石榴皮多酚的提取、制備及其應用研究進展

張佳浩，李道明，鐘小榮，劉寧

（陜西科技大學食品與生物工程學院，陜西 西安 710021）

石榴是一種藥食同源的食品，具有重要的應用價值。鮮石榴可食用，酸甜適口；石榴汁可以作為飲品，有美白的功效；石榴籽可提取油脂，提取的油脂富含石榴酸（9c，11t，13c-C18∶3），具有抗氧化、抗炎和抗癌癥等功效[1]；石榴皮可作中藥，具有澀腸止瀉、止血、驅蟲等功效[2]。近年來，關于石榴皮成分的研究日漸清晰[3]。研究發(fā)現石榴皮中含有豐富的多酚，主要包括黃酮類（以槲皮素為主）和單寧類（以安石榴苷、安石榴林和鞣花酸為主）；此外，還含有有機酸、酚酸、甾體類、萜類、脂肪酸、甘油三酯和生物堿類等[4]。研究表明石榴皮多酚具有良好的抗氧化性，在食品領域有作為天然抗氧劑的應用前景[5-7]。

石榴皮中單寧類（鞣質）種類豐富、含量高；石榴皮單寧多以游離形式存在，大多數為水解單寧和縮合單寧，少數以結合形式存在[8]。石榴皮單寧對水質的要求較高，原因在于石榴皮單寧對水中的金屬離子十分敏感（研究表明石榴皮單寧在純水中的提取量是生活飲用水中的近30倍）[9]。近年來，隨著提取技術的進步和發(fā)展，從石榴皮中提取多酚的方法日益豐富[10]。但石榴皮成分的復雜性和缺少商業(yè)上有價值的標準，使得石榴皮多酚的提取仍然面臨許多問題。目前從石榴皮中提取多酚的方法主要集中在乙醇粗提取上[11]，提取后對提取物采用大孔樹脂進行富集，可以較大程度上提高多酚純度，但多酚回收率低，工業(yè)應用前景差；此外，由于提取純化不徹底，導致檢測成分數量眾多給分離造成困難，并且部分多酚溶解性差的特性也是制約檢測方法發(fā)展的重要因素。

安石榴苷和鞣花酸為石榴皮多酚中的主要成分[12]，近年來因其在醫(yī)療上具有抗炎抑菌、清除自由基[13]、抗腫瘤和抗癌[14]、提高機體免疫力[15]等功效而引起了廣泛關注；此外，安石榴苷和鞣花酸在食品行業(yè)中具有防止脂質氧化、延緩有毒氧化產物的形成和延長食品保質期等諸多功能[16]。安石榴苷分子量大、性質不穩(wěn)定，但作為一種水溶性多酚，其提取難度小、易操作；鞣花酸結構簡單，化學性質穩(wěn)定且來源豐富，但是鞣花酸難溶于水或油，目前多采用二甲基亞砜或氯仿溶解提取。就現階段的研究來說，鞣花酸的提取方法種類多樣但是效率低、損耗大、產率低且對環(huán)境不友好；而溶解效果差是限制其發(fā)展的主要因素。

本文綜述了石榴皮多酚中的主要成分安石榴苷和鞣花酸的研究現狀，針對石榴皮多酚的純化檢測及其功能性、安石榴苷兩種同分異構體轉化、鞣花酸的溶解及富集等問題進行介紹，以期為石榴皮多酚提取、檢測、改性等研究提供參考。

1 石榴皮多酚提取及應用研究進展

1.1 石榴皮多酚的粗提取

目前，石榴皮多酚的提取主要依靠溶劑與輔助手段（超聲波[17-18]、微波[19-20]、超高壓[21-22]、酶法[23]、超臨界技術[24]等）相結合，利用大多數酚溶于水或甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑進行提取[25-26]。其中甲醇可溶解低分子量的單寧，并能提取出石榴皮中大量的酶，故提取后樣品通常需要除掉提取出的酶以防止發(fā)生反應[27]，而丙酮則是提取高分子量單寧的首選[28]。大多數有機溶劑提取石榴皮多酚時，所提取出的成分復雜且不利于分析和純化，同時提取不徹底，仍然存在一定量不能被提取的多酚（主要為結合態(tài)多酚）和難溶于水的鞣花酸[29]。部分溶劑對石榴皮多酚表現出優(yōu)越的溶解性，但存在對人體有害、易燃易爆和分離純化難度大等問題。通過有機溶劑提取后的粗多酚，會進一步采用大孔樹脂分離純化[30]。但存在吸附和解吸耗時長，并且存在部分多酚無法洗脫等問題。

近年來，低共熔溶劑因其高效的溶解性、可降解性及綠色環(huán)保性，在天然產物的提取方面引起了廣泛關注[31]。但目前關于其應用于石榴皮多酚提取的研究還未有報道。

1.2 石榴皮多酚的純化和檢測

石榴皮多酚粗提取物的純化多采用兩步純化的方法，第一步純化多采用高速逆流色譜；第二步采用色譜柱吸附（多為反相色譜柱）[32]。純化后極大的提高了石榴皮多酚的純度，特別是提高了安石榴苷的純度?，F階段對安石榴苷的純化已經達到較高水平，如表1所示，安石榴苷純化可達90%以上。由于安石榴苷存在同分異構體[33-34]，所以目前多采用反相高效液相色譜（reversed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）對安石榴苷進行檢測[35]，反相高效液相色譜可以對安石榴苷的兩種同分異構體進行分離測定[36-37]。此外，研究發(fā)現兩種安石榴苷在一定比例和pH值下可以相互轉化，但其相互轉化的具體原因未知[38-39]。

表1 安石榴苷的提取及純化Table 1 Extraction and purification of punicalagin

1.3 石榴皮多酚的應用研究進展

1.3.1 石榴皮多酚的抗氧化作用

食品行業(yè)中，石榴皮多酚的抗氧化性受到了廣泛關注，它所代表的是一種或幾種天然抗氧化劑。原田等[41]研究發(fā)現游離型石榴皮多酚為主要多酚成分，游離態(tài)石榴皮多酚抗氧化能力數值是結合態(tài)的10倍～20倍，石榴皮的外皮、中皮、內皮抗氧化性差別不大。黃戴純等[42]利用大孔樹脂純化得到純度約90%的多酚，在清除 1，1-二苯基-2-苦肼基 (2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH)自由基和羥基自由基效果遠超粗提物，但是與維生素C相比清除率相差較大。唐遠謀等[43]通過比較多酚體外抗氧化作用，以沒食子酸和石榴皮純提物為參照，發(fā)現沒食子酸、石榴皮粗提物和純提物對DPPH自由基，羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率存在差異，石榴皮多酚在體外具有較強的抗氧化作用。另一方面研究表明石榴皮多酚的抗氧化性優(yōu)于2，6-二叔丁基對甲苯酚（2，6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT）、丁基羥基茴香醚（butylated hydroxyanisole，BHA）等抗氧化劑[44]。謝貞建等[44]在相同的儲存時間和添加量下比較了對大豆油氧化的抑制能力，發(fā)現抗氧化能力大小順序為石榴皮提取物＞茶多酚＞BHA＞竹葉提取物＞甘草提取物＞迷迭香提取物＞BHT。由此可知，石榴皮多酚有用于油脂中作為天然的抗氧化劑來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的特丁基對苯二酚（tertbutylhydroquinone，TBHQ）的應用前景。目前研究表明TBHQ對人體存在潛在的風險，歐盟標準中已經禁止在食用油中添加TBHQ。相反，中國和美國等國家仍然把TBHQ作為食用油中的抗氧劑使用。在未來抗氧化劑的研發(fā)中，天然抗氧化劑憑借來源天然、可再生、綠色環(huán)保等優(yōu)勢必將代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化學合成抗氧化劑。但石榴皮多酚微溶于油脂，因此未來對石榴皮多酚進行改性，在保留其抗氧化能力的同時提高其脂溶性將成為重點研究方向。

1.3.2 石榴皮多酚對脂肪酶的抑制作用

除具有優(yōu)異的抗氧化性能外，研究發(fā)現石榴皮多酚還存在其他重要功能。早在2005年，研究者發(fā)現從茶葉中提取的多酚對脂肪酶具有抑制作用，其中沒食子酸表現的抑制作用最為突出[45]。先前研究表明胰脂肪酶抑制劑的植物化學物質主要包括皂苷、多酚、黃酮類化合物、萜類和咖啡因[28]。相關專利指出，結合六氫聯苯酚基團（hexahydroxydiphe-noy，HHDP）的相關鞣花單寧也有很好的抑制作用，而已知石榴皮多酚中安石榴苷與鞣花酸存在HHDP基團[46]。蒲博等[47]將純化后的石榴皮多酚作用于脂肪酶，試驗結果表明石榴皮多酚對脂肪酶有抑制作用。因而可將多酚添加到中性油脂中，抑制脂肪酶對中性油脂的利用，開發(fā)降低肥胖率的相關產品；更重要的是，石榴皮多酚的添加并不會改變油脂風味，所以可以添加到黃油、冰激凌、奶油等產品中，降低人體對脂肪的吸收，使產品更加健康[28]。另外也有研究報道石榴皮多酚會造成油脂顏色加深，其對油脂色澤影響的具體機制尚不明確[45]。

1.3.3 石榴皮多酚對亞硝酸鹽的清除和抑菌作用

石榴皮多酚具有清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的功效。綠色蔬菜是膳食硝酸鹽的重要來源。而硝酸鹽和亞硝酸鹽可作為防腐劑和著色劑，在食品中有著廣泛用途[44]。但亞硝胺鹽作為N-亞硝胺的前體物質，對人體的健康會造成威脅。研究發(fā)現，石榴皮多酚能夠清除亞硝酸鹽，且石榴多酚對亞硝胺的阻礙作用隨著濃度和時間的增加而增加，在100℃下，均表現出較強的阻斷能力[48]。此外，石榴皮多酚也表現出良好的抑菌作用，研究表明當丙酮提取多酚液作用于金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、沙門氏菌和大腸桿菌等微生物時，表現出明顯的抑菌作用，其中大腸桿菌的最低抑菌濃度為3.9μmol/mL，痢疾桿菌的最低抑菌濃度為7.8 μmol/mL[49]。

2 安石榴苷

安石榴苷（punicalagin，PC）是石榴皮多酚的成分之一。其作為一種水解單寧，易溶于水，可溶于甲醇、乙醇、乙腈等有機溶劑，其化學性質不穩(wěn)定，容易在高溫或光照下發(fā)生分解[50]。實驗室主要采用酸水解安石榴苷。安石榴苷的相對分子量為1 083，化學式為C48H28O30，分子結構中含有多個酚羥基，具有良好的抗氧化性。安石榴苷結構中含有1個六氫聯苯酚單元、1個gallagyl單元和1個葡萄糖單元[51]。此外，研究發(fā)現安石榴苷存在一對同分異構體[47]。石榴皮經提取及純化，得到的產物中安石榴苷的含量達70%以上，同時安石榴苷在石榴皮多酚中的質量比例最高，可達28.73%，其次為鞣花酸6.23%[35]。

安石榴苷的水解目前的研究主要集中在酸水解，安石榴苷水解可產生一分子鞣花酸和一分子安石榴林，故安石榴苷是鞣花酸的一個重要來源。而安石榴林（punicalin）同樣化學性質不穩(wěn)定，可分解為gallagic。安石榴苷的完全水解產物為鞣花酸與gallagic[52]。安石榴林比安石榴苷少了一個HHDP基團，其分子結構中含有10個酚羥基，同樣具有優(yōu)異的抗氧化能力[50]。研究發(fā)現大量服用安石榴苷后，人體血漿中安石榴苷含量不高，在人體循環(huán)系統(tǒng)中幾乎檢測不到安石榴苷的存在，只有痕量的鞣花酸[32]。

3 鞣花酸

鞣花酸（ellagic acid，EA），又名并沒食子酸、胡頹子酸，鞣花酸的分子式為C14H6O8，相對分子質量為302。鞣花酸是一種多酚二內脂，分子中親酯部分有4個環(huán)、親水部分有4個酚羥基以及兩個內脂環(huán)，正是這些特殊的結構使其水溶性和脂溶性均很低[53]。其微溶于醇，溶于堿、吡啶，不溶于醚。鞣花酸還能與三氯化鐵發(fā)生顯色反應呈藍色，遇硫酸呈黃色。鞣花酸也易與鎂離子等金屬陽離子結合[16]。而鞣花酸在多數有機溶劑中表現出的低溶解性，使鞣花酸的分離容易實現。目前酸水解和堿水解為制備鞣花酸的主要方法。石榴皮多酚中鞣花酸的來源多樣：游離態(tài)的鞣花酸、縮合形式的鞣花單寧、安石榴苷水解以及糖苷等。鞣花酸的來源如圖1所示。其中游離態(tài)為鞣花酸主要存在方式，鞣花單寧和糖苷相結合的鞣花酸也是游離態(tài)鞣花酸的重要來源。

圖1 鞣花酸來源Fig.1 Sources of ellagic acid

3.1 鞣花酸的提取

鞣花酸的分離依靠其溶解性，游離的鞣花酸呈油滴狀難溶于水，分離相對容易，同時鞣花酸的化學性質穩(wěn)定，有很高的利用價值。其次對于高純度鞣花酸檢測方法多樣、簡單，常用的有紫外可見光光度計法和高效液相法[54-57]，具體見表2。

3.2 鞣花酸的制備——酸水解和生物合成法

研究發(fā)現鞣花酸的來源主要有游離態(tài)和結合態(tài)兩類[62]。目前研究是通過控制酸水解的條件如酸濃度、反應溶液種類、溫度和時間等，來實現鞣花單寧和鞣花苷的水解提高鞣花酸的產量。García-Villalba等[51]在90℃下采用4 mol/L的鹽酸溶液水解鞣花單寧，并采用甲醇/二甲基亞砜對其進行二次水解發(fā)現，安石榴苷α、安石榴苷β和安石榴林幾乎可以達到完全水解，并且鞣花酸的含量可達到260.8 mg/g。同時采用丙酮/水進行初步提取，濃縮后冷凍干燥，再進行酸水解試驗，結果發(fā)現在純水中水解的效果優(yōu)于甲醇（在甲醇中容易產生甲基化衍生物）。由于水解后仍然有大量的鞣花酸與顆粒形成小球體，損失嚴重，所以研究者利用二甲基亞砜/甲醇對這部分鞣花酸進行溶解，結果表明相比于直接水解，鞣花酸的含量提升了近5倍，同時二甲基亞砜對gallagic表現出不錯的提取效果。鞣花酸的水解在4 h就已經達到平衡，但是要得到較完全的水解仍然需要24 h[51]?，F階段主要問題還是水解時間過長。但是對于溶劑中存在的鞣花酸和gallagic的分離仍然很困難。

生物合成法是一種利用微生物如黑曲霉、假絲酵母等真菌以沒食子酸為原料，通過酯氧化聚合合成鞣花酸的方法[62]。與化學合成法相似，過程復雜控制難度大且分離困難，反應時間過長，實際應用較為困難。盡管現在仍然處在實驗室研究階段，但是作為一種綠色環(huán)保的方法，具有較好的發(fā)展前景。此外，微生物的水解酶可以作用于與糖苷結合的鞣花酸，相關研究顯示對提取后的殘渣利用水解酶處理后，提取得到的鞣花酸含量高于直接提取[61]。

4 安石榴苷的體內代謝及在食品中的應用前景與展望

研究發(fā)現，利用大鼠研究安石榴苷在體內的代謝，研究發(fā)現大鼠腸道中的腸道微生物首先將安石榴苷分解成鞣花酸，鞣花酸再進一步分解生成分子量更小的尿石素，尿石素隨后被大鼠吸收，進而在生物體內發(fā)揮重要作用[63-65]。尹培培等[65]闡述了作為鞣花酸代謝產物的尿石素的生物活性，尿石素具有與安石榴苷、鞣花酸相似的生物活性，如抗氧化、抗炎、抗癌等。

有研究報道在我國不同地區(qū)種植的石榴，其石榴皮存在差異，表現在安石榴苷和鞣花酸的比例不同，但是兩者的含量總和卻十分接近[39]。安石榴苷的化學性質不穩(wěn)定，且分子量大，故其在食品中的應用受到了較大的限制。而來源豐富的鞣花酸性質相當穩(wěn)定。所以進一步提高鞣花酸的提取效率、純化效果、減少損失和提高得率成為重要研究方向之一。但是鞣花酸溶解性差，也是其最大的約束條件，所以為拓展其應用領域，對鞣花酸進行改性，在保持其抗氧化性的同時盡可能提高其脂溶性成為一種可行的方案。改性后的鞣花酸在食品中的應用更廣泛：首先，改性的鞣花酸“視同天然，功能互補”，可作為食用油中的抗氧化劑；其次，鞣花酸具有抗衰老、清除自由基和提高抵抗力等功能，可用于食品、化妝品和醫(yī)藥等領域產品的開發(fā)。

5 結語

石榴皮因含有豐富的多酚及其多酚功能的多樣性而備受關注。作為含量最高的安石榴苷結構復雜，化學性質不穩(wěn)定，應用難度大。鞣花酸的結構簡單穩(wěn)定，成為理想的應用產物。目前鞣花酸盡管來源豐富，但是面臨著提取和水解的效率低，溶解純化難度大等困難。目前還存在沒有對石榴皮中多酚檢測的標準，制備方法過于單一，食品應用匱乏等諸多的問題。而限制鞣花酸發(fā)展的根本原因在于其溶解性。針對此困境，可以采用對鞣花酸的酚羥基進行化學修飾以改善鞣花酸的溶解性，其中利用脂肪酶與長鏈脂肪酸進行化學修飾是一種綠色環(huán)保高效的方法。此外，可采用目前受到青睞的綠色溶劑，如低共熔溶劑作為鞣花酸溶解的新方法。