松子酒香氣組成及關(guān)鍵香氣物質(zhì)間的協(xié)同作用

仲美橋，韓妍，黃一承，史玉，李丹，李曉磊

（長春大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工吉林省普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130022）

白酒是世界上最古老的蒸餾酒之一，具有驅(qū)寒、活血、提神等功效，能夠有效增進(jìn)食欲、消除疲勞[1]。研究表明，適量飲用白酒可以起到擴(kuò)張小血管、延緩膽固醇等脂質(zhì)在血管壁沉積的作用，且能促進(jìn)血液循環(huán)、降低心血管疾病和某些癌癥的發(fā)生概率[2-3]。因白酒內(nèi)鈉、銅、鋅的含量較少，幾乎不含維生素和鈣、磷、鐵等，且風(fēng)味單一，不能滿足市場(chǎng)需求，因此近年來以白酒為基酒的各種特色露酒逐漸得到消費(fèi)者的青睞。

松子是松科植物紅松等的種子，是常見的堅(jiān)果之一，含有豐富的不飽和脂肪酸[3]，研究報(bào)道顯示松子有潤肺、潤腸、止咳等功效，還能夠有效調(diào)節(jié)血脂及起到抗癌作用，具有很高的食療價(jià)值[4-7]。我國松樹品類繁多，松子資源豐富，但大都以初加工為主作為休閑食品，松子酒尚未得到深度開發(fā)。

松子酒營養(yǎng)價(jià)值高、具有良好的保健功能以及特有的香氣、質(zhì)地和極佳的口感，在國際市場(chǎng)備受青睞，但是關(guān)于松子酒香氣物質(zhì)的分析研究不足[8]。本研究采用的頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）是高效的氣味分析方法，被廣泛應(yīng)用于食品風(fēng)味檢測(cè)[9-10]。本研究以3種市售的松子酒為原料，通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）檢測(cè)其揮發(fā)性物質(zhì)含量，并采用聚類層次分析和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA） 的方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析處理，研究了香氣活力值（odor activity value，OAV）及關(guān)鍵香氣物質(zhì)間的相互作用，為松子酒風(fēng)味選擇和品質(zhì)控制提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

松子酒1號(hào)（南中純松子露酒）：云南某釀酒廠；松子酒2號(hào)（紅松寶露酒）：吉林某生物技術(shù)股份有限公司；松子酒3號(hào)（蘭益松松子露酒）：瀘西某釀造有限公司；己酸乙酯、丁酸乙酯、苯甲醛、2-辛醇（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

QP 2010 Ultra氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本Shimadzu公司；DVB/CAR/PDMS萃取纖維（50/30 μm）、頂空萃取瓶（15 mL）：美國Supelco公司；DB-5MS UI毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）：美國 Agilent公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 HS-SPME-GC-MS分析

1.2.1.1 頂空固相微萃取條件

吸取0.5 mL樣品，加入頂空萃取瓶中，加入1.5 mL去離子水及1 g NaCl，再加入10 μL 200 mg/L的2-辛醇溶液作為內(nèi)標(biāo)，50℃預(yù)平衡10 min，用已活化好的DVB/CAR/PDMS萃取纖維頂空吸附30 min，將萃取頭插入GC進(jìn)樣口解吸5 min。

1.2.1.2 GC-MS分析

氣相條件：DB-5MS UI毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）；進(jìn)樣口溫度 230℃，分流比 1∶5；載氣 He，流速1.0 mL/min；升溫程序：毛細(xì)管柱初溫40℃，保持5 min，以5℃/min升至90℃，保持1 min，再以8℃/min升至230℃，保持3 min。

質(zhì)譜條件：GC-MS接口溫度250℃，離子源溫度230℃；離子化方式：電子電離源；電子能量70 eV；質(zhì)量掃描范圍 30 m/z～550 m/z。

定性方法：通過對(duì)比軟件標(biāo)準(zhǔn)譜庫NIST11，保留相似度大于85%的物質(zhì)。

定量方法：以2-辛醇作為內(nèi)標(biāo)物，通過半定量方法計(jì)算香氣物質(zhì)含量，重復(fù)3次。

1.2.2 OAV值計(jì)算

通過香氣活度值（OAV）將每個(gè)香氣物質(zhì)對(duì)整體的貢獻(xiàn)進(jìn)行評(píng)估，香氣活度值（OAV）是樣品中香氣物質(zhì)的質(zhì)量濃度與其嗅覺閾值的比率，OAV≥1的香氣物質(zhì)能夠有效影響整體風(fēng)味，OAV＜1的香氣物質(zhì)無實(shí)質(zhì)貢獻(xiàn)，起修飾作用，一般來說，OAV值越大則說明該物質(zhì)對(duì)總體香氣貢獻(xiàn)越大[11-13]。

1.2.3 閾值測(cè)定

根據(jù)Czerny等[14]的方法并做修改，通過三點(diǎn)選配法（three-alternative-forced-choice，3-AFC）測(cè)定察覺閾值，感官小組由10名具有一定的感官分析經(jīng)驗(yàn)的成員組成（5男5女，年齡20歲～25歲），嗅聞體系均為42%的乙醇水溶液。每個(gè)樣品進(jìn)行十次三點(diǎn)選配法測(cè)試，以2為稀釋倍數(shù)，3個(gè)樣品瓶中有一個(gè)含有待測(cè)物組分，兩個(gè)為對(duì)照。檢測(cè)己酸乙酯、苯甲醛、丁酸乙酯在嗅聞體系中的閾值以及3組混合物己酸乙酯和丁酸乙酯、己酸乙酯和苯甲醛、苯甲醛和丁酸乙酯的閾值，混合比例參照松子酒樣品中香氣物質(zhì)的含量比例。通過校正公式計(jì)算校正值（式中：P為校正值；p為正確識(shí)別的概率），以lg（濃度）為橫坐標(biāo)，校正值P為縱坐標(biāo)繪制曲線。通過公式進(jìn)行擬合[15]。察覺閾值即為縱坐標(biāo)P=0.5時(shí)對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過Microsoft Office Excel 2016對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行整理計(jì)算，采用IBM SPSS Statistics 20.0分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan檢驗(yàn)（P＜0.05），采用SIMCA進(jìn)行OPLS-DA分析，通過TBtools進(jìn)行聚類層次分析以及熱圖制作[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 HS-SPME-GC-MS分析

將提取得到的松子酒香氣物質(zhì)與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫比較，將相似度超過85%的組分保留，結(jié)果如表1。

表1 3種松子酒樣品中香氣物質(zhì)分析結(jié)果Table 1 Analysis results of aroma substances in three kinds of pine wines

續(xù)表1 3種松子酒樣品中香氣物質(zhì)分析結(jié)果Continue table 1 Analysis results of aroma substances in three kinds of pine wines

如表1所示，共鑒定出69種香氣物質(zhì)，主要包括酯類、醇類、酸類、醛酮類、萜烯類及其他物質(zhì)，這些物質(zhì)共同構(gòu)成了幾種松子酒的獨(dú)特風(fēng)味。其中，松子酒1號(hào)鑒定出29種香氣物質(zhì)，松子酒2號(hào)鑒定出35種，松子酒3號(hào)鑒定出45種香氣物質(zhì)，可以發(fā)現(xiàn)不同松子酒中檢測(cè)出的香氣物質(zhì)種類和數(shù)目具有差異。

在3種樣品中均檢測(cè)到酯類物質(zhì)，含量分別達(dá)到11 966.76、28 079.49、14 788.33 μg/L，主要呈果香香氣，部分物質(zhì)還呈甜香、花香、脂肪香堅(jiān)果香等香氣，其中乙酸苯乙酯（玫瑰花香，帶有粉香的蜂蜜樣香氣）、丁酸乙酯（菠蘿香）、辛酸乙酯（白蘭地酒香）、己酸乙酯（青蘋果味）和L-乳酸乙酯（酒香）等酯類物質(zhì)在松子酒中具有較高的含量，并且這些酯類在其他白酒中也具有較高的含量[17]。

醇類物質(zhì)具有易揮發(fā)的物理性質(zhì)，通過醇類的揮發(fā)對(duì)松子酒能夠起到助香的作用，有效提高總體的風(fēng)味香氣[18～19]。3種松子酒中醇類物質(zhì)分別達(dá)到2 379.81、2 426.85、15 917.35 μg/L，其中 2-苯乙醇（玫瑰香氣）、正己醇（青草香，堅(jiān)果油香）及異戊醇（奶油、油脂香味）等含量較高。

酸既有香氣又是呈味物質(zhì)，它們與醇類發(fā)生酯化反應(yīng)生成酯類物質(zhì)[20]。含酸量過大或過小都會(huì)影響酒的口感和風(fēng)味，適量的酸在酒中能起到緩沖作用，協(xié)調(diào)口感，增進(jìn)風(fēng)味，酸還能促進(jìn)酒的甜味感。其中松子酒2號(hào)含酸量達(dá)到5 082.75 μg/L，正己酸（椰肉油氣味，辛辣的味道）為其主要酸味物質(zhì)，含量5 041.64 μg/L。

醛和酮是白酒中的重要呈味物質(zhì)，往往帶有刺激感，能夠有效提升風(fēng)味，其碳鏈越長，刺激感越弱，表現(xiàn)出青草味及脂肪味等。其中苯甲醛具有苦杏仁味，可能是松子帶來的獨(dú)特風(fēng)味。

大部分萜烯類物質(zhì)的察覺閾值較低，對(duì)酒類風(fēng)味的形成貢獻(xiàn)很大。其中4-甲基愈創(chuàng)木酚（煙熏味）被認(rèn)為是醬香型白酒中重要的香氣物質(zhì)[21]。

2.2 層次聚類分析及偏最小二乘判別分析

對(duì)3種松子酒香氣物質(zhì)的相對(duì)含量進(jìn)行層次聚類分析，并結(jié)合熱圖進(jìn)一步研究3種松子酒69種香氣物質(zhì)的分布規(guī)律[22]，結(jié)果如圖1，相對(duì)含量的多少對(duì)應(yīng)顏色的深淺，相對(duì)含量越多紅色越深，相對(duì)含量越少藍(lán)色越深[23]。

圖1 3種松子酒香氣物質(zhì)聚類熱圖Fig.1 Cluster heat map of aroma substances in three kinds of pine wines

由圖1可見，3種松子酒香氣物質(zhì)成分含量具有明顯差異，可將特征香氣成分分為4個(gè)系列，Ⅰ系列僅有3-糠醛和鄰苯二甲酸二丁酯；Ⅱ系列（異戊醇～2-甲基-丁基-乙酸酯）以酯類為主，其中十四酸乙酯具有鳶尾香氣，并帶有油脂氣，乙酸苯乙酯具有玫瑰花香，2號(hào)酒中棕櫚酸乙酯（脂肪香堅(jiān)果香）含量較高，可能是與其中的松籽品種為東北長白山特有百年紅松之籽有關(guān)；Ⅲ系列（冰片～己酸異戊酯）以酯類為主，其中戊酸乙酯具有類似蘋果的水果香，庚酸乙酯具有菠蘿香氣味，辛酸乙酯具有白蘭地酒香味；在Ⅳ系列中（苯甲醛～α-蓽澄茄醇），α-蓽澄茄醇具有讓人愉快的香味、辛辣微苦，苯甲醛具有苦杏仁及堅(jiān)果香，其含量高可能與松子為云南松所產(chǎn)有關(guān)。

通過OPLS-DA模型進(jìn)一步分析3種松子酒的差異，結(jié)果如圖2。

圖2 3種松子酒香氣物質(zhì)OPLS-DA的分?jǐn)?shù)散點(diǎn)情況Fig.2 Score plot of OPLS-DA model of aroma substances in three kinds of pine wines

在OPLS-DA模型中R2X和R2Y代表模型對(duì)X和Y矩陣的解釋能力，Q2表示模型的預(yù)測(cè)能力[24]。模型中R2X=0.986，R2Y=0.993，Q2=0.988，其中 R2X=0.986 表明該模型能反映98.6%數(shù)據(jù)的變化，R2和Q2均大于0.9，表明該模型具有較高的可解釋度和預(yù)測(cè)能力。3種松子酒樣品在得分圖上聚類良好，組內(nèi)差異性小，3種樣品之間完全分離，存在一定差異性。

2.3 OAV值分析

松子酒的整體風(fēng)味取決于不同香氣物質(zhì)的濃度，同時(shí)與物質(zhì)的察覺閾值密不可分，不同品牌的松子酒有其獨(dú)特的風(fēng)味。由于不同香氣物質(zhì)的特征及閾值不同，對(duì)風(fēng)味特征的貢獻(xiàn)也存在差異，通過OAV進(jìn)一步分析香氣物質(zhì)的作用，所用閾值參考《化合物香味閾值匯編（第二版）》[25]及文獻(xiàn)[20，26-27]，結(jié)果如表2。

表2 3種松子酒中香氣物質(zhì)OAV值Table 2 Odor activity values of aroma substances detected in three kinds of pine wines

OAV≥1能被嗅覺感官所感知，OAV＜1通常起到修飾味道的作用，但由于不同物質(zhì)間可能存在相互影響如協(xié)同、加成及掩蓋等作用。因此對(duì)所有OAV大于0.01的香氣物質(zhì)均予以列出，如表2所示，3種松子酒中共有10種物質(zhì)的OAV大于1，可能是主要香氣物質(zhì)，其中苯甲醛具有堅(jiān)果香，可能為松子酒提供特有的堅(jiān)果風(fēng)味。

將松子酒按照風(fēng)味特征分成6個(gè)系列，分別是玫瑰香、蘋果香、堅(jiān)果香、檸檬香、菠蘿香和白蘭地香，如表2依照各香氣物質(zhì)的OAV繪制香氣輪廓圖，見圖3。

圖3 不同品種松子酒香氣輪廓圖Fig.3 Aroma profiles of different pine wines

松子酒2號(hào)味道豐富，主要以蘋果香、堅(jiān)果香、菠蘿香為主調(diào)，花香起補(bǔ)充作用，可能與基酒釀造方式和松子的品類有關(guān)。

2.4 關(guān)鍵香氣物質(zhì)間協(xié)同作用研究

松子酒中的香氣物質(zhì)包括酯類、醇類、酸類、醛酮類、萜烯類物質(zhì)等，這些物質(zhì)可通過相互作用使松子酒的香氣復(fù)雜多變，由于不同化合物間可能存在相互影響如產(chǎn)生拮抗、協(xié)同、加成等作用。通過感官評(píng)定繪制S型曲線，進(jìn)一步分析香氣物質(zhì)的協(xié)同作用，結(jié)果如圖4。

圖4 S型曲線法研究香氣協(xié)同作用Fig.4 Synergistic effect of aroma by S-curve method

通過試驗(yàn)閾值與理論閾值的比值來表征香氣物質(zhì)間的相互作用，將比值計(jì)為R，R＞1時(shí)為掩蓋作用，R=1時(shí)無作用，0.5＜R＜1時(shí)為加成作用，R≤0.5時(shí)為協(xié)同作用。理論閾值由 Feller加合公式：P（A+B）=P（A）+P（B）-P（A）P（B）得到[28]。

己酸乙酯、丁酸乙酯和苯甲醛的閾值檢測(cè)結(jié)果見表 3，分別為 748.5、18 454.4、631.4 μg/L。松子酒中己酸乙酯、丁酸乙酯和苯甲醛兩兩混合后的閾值變化見圖4、表3。己酸乙酯和丁酸乙酯混合后，閾值從2 171.2 μg/L（試驗(yàn)）變?yōu)?3 283.2 μg/L（理論），R=0.66，說明發(fā)生加成作用，香味加成。己酸乙酯和苯甲醛混合后，閾值從 1 664.2 μg/L 變?yōu)?904.7 μg/L，R=1.84，說明發(fā)生掩蓋作用。丁酸乙酯和苯甲醛混合后，閾值從 2 090.3 μg/L 變?yōu)?3 426.1 μg/L，R=0.61，說明發(fā)生加成作用。

表3 S型曲線法研究香氣物質(zhì)間的相互作用Table 3 Interaction between aroma substances by S-curve method

3 結(jié)論

通過HS-SPME結(jié)合GC-MS從3種松子酒中分離出69種主要香氣物質(zhì)，其中松子酒1號(hào)29種，松子酒2號(hào)35種，松子酒3號(hào)45種，主要包括酯類、醇類及醛酮類化合物。聚類分析及OPLS-DA結(jié)果均表明3種松子酒組內(nèi)無顯著差異，組間香氣物質(zhì)含量存在差異。

根據(jù)香氣物質(zhì)的OAV值，從松子酒中篩選出10種關(guān)鍵香氣物質(zhì)，其中苯甲醛（苦杏仁味）、己酸乙酯（蘋果味）、丁酸乙酯（菠蘿味）及戊酸乙酯（蘋果味）具有較高的OAV值，為松子酒中的特征香氣物質(zhì)。在OAV值基礎(chǔ)上，通過S型曲線法對(duì)其中OAV值較高的3種香氣物質(zhì)己酸乙酯、苯甲醛、丁酸乙酯及混合物測(cè)定閾值，利用Feller加和模型進(jìn)一步分析協(xié)同作用，研究表明，丁酸乙酯與己酸乙酯、苯甲醛混合后發(fā)生加成作用，己酸乙酯與苯甲醛混合后發(fā)生掩蓋作用，為進(jìn)一步控制松子酒香氣品質(zhì)提供了基礎(chǔ)。