松子酒香氣組成及關鍵香氣物質間的協(xié)同作用

仲美橋，韓妍，黃一承，史玉，李丹，李曉磊

（長春大學農產品加工吉林省普通高等學校重點實驗室，吉林 長春 130022）

白酒是世界上最古老的蒸餾酒之一，具有驅寒、活血、提神等功效，能夠有效增進食欲、消除疲勞[1]。研究表明，適量飲用白酒可以起到擴張小血管、延緩膽固醇等脂質在血管壁沉積的作用，且能促進血液循環(huán)、降低心血管疾病和某些癌癥的發(fā)生概率[2-3]。因白酒內鈉、銅、鋅的含量較少，幾乎不含維生素和鈣、磷、鐵等，且風味單一，不能滿足市場需求，因此近年來以白酒為基酒的各種特色露酒逐漸得到消費者的青睞。

松子是松科植物紅松等的種子，是常見的堅果之一，含有豐富的不飽和脂肪酸[3]，研究報道顯示松子有潤肺、潤腸、止咳等功效，還能夠有效調節(jié)血脂及起到抗癌作用，具有很高的食療價值[4-7]。我國松樹品類繁多，松子資源豐富，但大都以初加工為主作為休閑食品，松子酒尚未得到深度開發(fā)。

松子酒營養(yǎng)價值高、具有良好的保健功能以及特有的香氣、質地和極佳的口感，在國際市場備受青睞，但是關于松子酒香氣物質的分析研究不足[8]。本研究采用的頂空固相微萃取-氣相色譜質譜聯(lián)用技術（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）是高效的氣味分析方法，被廣泛應用于食品風味檢測[9-10]。本研究以3種市售的松子酒為原料，通過氣相色譜-質譜聯(lián)用技術（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）檢測其揮發(fā)性物質含量，并采用聚類層次分析和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA） 的方法對數(shù)據(jù)進行了分析處理，研究了香氣活力值（odor activity value，OAV）及關鍵香氣物質間的相互作用，為松子酒風味選擇和品質控制提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

松子酒1號（南中純松子露酒）：云南某釀酒廠；松子酒2號（紅松寶露酒）：吉林某生物技術股份有限公司；松子酒3號（蘭益松松子露酒）：瀘西某釀造有限公司；己酸乙酯、丁酸乙酯、苯甲醛、2-辛醇（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

QP 2010 Ultra氣相色譜－質譜聯(lián)用儀：日本Shimadzu公司；DVB/CAR/PDMS萃取纖維（50/30 μm）、頂空萃取瓶（15 mL）：美國Supelco公司；DB-5MS UI毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）：美國 Agilent公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 HS-SPME-GC-MS分析

1.2.1.1 頂空固相微萃取條件

吸取0.5 mL樣品，加入頂空萃取瓶中，加入1.5 mL去離子水及1 g NaCl，再加入10 μL 200 mg/L的2-辛醇溶液作為內標，50℃預平衡10 min，用已活化好的DVB/CAR/PDMS萃取纖維頂空吸附30 min，將萃取頭插入GC進樣口解吸5 min。

1.2.1.2 GC-MS分析

氣相條件：DB-5MS UI毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；進樣口溫度 230℃，分流比 1∶5；載氣 He，流速1.0 mL/min；升溫程序：毛細管柱初溫40℃，保持5 min，以5℃/min升至90℃，保持1 min，再以8℃/min升至230℃，保持3 min。

質譜條件：GC-MS接口溫度250℃，離子源溫度230℃；離子化方式：電子電離源；電子能量70 eV；質量掃描范圍 30 m/z～550 m/z。

定性方法：通過對比軟件標準譜庫NIST11，保留相似度大于85%的物質。

定量方法：以2-辛醇作為內標物，通過半定量方法計算香氣物質含量，重復3次。

1.2.2 OAV值計算

通過香氣活度值（OAV）將每個香氣物質對整體的貢獻進行評估，香氣活度值（OAV）是樣品中香氣物質的質量濃度與其嗅覺閾值的比率，OAV≥1的香氣物質能夠有效影響整體風味，OAV＜1的香氣物質無實質貢獻，起修飾作用，一般來說，OAV值越大則說明該物質對總體香氣貢獻越大[11-13]。

1.2.3 閾值測定

根據(jù)Czerny等[14]的方法并做修改，通過三點選配法（three-alternative-forced-choice，3-AFC）測定察覺閾值，感官小組由10名具有一定的感官分析經驗的成員組成（5男5女，年齡20歲～25歲），嗅聞體系均為42%的乙醇水溶液。每個樣品進行十次三點選配法測試，以2為稀釋倍數(shù)，3個樣品瓶中有一個含有待測物組分，兩個為對照。檢測己酸乙酯、苯甲醛、丁酸乙酯在嗅聞體系中的閾值以及3組混合物己酸乙酯和丁酸乙酯、己酸乙酯和苯甲醛、苯甲醛和丁酸乙酯的閾值，混合比例參照松子酒樣品中香氣物質的含量比例。通過校正公式計算校正值（式中：P為校正值；p為正確識別的概率），以lg（濃度）為橫坐標，校正值P為縱坐標繪制曲線。通過公式進行擬合[15]。察覺閾值即為縱坐標P=0.5時對應的橫坐標。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過Microsoft Office Excel 2016對所得數(shù)據(jù)進行整理計算，采用IBM SPSS Statistics 20.0分析軟件對數(shù)據(jù)進行Duncan檢驗（P＜0.05），采用SIMCA進行OPLS-DA分析，通過TBtools進行聚類層次分析以及熱圖制作[16]。

2 結果與分析

2.1 HS-SPME-GC-MS分析

將提取得到的松子酒香氣物質與質譜數(shù)據(jù)庫比較，將相似度超過85%的組分保留，結果如表1。

表1 3種松子酒樣品中香氣物質分析結果Table 1 Analysis results of aroma substances in three kinds of pine wines

續(xù)表1 3種松子酒樣品中香氣物質分析結果Continue table 1 Analysis results of aroma substances in three kinds of pine wines

如表1所示，共鑒定出69種香氣物質，主要包括酯類、醇類、酸類、醛酮類、萜烯類及其他物質，這些物質共同構成了幾種松子酒的獨特風味。其中，松子酒1號鑒定出29種香氣物質，松子酒2號鑒定出35種，松子酒3號鑒定出45種香氣物質，可以發(fā)現(xiàn)不同松子酒中檢測出的香氣物質種類和數(shù)目具有差異。

在3種樣品中均檢測到酯類物質，含量分別達到11 966.76、28 079.49、14 788.33 μg/L，主要呈果香香氣，部分物質還呈甜香、花香、脂肪香堅果香等香氣，其中乙酸苯乙酯（玫瑰花香，帶有粉香的蜂蜜樣香氣）、丁酸乙酯（菠蘿香）、辛酸乙酯（白蘭地酒香）、己酸乙酯（青蘋果味）和L-乳酸乙酯（酒香）等酯類物質在松子酒中具有較高的含量，并且這些酯類在其他白酒中也具有較高的含量[17]。

醇類物質具有易揮發(fā)的物理性質，通過醇類的揮發(fā)對松子酒能夠起到助香的作用，有效提高總體的風味香氣[18～19]。3種松子酒中醇類物質分別達到2 379.81、2 426.85、15 917.35 μg/L，其中 2-苯乙醇（玫瑰香氣）、正己醇（青草香，堅果油香）及異戊醇（奶油、油脂香味）等含量較高。

酸既有香氣又是呈味物質，它們與醇類發(fā)生酯化反應生成酯類物質[20]。含酸量過大或過小都會影響酒的口感和風味，適量的酸在酒中能起到緩沖作用，協(xié)調口感，增進風味，酸還能促進酒的甜味感。其中松子酒2號含酸量達到5 082.75 μg/L，正己酸（椰肉油氣味，辛辣的味道）為其主要酸味物質，含量5 041.64 μg/L。

醛和酮是白酒中的重要呈味物質，往往帶有刺激感，能夠有效提升風味，其碳鏈越長，刺激感越弱，表現(xiàn)出青草味及脂肪味等。其中苯甲醛具有苦杏仁味，可能是松子帶來的獨特風味。

大部分萜烯類物質的察覺閾值較低，對酒類風味的形成貢獻很大。其中4-甲基愈創(chuàng)木酚（煙熏味）被認為是醬香型白酒中重要的香氣物質[21]。

2.2 層次聚類分析及偏最小二乘判別分析

對3種松子酒香氣物質的相對含量進行層次聚類分析，并結合熱圖進一步研究3種松子酒69種香氣物質的分布規(guī)律[22]，結果如圖1，相對含量的多少對應顏色的深淺，相對含量越多紅色越深，相對含量越少藍色越深[23]。

圖1 3種松子酒香氣物質聚類熱圖Fig.1 Cluster heat map of aroma substances in three kinds of pine wines

由圖1可見，3種松子酒香氣物質成分含量具有明顯差異，可將特征香氣成分分為4個系列，Ⅰ系列僅有3-糠醛和鄰苯二甲酸二丁酯；Ⅱ系列（異戊醇～2-甲基-丁基-乙酸酯）以酯類為主，其中十四酸乙酯具有鳶尾香氣，并帶有油脂氣，乙酸苯乙酯具有玫瑰花香，2號酒中棕櫚酸乙酯（脂肪香堅果香）含量較高，可能是與其中的松籽品種為東北長白山特有百年紅松之籽有關；Ⅲ系列（冰片～己酸異戊酯）以酯類為主，其中戊酸乙酯具有類似蘋果的水果香，庚酸乙酯具有菠蘿香氣味，辛酸乙酯具有白蘭地酒香味；在Ⅳ系列中（苯甲醛～α-蓽澄茄醇），α-蓽澄茄醇具有讓人愉快的香味、辛辣微苦，苯甲醛具有苦杏仁及堅果香，其含量高可能與松子為云南松所產有關。

通過OPLS-DA模型進一步分析3種松子酒的差異，結果如圖2。

圖2 3種松子酒香氣物質OPLS-DA的分數(shù)散點情況Fig.2 Score plot of OPLS-DA model of aroma substances in three kinds of pine wines

在OPLS-DA模型中R2X和R2Y代表模型對X和Y矩陣的解釋能力，Q2表示模型的預測能力[24]。模型中R2X=0.986，R2Y=0.993，Q2=0.988，其中 R2X=0.986 表明該模型能反映98.6%數(shù)據(jù)的變化，R2和Q2均大于0.9，表明該模型具有較高的可解釋度和預測能力。3種松子酒樣品在得分圖上聚類良好，組內差異性小，3種樣品之間完全分離，存在一定差異性。

2.3 OAV值分析

松子酒的整體風味取決于不同香氣物質的濃度，同時與物質的察覺閾值密不可分，不同品牌的松子酒有其獨特的風味。由于不同香氣物質的特征及閾值不同，對風味特征的貢獻也存在差異，通過OAV進一步分析香氣物質的作用，所用閾值參考《化合物香味閾值匯編（第二版）》[25]及文獻[20，26-27]，結果如表2。

表2 3種松子酒中香氣物質OAV值Table 2 Odor activity values of aroma substances detected in three kinds of pine wines

OAV≥1能被嗅覺感官所感知，OAV＜1通常起到修飾味道的作用，但由于不同物質間可能存在相互影響如協(xié)同、加成及掩蓋等作用。因此對所有OAV大于0.01的香氣物質均予以列出，如表2所示，3種松子酒中共有10種物質的OAV大于1，可能是主要香氣物質，其中苯甲醛具有堅果香，可能為松子酒提供特有的堅果風味。

將松子酒按照風味特征分成6個系列，分別是玫瑰香、蘋果香、堅果香、檸檬香、菠蘿香和白蘭地香，如表2依照各香氣物質的OAV繪制香氣輪廓圖，見圖3。

圖3 不同品種松子酒香氣輪廓圖Fig.3 Aroma profiles of different pine wines

松子酒2號味道豐富，主要以蘋果香、堅果香、菠蘿香為主調，花香起補充作用，可能與基酒釀造方式和松子的品類有關。

2.4 關鍵香氣物質間協(xié)同作用研究

松子酒中的香氣物質包括酯類、醇類、酸類、醛酮類、萜烯類物質等，這些物質可通過相互作用使松子酒的香氣復雜多變，由于不同化合物間可能存在相互影響如產生拮抗、協(xié)同、加成等作用。通過感官評定繪制S型曲線，進一步分析香氣物質的協(xié)同作用，結果如圖4。

圖4 S型曲線法研究香氣協(xié)同作用Fig.4 Synergistic effect of aroma by S-curve method

通過試驗閾值與理論閾值的比值來表征香氣物質間的相互作用，將比值計為R，R＞1時為掩蓋作用，R=1時無作用，0.5＜R＜1時為加成作用，R≤0.5時為協(xié)同作用。理論閾值由 Feller加合公式：P（A+B）=P（A）+P（B）-P（A）P（B）得到[28]。

己酸乙酯、丁酸乙酯和苯甲醛的閾值檢測結果見表 3，分別為 748.5、18 454.4、631.4 μg/L。松子酒中己酸乙酯、丁酸乙酯和苯甲醛兩兩混合后的閾值變化見圖4、表3。己酸乙酯和丁酸乙酯混合后，閾值從2 171.2 μg/L（試驗）變?yōu)?3 283.2 μg/L（理論），R=0.66，說明發(fā)生加成作用，香味加成。己酸乙酯和苯甲醛混合后，閾值從 1 664.2 μg/L 變?yōu)?904.7 μg/L，R=1.84，說明發(fā)生掩蓋作用。丁酸乙酯和苯甲醛混合后，閾值從 2 090.3 μg/L 變?yōu)?3 426.1 μg/L，R=0.61，說明發(fā)生加成作用。

表3 S型曲線法研究香氣物質間的相互作用Table 3 Interaction between aroma substances by S-curve method

3 結論

通過HS-SPME結合GC-MS從3種松子酒中分離出69種主要香氣物質，其中松子酒1號29種，松子酒2號35種，松子酒3號45種，主要包括酯類、醇類及醛酮類化合物。聚類分析及OPLS-DA結果均表明3種松子酒組內無顯著差異，組間香氣物質含量存在差異。

根據(jù)香氣物質的OAV值，從松子酒中篩選出10種關鍵香氣物質，其中苯甲醛（苦杏仁味）、己酸乙酯（蘋果味）、丁酸乙酯（菠蘿味）及戊酸乙酯（蘋果味）具有較高的OAV值，為松子酒中的特征香氣物質。在OAV值基礎上，通過S型曲線法對其中OAV值較高的3種香氣物質己酸乙酯、苯甲醛、丁酸乙酯及混合物測定閾值，利用Feller加和模型進一步分析協(xié)同作用，研究表明，丁酸乙酯與己酸乙酯、苯甲醛混合后發(fā)生加成作用，己酸乙酯與苯甲醛混合后發(fā)生掩蓋作用，為進一步控制松子酒香氣品質提供了基礎。