響應(yīng)面法優(yōu)化雙層包埋格氏乳桿菌微膠囊制備工藝

李喬，都鳳華，沙丙含

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130118）

格氏乳桿菌（Lactobacillus gasseri）又稱加氏乳桿菌，是一種革蘭氏陽性菌[1]，具有多種功能性的益生菌，是存在于人體內(nèi)的天然菌叢[2]。格氏乳桿菌適宜生長環(huán)境溫度為30℃～37℃。最適生長pH值為6～7，在pH值為2時依舊可以存活，存活率在2%左右[3]。格氏乳桿菌具有可維持人體腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)等多種益生功能[4]，如可通過調(diào)節(jié)腸道內(nèi)厚壁菌門和擬桿菌門的比例防止體重的過度增加[5-7]。格氏乳桿菌的代謝產(chǎn)物可抑制腸道對膽汁酸的重吸收以及增強(qiáng)人體對酸性類固醇排泄能力，從而具有降低膽固醇的作用[8-10]；菌體代謝產(chǎn)物可以通過與脂多糖的結(jié)合，阻止脂多糖對細(xì)胞受體的作用，干擾細(xì)胞外激酶調(diào)節(jié)信號、撕裂蛋白激酶信號通路達(dá)到消炎、抗菌的效果[11-13]。格氏乳桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物對自由基具有較強(qiáng)的清除能力，是一種良好的天然抗氧化劑[14-16]。格氏乳桿菌可產(chǎn)生抗菌肽，經(jīng)試驗研究，這些細(xì)菌素對引起食品腐敗的細(xì)菌具有廣譜抗菌活性，因此格氏乳桿菌可代替抗生素、作為生物防腐劑[17]。

微膠囊化可改善芯材的形態(tài)、味道和色澤等物理性質(zhì)；控制被包埋物質(zhì)的溶解釋放的時間和速度[18]。微膠囊技術(shù)被廣泛的應(yīng)用于食品行業(yè)，如用于改善食品添加劑（調(diào)味劑、食用色素、膨松劑）的顏色氣味；提高營養(yǎng)強(qiáng)化劑與生物活性物質(zhì)（維生素、多肽）的穩(wěn)定性。國內(nèi)外相關(guān)研究人員通過改變包埋材料、微膠囊化方法等，不斷優(yōu)化乳桿菌包埋的制備工藝，保護(hù)乳桿菌不受外界不良環(huán)境影響，使其能抵御胃液的腐蝕并在腸道中定殖[19-21]，從而增強(qiáng)其對人體的益生作用。本研究采用內(nèi)源乳化法，以格氏乳桿菌作為芯材，海藻酸鈉、殼聚糖為壁材，制備雙層包埋格氏乳桿菌微膠囊，為擴(kuò)大格氏乳桿菌使用范圍提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

格氏乳桿菌：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；殼聚糖、海藻酸鈉、冰乙酸、碳酸鈣、乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力攪拌器（SN-MS-6D1）：尚普儀器設(shè)備有限公司；搖床（TB-200B）：天呈試驗儀器制造有限公司；蒸汽滅菌器（LDZX-30KBS）：申安醫(yī)療器械廠；冷凍機(jī)（Sigma 2-16k）：博勱儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 雙層包埋格氏乳桿菌微膠囊制備工藝流程

將10 mL濃縮菌泥與質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.0%的海藻酸鈉溶液按照體積比1∶4菌膠比混合后，加入2%碳酸鈣并攪拌均勻。然后按照體積比1∶6的水油比加大豆油（含Span80），攪拌形成乳狀液，15 min后加入20 mL含有冰乙酸的大豆油，攪拌30 min后，加入洗滌介質(zhì)，離心收集后置于10 mL殼聚糖溶液中，置于磁力攪拌器上（400 r/min）攪拌20 min，靜置后過濾收集微膠囊[22]。

1.3.2 單因素試驗

選擇殼聚糖溶液濃度（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、pH 值（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）、成膜時間（5、10、15、20、25 min）3個因素進(jìn)行單因素試驗，分析各因素對雙層包埋格氏乳桿菌微膠囊包埋率的影響。

1.3.3 雙層包埋格氏乳桿菌微膠囊制備工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗

對成膜時間、殼聚糖溶液濃度、pH值3個因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗優(yōu)化設(shè)計，因素水平如表1所示。以包埋率作為響應(yīng)值，確定雙層包埋微膠囊的最佳制備工藝組合。

表1 響應(yīng)面因素水平編碼Table 1 Factors and levels of response surface

1.3.4 格氏乳桿菌微膠囊包埋率的測定

稱取1.0 g微膠囊，置于10 mL磷酸鹽緩沖液中，用高速剪切機(jī)進(jìn)行破碎處理（19 000 r/min，2 min），37℃恒溫振蕩，使微膠囊溶解并釋放菌體，經(jīng)梯度稀釋后，吸取適宜稀釋度的菌懸液涂布于固體培養(yǎng)基上，37℃下厭氧培養(yǎng)48 h后進(jìn)行活菌計數(shù)[7]。微膠囊的包埋率計算公式如下。

式中：A為解囊液菌落數(shù)，cfu/mL；B為制備微膠囊的原菌液菌落數(shù)，cfu/mL。

1.3.5 格氏乳桿菌微膠囊在模擬胃腸液中存活試驗

取1.0 g制得的微膠囊置于50 mL人工模擬胃液中，于37℃、100 r/min恒溫?fù)u床中振蕩，分別于0、30、60、90、120 min時離心收集微膠囊，用生理鹽水洗滌后，置于適量磷酸鹽緩沖液中溶解，進(jìn)行活菌計數(shù)。同時以1.0 g未包埋格氏乳桿菌作為對照組。

稱取1.0 g制得的微膠囊置于50 mL人工模擬腸液中，于37℃、100 r/min恒溫?fù)u床中振蕩，分別對振蕩0、30、60、90、120 min 時的微膠囊進(jìn)行活菌計數(shù)。

1.3.6 格氏乳桿菌微膠囊貯藏穩(wěn)定性試驗

將制得的微膠囊放置于-18℃與常溫（25℃）條件中，儲藏4周。每隔1周對儲存的微膠囊取樣并進(jìn)行活菌計數(shù)。同時以1 g未包埋格氏乳桿菌作為對照組。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗重復(fù)3次，結(jié)果采用測定平均值。利用Design-Expert 10.0.1軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面試驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 殼聚糖濃度對微膠囊包埋率的影響

殼聚糖濃度對微膠囊的包埋率的影響如圖1所示。

圖1 殼聚糖濃度對微膠囊包埋率的影響Fig.1 Effect of chitosan concentration on the encapsulation rate of microcapsules

由圖1可知，微膠囊的包埋率隨著殼聚糖濃度的增大而升高，當(dāng)殼聚糖濃度為0.6%時，微膠囊的包埋率最高，然而當(dāng)殼聚糖濃度繼續(xù)增加時包埋率呈下降趨勢。這可能是由于在一定范圍內(nèi)，殼聚糖濃度越高，殼聚糖與海藻酸鈉形成的聚電解質(zhì)復(fù)合膜越致密，減少了格氏乳桿菌菌體的外泄，從而有效地提高了微膠囊的包埋率。當(dāng)殼聚糖濃度繼續(xù)增高時，溶液的黏度增加、流動性降低，從而影響了殼聚糖與海藻酸鈉的交聯(lián)反應(yīng)。因此最佳殼聚糖濃度為0.6%。

2.1.2 殼聚糖溶液pH值對微膠囊包埋率的影響

殼聚糖溶液pH值對微膠囊包埋率的影響如圖2所示。

圖2 殼聚糖溶液的pH值對微膠囊包埋率的影響Fig.2 Effect of pH of chitosan solution on the encapsulation rate of microcapsules

由圖2可知，微膠囊的包埋率隨著殼聚糖溶液pH值的增大而升高，當(dāng)pH值為5.0時，微膠囊的包埋率最高，然而當(dāng)pH值繼續(xù)增加時包埋率呈下降趨勢。這可能是由于殼聚糖溶液pH值較高時，殼聚糖分子鏈上的銨根離子以NH2+為主，與-COO-反應(yīng)的-NH3+數(shù)量較少，靜電吸引力減弱，形成的膜機(jī)械強(qiáng)度較低，從而降低了微膠囊的包埋率。因此殼聚糖溶液最佳pH值為5.0。

2.1.3 成膜時間對微膠囊包埋效果的影響

成膜時間對微膠囊包埋效果的影響如圖3所示。

圖3 成膜時間對微膠囊包埋率的影響Fig.3 Effect of film formation time on the encapsulation rate of microcapsules

由圖3可知，微膠囊的包埋率隨著成膜時間的延長而升高，當(dāng)成膜時間為15 min時，微膠囊的包埋率最高，然而當(dāng)成膜時間繼續(xù)延長時包埋率呈下降趨勢。這可能是由于成膜時間較長影響了殼聚糖與海藻酸鈉間的靜電吸引力，導(dǎo)致殼聚糖與海藻酸鈉形成的聚電解質(zhì)復(fù)合膜的機(jī)械強(qiáng)度降低，從而降低了微膠囊的包埋率。因此最佳成膜時間為15 min。

2.2 雙層包埋格氏乳桿菌微膠囊制備工藝響應(yīng)面試驗優(yōu)化結(jié)果

為進(jìn)一步研究變量之間交互作用的影響關(guān)系，使用響應(yīng)面分析法篩選包埋率最佳制備工藝。基于Box-Benhnken采樣原理，對A成膜時間、B殼聚糖濃度、C pH值3個因素進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗，從而確定雙層包埋格氏乳桿菌微膠囊制備工藝的最佳組合。響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果如表2所示，方差分析如表3所示。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Results of response surface experiments

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

利用Design-Expert 10.0.1軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，對表2試驗數(shù)據(jù)建立二次回歸模型，擬合得到二次多元回歸方程：Y=76.03+0.471 3A-0.4512B+2.76C-1.92AB-1.78AC+1.54BC-5.27A2-6.79B2-4.4C2。

F值可用來檢驗各變量對響應(yīng)值影響的顯著性的高低。F值越大，則響應(yīng)變量的顯著性程度越高。當(dāng)模型顯著性檢驗p＜0.05，說明該模型具有統(tǒng)計學(xué)意義。從表3中可以看出，3種工藝條件對包埋率影響大小順序：C>A>B，即pH值＞成膜時間＞殼聚糖濃度。模型的決定系數(shù)R2為0.986 8，而R2adj=0.969 7，能夠解釋試驗96.97%的響應(yīng)值變異，且與預(yù)測相關(guān)系數(shù)Pred R2（0.821 8）接近，說明此試驗?zāi)Ｐ团c真實數(shù)據(jù)擬合程度良好，具有實踐指導(dǎo)意義，由此可以用該模型來分析和預(yù)測包埋率最優(yōu)工藝。

由響應(yīng)面試驗優(yōu)化得到格氏乳桿菌微膠囊包埋最佳工藝：成膜時間為15 min、殼聚糖濃度為0.6%、pH值為5.2，進(jìn)行3次重復(fù)試驗，得平均包埋率為76.52%，接近模型預(yù)測結(jié)果，表明此響應(yīng)面模型分析優(yōu)化包埋工藝的方法有效可行。

2.3 格氏乳桿菌微膠囊在模擬胃腸液中存活試驗

格氏乳桿菌微膠囊在人工模擬胃液中菌體的存活率如圖4所示。

圖4 格氏乳桿菌微膠囊在人工模擬胃液中菌體的存活率Fig.4 Survival of microencapsulated Lactobacillus gasseri in simulated gastric fluid

如圖4可知，在胃液作用下菌體存活率不斷下降。經(jīng)人工模擬胃液處理2 h后，雙層包埋微膠囊的存活率為84.1%，大于未包埋菌體的存活率。結(jié)果表明在人工模擬胃液中，經(jīng)雙層包埋的格氏乳桿菌存活率大于未經(jīng)微膠囊化的格氏乳桿菌。

格氏乳桿菌微膠囊在人工模擬腸液中菌體的存活率如圖5所示。

圖5 格氏乳桿菌微膠囊在人工模擬腸液中菌體的存活率Fig.5 Survival of microencapsulated Lactobacillus gasseri in simulated intestinal fluid

由圖5可知，經(jīng)人工模擬腸液反應(yīng)1.5 h后，雙層包埋格氏乳桿菌的活菌數(shù)不再發(fā)生變化。結(jié)果表明格氏乳桿菌微膠囊腸溶性較好，有利于格氏乳桿菌在人體腸道中定殖。

2.4 格氏乳桿菌微膠囊貯藏穩(wěn)定性試驗

格氏乳桿菌微膠囊在不同條件環(huán)境下的貯藏穩(wěn)定性如圖6、圖7所示。

圖6 格氏乳桿菌微膠囊在-18℃條件下的貯藏穩(wěn)定性Fig.6 Storage life of microencapsulated Lactobacillus gasseri at-18℃

圖7 格氏乳桿菌微膠囊在常溫條件下的貯藏穩(wěn)定性Fig.7 Storage life of microencapsulated Lactobacillus gasseri at room temperature

由圖6、圖7可知，在室溫（25℃）和-18℃條件環(huán)境下，微膠囊中的活菌數(shù)隨著時間的延長不斷下降，貯藏28 d后試驗組樣品中的活菌數(shù)分別為8.31、7.14 lg（CFU/g）。經(jīng)雙層包埋后微膠囊的活菌數(shù)遠(yuǎn)高于未包埋的活菌數(shù)，說明在不同環(huán)境下微膠囊化對菌體都具有較強(qiáng)的保護(hù)作用。

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面試驗對雙層包埋格氏乳桿菌微膠囊的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，最佳制備工藝參數(shù)為成膜時間為15 min、殼聚糖濃度為0.6%、pH值為5.2。制得雙層包埋格氏乳桿菌微膠囊的包埋率為76.52%。經(jīng)各試驗表明工藝優(yōu)化后制得的微膠囊耐酸性明顯增大，在人工腸液中1.0 h～1.5 h內(nèi)可完全釋放，貯藏穩(wěn)定性明顯提高。本試驗說明雙層包埋格氏乳桿菌微膠囊具有一定的耐酸性、貯藏性，能夠提高格氏乳桿菌在人體內(nèi)的益生作用，擴(kuò)大了格氏乳桿菌的使用范圍，可為格氏乳桿菌作為營養(yǎng)強(qiáng)化劑、生物防腐劑等應(yīng)用于生產(chǎn)實踐提供更多的基礎(chǔ)與技術(shù)支撐。