外源性RFRP-3和MLT對雄鼠初情期生長及繁殖性能的影響

潘建秋，劉付穗，吳曼莉，江丹莉，歐陽宏佳，沈 栩，許丹寧，賀建華，黃運(yùn)茂

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣州 510225；3.廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510225)

RF酰胺相關(guān)肽(RF-amide-related peptide,RFRP)是繼鳥類促性腺激素抑制激素(gonadotrophin inhibitory hormone,GnIH)被發(fā)現(xiàn)以后在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的GnIH的同源物[1-3]。RFRP是目前哺乳動(dòng)物中主要的繁殖活動(dòng)負(fù)向調(diào)控因子，盡管不同物種中的RFRP分布有所不同，但其神經(jīng)元多數(shù)集中投射到與繁殖調(diào)控、攝食有關(guān)的區(qū)域，可能參與繁殖行為與攝食行為調(diào)控[4-5]。研究顯示，RFRP-3可引起大鼠附睪管的劑量依賴性組織學(xué)改變，如精子數(shù)量下降及退化和空泡化的附睪上皮細(xì)胞增加[6]；生長期大鼠注射RFRP-3可顯著降低血清黃體生成素(luteinizing hormone，LH)水平，睪丸重量也受到顯著抑制，但生長激素(growth hormone，GH)水平提高，小鼠體重增長[7]；在成年雄性大鼠中，給予RFRP-3也可抑制LH分泌和雄性性行為，并刺激GH釋放[8]；大鼠腹腔注射RFRP-3后體重顯著增加，采食次數(shù)增加，但采食量無顯著性差異[9]；而對大鼠腦內(nèi)注射RFRP-3發(fā)現(xiàn)，50和100 ng劑量的RFRP-3顯著降低了采食量，25和200 ng對其沒有影響[10]。由此可見，RFRP-3在動(dòng)物生長發(fā)育及繁殖活動(dòng)調(diào)控中均發(fā)揮著重要作用，但發(fā)揮作用的具體途徑仍有待探索。

褪黑素(melatonin,MLT)是一種吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素，其分泌具有晝夜節(jié)律性，參與調(diào)控機(jī)體生殖節(jié)律、代謝活動(dòng)、免疫功能等[11]。研究發(fā)現(xiàn)，注射外源性MLT可促進(jìn)大鼠體重增長[12]，斷奶后綿羊埋植或飼喂MLT均可顯著提高其平均日增重，促進(jìn)其生長性能[13]。另外，MLT可通過下丘腦-垂體-性腺(hypothalamic pituitary gonadal axis,HPG)軸，在下丘腦水平上調(diào)節(jié)促性腺激素的分泌，進(jìn)而影響生殖系統(tǒng)功能[14]；而MLT對生殖系統(tǒng)的影響是可變的，主要取決于動(dòng)物的生理?xiàng)l件和物種；給敘利亞倉鼠睪丸注射MLT，可顯著降低睪酮含量，降低睪丸體積，降低雄激素合成[15]；但長期使用MLT可誘導(dǎo)梅花鹿的睪丸早期發(fā)育[16]；埋植MLT可促進(jìn)銀狐的精子生成[17]；皮下注射褪黑激素可增加山羊睪酮分泌[18]；綿羊褪黑激素處理組的生育能力也較對照組高[19]。

研究表明，松果體分泌的MLT對RFRP-3的生成具有調(diào)控作用[20]。在哺乳動(dòng)物上，光信號(hào)主要通過影響松果體MLT的生產(chǎn)和分泌來調(diào)控動(dòng)物繁殖活動(dòng)變化。在敘利亞倉鼠上，短光照下會(huì)降低下丘腦RFRP表達(dá)，切除松果體后RFRP的光周期變化會(huì)消失，而長日照下注射MLT可使倉鼠RFRP的表達(dá)受到抑制[14]；在西伯利亞倉鼠上，GnIH的表達(dá)和釋放受光周期和MLT調(diào)節(jié)[21]。表明MLT和RFRP-3均會(huì)影響到哺乳動(dòng)物的生長與繁殖，且MLT可能參與RFRP-3分泌調(diào)控，但兩者之間的關(guān)系如何？尤其是在哺乳動(dòng)物初情期對生長與繁殖性能有什么影響？目前并不清楚。鑒于此，本試驗(yàn)以初情期雄性昆明小鼠為對象，研究單獨(dú)給予雄鼠外源性RFRP-3、MLT及混合給予RFRP-3和MLT對初情期雄鼠體重增長、飼料轉(zhuǎn)化、激素生成及睪丸發(fā)育的影響，以期揭示RFRP-3和MLT對初情期昆明小鼠生長、繁殖性能的影響及兩者間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

促黃體生成激素ELISA試劑盒、睪酮激素(TESTO)ELISA試劑盒均購自上海博谷生物科技有限公司；鼠RFRP-3多肽(SVTFQELKDWGAKK-DIKMSPAPANKVPHSAANLPLRF)由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司化學(xué)合成，純度≥98%；MLT購自Sigma公司；ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix購自東洋紡(上海)生物科技有限公司；Trizol、PowerUPTMSYBRTMGreen Master Mix均購自Applied Biosystems公司。

低溫高速離心機(jī)(ST8R)購自Thermo公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(ELX800)購自伯騰儀器公司；PCR擴(kuò)增儀、實(shí)時(shí)熒光定量儀均購自ABI公司；勻漿機(jī)購自IKA公司。

1.2 樣品采集

45只體重均一、健康的42日齡昆明小鼠雄鼠SPF級，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證：SCXK(粵)2018-0034。小鼠飼養(yǎng)于同一房間內(nèi)，給予12 h人工光照(12L∶12D)，單籠飼養(yǎng)(1只/籠)，飼養(yǎng)環(huán)境均處于同一水平：溫度25 ℃±3 ℃；相對濕度40%～70%，氨濃度≤15 mg/m3，每天定時(shí)更換墊料，并提供充足的飼糧和飲用水。

小鼠預(yù)飼7 d后，正式試驗(yàn)開始時(shí)(第0天(d0)),隨機(jī)選取5只小鼠屠宰，采集睪丸檢查發(fā)育情況，并留做組織切片觀察；剩余40只小鼠隨機(jī)分為4組(n=10)，分別為RFRP-3組、MLT組、RFRP-3和MLT混合組、對照組。試驗(yàn)第0～10(d10)天每天對雄鼠進(jìn)行肌肉注射，RFRP-3組注射1.5 mg/kg RFRP-3溶液；MLT組注射1.5 mg/kg MLT溶液；RFRP-3和MLT混合組同時(shí)注射1.5 mg/kg RFRP-3和1.5 mg/kg MLT溶液；對照組注射等量生理鹽水。在第0和10天對每組小鼠進(jìn)行稱重，并記錄其在整個(gè)試驗(yàn)期的采食量；在第10天注射完藥物30 min后開始采樣(n=10)，用乙醚麻醉小鼠，然后對雄鼠進(jìn)行眼球摘除采血，分離血清，―20 ℃保存用于激素檢測。采血后，屠宰小鼠采集小鼠下丘腦和垂體組織，―80 ℃保存，用于檢測生長和生殖相關(guān)基因表達(dá)。采集睪丸，稱量睪丸重并留做組織切片觀察。

1.3 方法

1.3.1 小鼠生長性能相關(guān)指標(biāo)計(jì)算 小鼠增重、平均采食量、料重比(F/G)及睪丸性腺指數(shù)(gonado somatic index,GSI)均按以下公式計(jì)算：

小鼠增重(g)=小鼠終末體重-小鼠初始體重

平均采食量(g/只)=總采食量/小鼠數(shù)量

料重比=平均采食量/小鼠增重

GSI(%)=睪丸重量/小鼠體重×100%

1.3.2 石蠟切片制作及分析 ①小鼠睪丸置于福爾馬林固定液中固定；②將固定好后的睪丸放進(jìn)包埋框中，流水沖洗，至少2 h；③脫水、透明：50%酒精2 h；70%酒精2 h；80%酒精2 h或過夜；90%酒精2 h；95%酒精2 h；無水酒精Ⅰ 1 h；無水酒精Ⅱ 1 h；二甲苯Ⅰ 30 min；二甲苯Ⅱ 30 min；二甲苯∶石蠟為1∶1，15 min；石蠟溶液Ⅰ 1 h；石蠟溶液Ⅱ 1 h；④石蠟包埋；⑤5 μm切片；⑥40 ℃水浴展片，撈片于載玻片上，于45 ℃烘干8 h以上；⑦HE染色：二甲苯Ⅰ 5 min；二甲苯Ⅱ 5 min；95%酒精2 min；90%酒精2 min；80%酒精2 min；70%酒精2 min；50%酒精2 min；蒸餾水2 min；蘇木素18 min；流水沖洗15 min；1%鹽酸酒精5 s；流水沖洗30 min；伊紅溶液1 min；80%酒精2 min；90%酒精2 min；95%酒精2 min；無水酒精Ⅰ 2 min；無水酒精Ⅱ 2 min；二甲苯Ⅰ 5 min；二甲苯Ⅱ 5 min；⑧中性樹膠封片。

1.3.3 睪丸組織切片觀察及分析 在CaseViewer看圖軟件上截取睪丸切片5×、10×、20×和40×的截圖，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0分析軟件，統(tǒng)一以毫米(mm)作為標(biāo)準(zhǔn)單位，在每張切片5×截圖中測量5個(gè)曲精小管面積(mm2)；計(jì)算每張切片3個(gè)10×截圖中曲精小管數(shù)量(個(gè))，求出單位面積曲精小管數(shù)量(個(gè)/mm2)，測量生精上皮厚度，其為視野內(nèi)圓形曲精小管內(nèi)各階段生精細(xì)胞及支持細(xì)胞組成的生精上皮厚度(μm)；計(jì)算每張切片3個(gè)20×截圖中間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量(個(gè))，計(jì)算出視野面積(mm2)，求出間質(zhì)細(xì)胞密度(個(gè)/mm2)；計(jì)數(shù)每張切片3個(gè)40×截圖中曲精小管內(nèi)各級生精細(xì)胞數(shù)量(個(gè))。

1.3.4 生殖激素水平測定 血清中睪酮和LH的測定方法按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。①取出試劑盒室溫(20～25 ℃)放置30 min；②分組：取出96孔板，分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品組(6個(gè)濃度)、空白孔、待測樣品，均設(shè)2個(gè)重復(fù)；③加樣：依照標(biāo)準(zhǔn)品的順序分別加入100 μL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液于空白微孔中；空白對照孔加入100 μL蒸餾水；其余微孔中加入100 μL的待測樣本；④加酶標(biāo)溶液：標(biāo)準(zhǔn)品組、待測樣本組各孔中加入50 μL酶標(biāo)溶液(空白對照孔除外)；⑤溫育：酶標(biāo)板用封板紙密封后，放入濕盒內(nèi)于37 ℃恒溫孵育1 h；⑥洗板：用稀釋后的洗滌液注滿每孔，靜置15～30 s，充分清洗酶標(biāo)板5次，用吸水紙徹底拍干；⑦顯色：各孔加入顯色劑A液50 μL后，再加入顯色劑B液50 μL；⑧終止：37 ℃下避光反應(yīng)10～15 min，加入50 μL終止液；⑨讀板：在450 nm波長讀取各孔的D值。

1.3.5 基因相對表達(dá)量測定 采用Trizol方法提取下丘腦和垂體組織RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定下丘腦促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)、RFRP-3、褪黑素受體1A(melatonin receptor 1A，Mtnr1A)及垂體LH、GH基因mRNA的相對表達(dá)水平。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中參考序列，利用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)以上基因的定量引物和內(nèi)參基因β-actin引物，引物序列見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系20 μL：PowerUPTMSYBRTMGreen Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.2 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8.6 μL。PCR反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，退火(退火溫度見表1)1 min，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，用β-actin基因進(jìn)行校正。結(jié)果采用2―ΔΔCt法進(jìn)行處理。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物信息

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠生長性能

由表2可知，RFRP-3和MLT混合組及MLT組小鼠平均增重極顯著或顯著高于RFRP-3組(P<0.01；P<0.05)；料重比極顯著低于RFRP-3組(P<0.01)；其余指標(biāo)各組間差異均不顯著(P>0.05)。

表2 小鼠生長性能

2.2 小鼠睪丸組織發(fā)育

由表3可知，試驗(yàn)第0天小鼠GSI較高，且極顯著高于第10天的各組GSI(P<0.01)；第10天MLT組小鼠睪丸生精細(xì)胞數(shù)量最多，顯著或極顯著高于其余各組(P<0.05；P<0.01)，RFRP-3組生精細(xì)胞數(shù)量最少；第10天MLT組小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞密度極顯著高于對照組(P<0.01)；第0天對照組小鼠睪丸單位面積曲精小管數(shù)量最多，顯著高于第10天對照組(P<0.05)，與第10天MLT組較為接近，第10天RFRP-3及RFRP-3和MLT混合組小鼠睪丸曲精小管數(shù)量極顯著低于其他3組(P<0.01)；第10天MLT組小鼠睪丸生精上皮厚度與對照組接近，且極顯著高于RFRP-3及RFRP-3和MLT混合組(P<0.01)；第0天小鼠睪丸曲精小管面積極顯著低于第10天MLT組(P<0.01)。

由圖1可知，第0天小鼠睪丸曲精小管內(nèi)精原細(xì)胞較多，但仍無精子生成；第10天對照組睪丸曲精小管內(nèi)管腔擴(kuò)張，可見少量精子細(xì)胞，而MLT組睪丸曲精小管之間的間隙變小，曲精小管內(nèi)精原細(xì)胞增多，初級精母細(xì)胞增多，精子細(xì)胞增多，支持細(xì)胞增多；RFRP-3組睪丸曲精小管之間的間隙明顯增寬，曲精小管內(nèi)各級生精細(xì)胞明顯減少，小管中央處精子細(xì)胞數(shù)量減少，睪丸間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少；RFRP-3和MLT混合組睪丸曲細(xì)精小管之間的間隙增寬，部分曲精小管管腔擴(kuò)張，小管內(nèi)支持細(xì)胞數(shù)量減少，小管邊界模糊，其曲精小管內(nèi)各級生精細(xì)胞數(shù)量減少。

A，對照組(d0)；B，對照組(d10)；C，MLT組(d10)；D，RFRP-3組(d10)；E，RFRP-3和MLT混合組(d10)

2.3 血漿生殖激素水平

由表4可知，MLT組小鼠血漿LH水平最高，顯著高于RFRP-3和MLT混合組(P<0.05)，與對照組和RFRP-3組均無顯著差異(P>0.05)；MLT組睪酮濃度最高，顯著或極顯著高于另外3組(P<0.05；P<0.01)。

表4 外源性MLT和RFRP-3對小鼠血漿生殖激素水平的影響

2.4 生長和生殖相關(guān)基因表達(dá)

由表5可知，在下丘腦中，MLT組小鼠GnRH基因mRNA相對表達(dá)量最高，其余3組相對表達(dá)量接近，各組間不存在顯著性差異(P>0.05)；RFRP-3組小鼠RFRP-3基因表達(dá)量最高，顯著高于MLT和對照組(P<0.05)，其余各組間均無顯著差異(P>0.05)；MLT組小鼠Mtnr1A基因表達(dá)量最高，極顯著高于RFRP-3組(P<0.01)。在垂體中，MLT組小鼠LH基因mRNA表達(dá)量最高，極顯著或顯著高于其余3組(P<0.01；P<0.05)，RFRP-3和MLT混合組LH基因表達(dá)量高于RFRP-3組和對照組，但差異不顯著(P>0.05)；MLT組GH基因表達(dá)量最高，極顯著高于對照組和RFRP-3組(P<0.01)。

表5 外源性MLT和RFRP-3對小鼠生長和生殖相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，對Zucker大鼠和Sprague Dawley大鼠灌服10 mg/kg MLT可促進(jìn)2種大鼠的體重增長，且Sprague Dawley大鼠料重比顯著增加[12]；MLT可與其受體結(jié)合，促進(jìn)雞GH分泌，從而促進(jìn)生長[22]；綠光刺激可增強(qiáng)雞胚M(jìn)LT的分泌和GH-IGF-1軸的上調(diào)[23]；大鼠腦室內(nèi)注射RFRP-3抑制大鼠體重增長，但其GH分泌顯著增加[24]；RFRP-3可顯著抑制羊垂體促性腺激素的分泌，但對GH無顯著性影響[25]；順氯氨鉑(cisplatin,CP)和MLT共同處理下MLT可顯著緩解CP對小鼠食物攝入量、體重、尿液和糞便排出量等的抑制作用[26]。本研究中，MLT及RFRP-3和MLT混合組平均增重顯著高于RFRP-3組，RFRP-3組略低于對照組，但無顯著性差異；比較雄鼠料重比則發(fā)現(xiàn)RFRP-3組最高，顯著高于MLT及RFRP-3和MLT混合組，對照組料重比則與MLT及RFRP-3和MLT混合組接近；檢測垂體GH基因的相對表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，給予外源性MLT的MLT組及RFRP-3和MLT混合組GH基因表達(dá)量均高于對照組，而給予了RFRP-3的RFRP-3組GH基因表達(dá)量與對照組接近，但略高于對照組。本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果一致，MLT可通過促進(jìn)GH的表達(dá)降低小鼠料重比和提高小鼠增重，而RFRP-3通過提高小鼠料重比來抑制其增重；當(dāng)同時(shí)給予MLT和RFRP-3時(shí)，依然能一定程度促進(jìn)小鼠增重，提示MLT可在一定程度上緩解RFRP-3對小鼠生長性能的抑制作用。

研究表明，給小鼠腹腔注射20 mg/kg MLT可促進(jìn)睪丸體積增大，且顯著增加曲細(xì)精管面積、精母細(xì)胞和精子細(xì)胞數(shù)量[27]；MLT可保護(hù)小鼠睪丸熱應(yīng)激損傷[28]，其對糖尿病大鼠睪丸的細(xì)胞、睪酮激素也具有保護(hù)作用[29]。RFRP-3對小鼠睪丸發(fā)育和精子發(fā)生具有抑制作用。Sumit等[30]研究發(fā)現(xiàn)，每8 h對小鼠注射血清素和多巴胺前體，其RFRP-3神經(jīng)元數(shù)量極顯著增加，小鼠睪丸生精上皮層減少，間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，曲細(xì)精管管腔擴(kuò)張。本研究檢測雄性小鼠的睪丸發(fā)育情況發(fā)現(xiàn)，MLT組GSI略高于第10天對照組，RFRP-3組GSI略低于第10天對照組，RFRP-3和MLT混合組GSI與第10天對照組接近。觀察睪丸組織切片發(fā)現(xiàn)，MLT組各級生精細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量均高于RFRP-3及RFRP-3和MLT混合組，兩組睪丸單位面積內(nèi)曲精小管數(shù)量減少，且曲精小管管腔擴(kuò)張，各級生精細(xì)胞數(shù)量減少。本試驗(yàn)結(jié)果與以上研究結(jié)果一致。表明外源性MLT可促進(jìn)雄鼠睪丸發(fā)育，外源性RFRP-3則抑制睪丸發(fā)育；當(dāng)同時(shí)給予MLT和RFRP-3時(shí)，睪丸發(fā)育仍受到一定抑制。研究發(fā)現(xiàn)，切除松果體倉鼠注射MLT可抑制RFRP-3表達(dá)[20]；MLT能調(diào)控季節(jié)性繁殖倉鼠RFRP-3基因的表達(dá)及其與GnRH系統(tǒng)的相互作用[20-21]；RFRP-3可通過下丘腦或垂體水平抑制促性腺激素LH基因的表達(dá)和分泌，在大鼠、小鼠相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)RFRP-3可顯著抑制LH分泌[31-33]。通過檢測血清激素水平發(fā)現(xiàn)，MLT和RFRP-3對LH分泌的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但顯著影響睪酮分泌，MLT組睪酮水平極顯著高于RFRP-3及RFRP-3和MLT混合組，對照組睪酮水平居中。在基因表達(dá)層面，MLT和RFRP-3對下丘腦RFRP-3、Mtnr1A基因和垂體LH基因表達(dá)的影響較為顯著，其中RFRP-3組RFRP-3基因表達(dá)量最高，RFRP-3和MLT混合組次之，而MLT組RFRP-3基因表達(dá)量最低，顯著低于RFRP-3組；MLT組Mtnr1A、LH基因表達(dá)量最高，均極顯著高于RFRP-3組；RFRP-3組Mtnr1A、LH基因表達(dá)量最低，RFRP-3和MLT混合組和對照組Mtnr1A、LH基因表達(dá)量接近。表明外源性MLT可抑制RFRP-3基因表達(dá)并調(diào)節(jié)LH基因的表達(dá)和分泌；外源性RFRP-3可調(diào)節(jié)LH基因的表達(dá)和分泌，進(jìn)而抑制睪酮分泌。綜上，外源性RFRP-3可通過抑制LH基因表達(dá)和睪酮分泌進(jìn)而影響小鼠睪丸的發(fā)育，最終抑制小鼠的繁殖性能；而外源性MLT可通過抑制RFRP-3基因的表達(dá)促進(jìn)Mtnr1A和LH基因的表達(dá)，從而促進(jìn)睪酮的分泌，且MLT也可能直接作用于睪丸促進(jìn)睪丸精子的發(fā)生，從整體上提高小鼠的繁殖性能；當(dāng)同時(shí)給予外源性RFRP-3和MLT時(shí)，MLT可在一定程度上緩解RFRP-3的抑制作用，促進(jìn)LH基因表達(dá)及睪丸發(fā)育。

松果體分泌的MLT除通過在生殖軸上游的下丘腦-腺垂層面調(diào)節(jié)睪丸功能外，也可直接在睪丸中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。研究表明，MLT可在睪丸中合成，其可能通過調(diào)節(jié)睪丸激素分泌、FSH作用及睪丸體細(xì)胞(支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞)和生殖細(xì)胞的增殖和分化來促進(jìn)睪丸發(fā)育[27,34-36]。RFRP-3作為生殖軸上游的主要抑制因子，可抑制性腺激素生成和交配行為[5]，同時(shí)RFRP-3在睪丸中也有表達(dá)，且在間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)量最高，提示其可能在睪丸中直接發(fā)揮調(diào)控作用[37]。結(jié)合本研究結(jié)果，提示MLT和RFRP-3既可以通過下丘腦-垂體-性腺軸參與調(diào)控小鼠繁殖性能，也可直接在睪丸中發(fā)揮作用，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

外源性MLT可通過促進(jìn)GH表達(dá)提高小鼠增重并降低料重比，通過促進(jìn)Mtnr1A和LH表達(dá)抑制RFRP-3表達(dá)，促進(jìn)睪酮分泌和睪丸發(fā)育；外源性RFRP-3則降低小鼠增重和提高料重比，并通過抑制LH表達(dá)和睪酮分泌，對小鼠睪丸發(fā)育產(chǎn)生抑制作用。