收集3T3-L1細(xì)胞,用于實(shí)時熒光定量PCR檢測miR-140-5p mRNA相對表達(dá)量;在誘導(dǎo)分化第7天收集細(xì)胞進(jìn)行C/EBPβ、C/EBPδ和PPARγ mRNA相對表達(dá)量檢測。用TRIzol提取誘導(dǎo)分化第―1、0、1、2、3、5、7天的3T3-L1細(xì)胞、轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimics和NC組誘導(dǎo)分化7 d的3T3-L1細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)體系10 μL:2×TaqMaster Mix 5 μL,上、下游引物各0.4 μL,cDNA 200 ng,ddH2O補(bǔ)足10 μL。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸15 s,共40個循環(huán);72 ℃延伸5 min。
采用miRandn(http:∥mirdb.org/)和TargetScan(http:∥www.targetscan.org/vert_70/)2個miRNA數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-140-5p的靶基因,在數(shù)據(jù)庫中挑選與脂肪分化相關(guān)的靶基因作為潛在靶基因。通過在miRBase(https:∥www.mirbase.org/)數(shù)據(jù)庫得到小鼠、人、黑猩猩、恒河猴、松鼠、大鼠、兔子、豬、牛、貓、犬、棕蝠、大象、負(fù)鼠、金剛鸚鵡和雞的miR-140-5p及其靶基因結(jié)合位點(diǎn)序列,通過比對各物種miRNA序列,分析其結(jié)合位點(diǎn)序列的保守性。
1.5.1 3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及細(xì)胞分化 將miR-140-5p mimics(mimics)、miR-140-5p inhibitor(inhibitor)與NC按照1.3.1方法轉(zhuǎn)染到3T3-L1細(xì)胞中,細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化方式同1.3.1。
1.5.2 實(shí)時熒光定量PCR檢測靶基因的表達(dá) 在誘導(dǎo)的第2天收集1.5.1各組細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。試驗(yàn)方法同1.3.3,檢測mimics、inhibitor與mimics NC組的miR-140-5p的靶基因mRNA相對表達(dá)水平。
1.5.3 Western blotting檢測蛋白的表達(dá) 在誘導(dǎo)的第2天收集1.5.1各組細(xì)胞進(jìn)行Western blotting檢測。用蛋白裂解液收集mimics、inhibitor與mimics NC組的細(xì)胞后,冰上裂解40 min,13 000 r/min離心15 min,吸取上清液,檢測蛋白濃度后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳,經(jīng)過轉(zhuǎn)膜、室溫封閉1 h、孵育一抗(4 ℃孵育過夜)、洗膜、孵育二抗(37 ℃孵育1 h)、洗膜后,涂抹發(fā)光液后在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。檢測miR-140-5p靶基因的蛋白表達(dá)水平。
1.6.1 3T3-L1細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及細(xì)胞分化 將PEGFP-N1-PCAF載體、PEGFP-N1載體、NC、PCAF siRNA1、PCAF siRNA2和PCAF siRNA3、PCAF NC與PCAF siRNA3按照1.3.1的方法轉(zhuǎn)染到3T3-L1細(xì)胞,細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化方式同1.3.1。在誘導(dǎo)第2天時收集各組細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR和Western blotting檢測,在誘導(dǎo)分化第7天進(jìn)行油紅O染色鑒定。
1.6.2 油紅O染色 試驗(yàn)方法同1.3.2,觀察PEGFP-N1-PCAF與PEGFP-N1組及PCAF siRNA與NC組細(xì)胞中脂滴的染色情況。
1.6.3 實(shí)時熒光定量PCR檢測基因的表達(dá) 試驗(yàn)方法同1.3.3,檢測PEGFP-N1-PCAF、PEGFP-N1組細(xì)胞PCAF、C/EBPδ、PPARγ基因的相對表達(dá)水平;檢測PCAF siRNA、NC組PCAF、C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ基因的相對表達(dá)水平。
1.6.4 Western blotting檢測蛋白的表達(dá) 試驗(yàn)方法同1.5.3,檢測PEGFP-N1-PCAF、PEGFP-N1組細(xì)胞C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ與GAPDH蛋白表達(dá)水平;檢測PCAF siRNA1、PCAF siRNA2、PCAF siRNA3和NC組細(xì)胞中PCAF蛋白表達(dá)水平;檢測PCAF siRNA組與NC組C/EBPβ、PPARγ與GAPDH蛋白表達(dá)水平。
將293T細(xì)胞分為mimics+PCAF 3′-UTR、NC+PCAF 3′-UTR、mimics+PGLO空載(mimics+vehicle)和空白+PCAF 3′-UTR(Blank+3′-UTR PCAF)4組,待293T細(xì)胞匯合度達(dá)到70%~80%進(jìn)行轉(zhuǎn)染,用125 μL DMEM培養(yǎng)基(不含血清和雙抗)分別稀釋PCAF 3′-UTR質(zhì)粒、mimics,用250 μL DMEM培養(yǎng)基稀釋Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑(6 μL/孔),室溫靜置5 min,將質(zhì)粒和mimics與轉(zhuǎn)染試劑分別混勻再靜置20 min,按照1.3.1的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染,培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞,用于雙熒光素酶報告試驗(yàn)檢測。試驗(yàn)前需按照Promega Dual-Luciferase?Reporter Assay System E1910試劑盒說明書制備裂解液1×PLB、LAR Ⅱ、Stop & Glo試劑、1×Stop & Glo Raegent。除去培養(yǎng)基,用PBS清洗細(xì)胞后,將1×PLB加入到培養(yǎng)孔中。在室溫輕緩晃動培養(yǎng)板15 min,將裂解液轉(zhuǎn)移到檢測板中,加入20 μL PLB裂解液/孔,加入100 μL LAR Ⅱ,檢測樣本熒火蟲熒光素酶活性;加入100 μL Stop & Glo試劑,檢測樣本海腎熒光素酶活性。
用2-△△Ct法計(jì)算各基因相對表達(dá)量,采用ImageJ 1.48軟件計(jì)算蛋白灰度值,用GraphPad Prism 8.0軟件繪圖,用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析,組間差異采用t檢驗(yàn),結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。
在3T3-L1細(xì)胞分化過程中,miR-140-5p的表達(dá)量有明顯變化趨勢。與誘導(dǎo)分化前1 d(-1 d)相比,在細(xì)胞匯合至100%時miR-140-5p表達(dá)水平極顯著上升(P<0.01),在添加誘導(dǎo)培養(yǎng)基第1天時,miR-140-5p表達(dá)水平極顯著上升(P<0.01),而后在分化過程中下降,分化至第3天miR-140-5p表達(dá)水平顯著上升(P<0.05),分化至第5天后miR-140-5p表達(dá)水平已降低到未分化之前的水平(圖1A)。油紅O染色發(fā)現(xiàn),mimics組脂滴明顯多于NC組(圖1B)。與NC組相比,mimics組成脂標(biāo)志性基因C/EBPδ、PPARγ轉(zhuǎn)錄水平極顯著升高(P<0.01),C/EBPβ基因的轉(zhuǎn)錄水平有升高趨勢,但差異不顯著(P>0.05)(圖1C~1E)。
①A,3T3-L1細(xì)胞分化第-1、0、1、2、3、5、7天miR-140-5p表達(dá)水平;B,miR-140-5p NC組與mimics組油紅O染色結(jié)果(40×);C~E,C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ mRNA相對表達(dá)量。②與―1 d相比,#,差異顯著(P<0.05);##,差異極顯著(P<0.01);無#,差異不顯著(P>0.05)。③與NC/PEGFP-N1組相比,*,差異顯著(P<0.05);**,差異極顯著(P<0.01);無*,差異不顯著(P>0.05)。下同
利用TargetScan網(wǎng)站預(yù)測發(fā)現(xiàn),miR-140-5p與PCAF 3′-UTR區(qū)含有預(yù)測結(jié)合位點(diǎn),在674-681 bp處(圖2A)。預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)在小鼠、人、黑猩猩、恒河猴、松鼠、大鼠、兔子、豬、牛、貓、犬、棕蝠、大象、負(fù)鼠、金剛鸚鵡和雞物種間的保守性比對發(fā)現(xiàn),在不同物種間此結(jié)合位點(diǎn)保守性較高(圖2B)。
A,miR-140-5p和PCAF 3′-UTR區(qū)的預(yù)測結(jié)合位點(diǎn);B,PCAF 3′-UTR區(qū)序列保守性分析
由圖3可知,與NC組相比,mimics組miR-140-5p、PCAF的表達(dá)量均極顯著增加(P<0.01),inhibitor組miR-140-5p的表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)、PCAF的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。由圖4可知,與NC組相比,mimics組PCAF蛋白的表達(dá)量顯著增加(P<0.05),inhibitor組PCAF蛋白的表達(dá)量無顯著變化(P>0.05)。
圖3 各組miR-140-5p(A)與PCAF(B)基因的相對表達(dá)量
圖4 各組PCAF蛋白表達(dá)量
由圖5可知,與PEGFP-N1組相比,PEGFP-N1-PCAF組細(xì)胞脂滴明顯增加。由圖6可知,與PEGFP-N1組相比,PCAF、PPARγ基因相對表達(dá)量均極顯著增加(P<0.01),C/EBPδ基因相對表達(dá)量有上升趨勢,但差異不顯著(P>0.05)。由圖7可知,與PEGFP-N1組相比,PEGFP-N1-PCAF組C/EBPβ、C/EBPδ蛋白表達(dá)水平極顯著上升(P<0.01),PPARγ蛋白表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)。
圖5 油紅O染色結(jié)果(40×)
圖6 各組PCAF(A)、C/EBPδ(B)和PPARγ(C)基因相對表達(dá)量
A,C/EBPβ、C/EBPδ和PPARγ蛋白Western blotting條帶;B~D,C/EBPβ、C/EBPδ和PPARγ蛋白灰度值
由圖8可知,與NC組相比,3條siRNA均極顯著抑制PCAF蛋白的表達(dá)水平(P<0.01),由于siRNA3組PCAF蛋白水平降低最顯著,所以選用siRNA3進(jìn)行后續(xù)PCAF敲低試驗(yàn)。由圖9可知,siRNA3組脂滴明顯少于NC照組。與NC組相比,siRNA3組C/EBPβ、C/EBPδ與PPARγ基因相對表達(dá)量均極顯著下降(P<0.01)(圖10);與NC組相比,siRNA3組C/EBPβ蛋白表達(dá)水平極顯著降低(P<0.01),PPARγ蛋白表達(dá)水平無顯著變化(P>0.05)(圖11)。
A、B,在3T3-L1細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染3條PCAF siRNA后PCAF蛋白的表達(dá)水平
圖9 油紅O染色結(jié)果(40×)
雙熒光素酶報告試驗(yàn)結(jié)果顯示,與Blank+PCAF 3′-UTR、mimics+vehicle和NC+PCAF 3′-UTR相比較,mimics+PCAF 3′-UTR組中雙熒光素酶活性均無顯著差異(P>0.05)(圖12),說明miR-140-5p與PCAF基因無靶標(biāo)關(guān)系。
圖12 各組雙熒光素酶相對活性
脂肪代謝及分化與動物的生長發(fā)育息息相關(guān),miRNA在脂肪分化過程中的作用與功能具有重要意義。研究表明,在ST2細(xì)胞成脂分化過程中,在細(xì)胞匯合至100%的第2天添加誘導(dǎo)分化液,miR-140-5p的表達(dá)水平在誘導(dǎo)分化前1 d升高,在誘導(dǎo)分化后第1天達(dá)到最高值[7]。本研究在細(xì)胞匯合至100%當(dāng)天添加誘導(dǎo)分化液,結(jié)果顯示,3T3-L1細(xì)胞在誘導(dǎo)分化當(dāng)天miR-140-5p表達(dá)水平極顯著升高,在誘導(dǎo)后第1天miR-140-5p表達(dá)量達(dá)到峰值,與ST2細(xì)胞的研究結(jié)果基本一致。其原因可能在于:當(dāng)細(xì)胞匯合100%時,3T3-L1細(xì)胞達(dá)到了細(xì)胞接觸抑制時期,這時期為前體脂肪細(xì)胞分化第一階段(克隆增殖階段),且細(xì)胞在接觸抑制后很快進(jìn)入第二階段(終末分化階段),為了避免錯過分化第一階段,所以本研究中誘導(dǎo)分化時間選擇在這一時期。但本試驗(yàn)結(jié)果顯示,在誘導(dǎo)分化后第1天miR-140-5p水平達(dá)到峰值,與上述文獻(xiàn)一致,這個峰值可能代表著細(xì)胞進(jìn)入了分化的第二階段,而造成細(xì)胞分化第一階段到第二階段的原因可能是添加誘導(dǎo)分化試劑引起的。miR-140-5p在細(xì)胞分化第一階段與第二階段均顯著增高,這說明miR-140-5p在3T3-L1細(xì)胞分化過程中扮演重要角色。本研究通過過表達(dá)miR-140-5p,發(fā)現(xiàn)miR-140-5p能夠促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞的成脂分化,并且上調(diào)成脂分化相關(guān)基因PPARγ、C/EBPβ和C/EBPδ的表達(dá)。
為了探究miR-140-5p的成脂調(diào)控作用,利用TargetScan與miRBase等靶基因預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測miR-140-5p的下游靶基因,從中選擇與脂肪分化相關(guān)的PCAF基因作為研究對象。有研究表明,PCAF基因在3T3-L1細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用[11]。本研究結(jié)果證明,與NC組相比,miR-140-5p mimics組PCAF基因的表達(dá)量上調(diào),miR-140-5p inhibitor組PCAF基因表達(dá)量下降,說明miR-140-5p可影響PCAF基因的表達(dá)。與轉(zhuǎn)染空載體對照組相比,PCAF基因高表達(dá)后脂滴明顯增多,且C/EBPβ、C/EBPδ與PPARγ的轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)水平均上升;相反,敲低PCAF抑制3T3-L1細(xì)胞分化為脂滴,且C/EBPβ、C/EBPδ與PPARγ的轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)水平均不同程度地下降,說明PCAF是通過正調(diào)控C/EBPβ、C/EBPδ與PPARγ基因促進(jìn)3T3-L1細(xì)胞成脂分化的。盡管組蛋白乙?;瘜χ炯?xì)胞分化調(diào)控的研究較少,但目前的文章顯示組蛋白乙?;揎椝脚c成脂分化水平呈正相關(guān)[18]。Jin等[19]研究發(fā)現(xiàn),PCAF通過調(diào)節(jié)PPARγ的表達(dá)來促進(jìn)脂肪的發(fā)生,并通過影響Prdm16的表達(dá)來調(diào)節(jié)棕色脂肪的發(fā)生。除此之外,C/EBPβ轉(zhuǎn)錄活性也受PCAF的調(diào)節(jié),PCAF可促進(jìn)前脂肪細(xì)胞中C/EBPβ乙?;痆20],且增強(qiáng)前脂肪細(xì)胞分化過程中C/EBPα的轉(zhuǎn)錄激活,從而提高分化效率[21]。以上結(jié)果說明,PCAF在細(xì)胞分化過程中的功能是通過調(diào)控PPARγ與C/EBPs來實(shí)現(xiàn)的,由此可得,miR-140-5p可通過miR-140-5p/PCAF/C/EBPs、PPARγ促進(jìn)細(xì)胞成脂分化。
由于miR-140-5p和PCAF的正相關(guān)關(guān)系與miRNA對靶基因的調(diào)控作用機(jī)制不一致,PCAF 3′-UTR與miR-140-5p的預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)序列比對結(jié)果顯示,其預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)在多物種間序列保守性較高,但雙熒光素酶試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果卻顯示二者并無靶標(biāo)關(guān)系。因此,miR-140-5p可能是通過靶向其他基因間接影響了PCAF的表達(dá),但具體通路并不清晰。利用TargetScan與miRBase等預(yù)測靶基因的網(wǎng)站,預(yù)測miR-140-5p的其他靶基因,其中一些靶基因可能在miR-140-5p與PCAF基因之間具有一些作用,如E3泛素蛋白連接酶-1(siah E3 ubiquitin protein ligase 1,Siah1)、E3泛素蛋白連接酶UBR5(ubiquitin protein ligase E3 component n-recognin 5,UBR5)、組蛋白脫乙酰酶4(histone deacetylase 4,HDAC4)、組蛋白脫乙酰酶7(histone deacetylase7,HDAC7)等基因。Siah1是一種泛素連接酶,通過降解蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白平衡,且是miR-140-5p的預(yù)測靶基因,如若Siah1可泛素化PCAF使其降解,而miR-140-5p又成功靶向且負(fù)調(diào)控Siah1,這時Siah1就具有了在miR-140-5p與PCAF之間發(fā)揮作用的潛質(zhì)。而UBR5也是泛素蛋白連接酶之一,可能與Siah1具有類似功能。HDAC4和HDAC7是組蛋白脫乙酰酶,其作用與組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶PCAF相反,且在細(xì)胞核內(nèi)組蛋白乙?;c組蛋白去乙?;^程處于動態(tài)平衡,并由這2種酶共同調(diào)控。miR-140-5p的預(yù)測靶基因中有HDAC4和HDAC7,所以miR-140-5p極有可能通過負(fù)調(diào)控HDAC4或HDAC7的表達(dá)而間接影響了PCAF基因的表達(dá)。
本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),內(nèi)源性miR-140-5p在成脂分化的克隆增殖階段與終末分化階段都明顯升高,miR-140-5p通過上調(diào)PCAF的表達(dá)促進(jìn)PPARγ和C/EBPs表達(dá)而促進(jìn)前脂肪細(xì)胞成脂分化。雙熒光素酶試驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-140-5p與PCAF之間無靶標(biāo)關(guān)系,說明miR-140-5p可能通過間接作用于PCAF而促進(jìn)前脂肪細(xì)胞的分化。