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    銀耳多糖-殼寡糖納米復合體系構(gòu)建及其對BSA釋放特性的影響

    2022-07-26 09:56:12王歡趙永亮安星亮姚啟悅李飛寰任軍華趙春杰
    食品研究與開發(fā) 2022年14期
    關鍵詞:分散性寡糖銀耳

    王歡,趙永亮,安星亮,姚啟悅,李飛寰,任軍華,趙春杰

    (河南工業(yè)大學生物工程學院,河南 鄭州 450001)

    近年來,功能性蛋白質(zhì)或多肽類食品因其安全、無毒且在疾病預防與健康改善方面的功效突出而受到學者的廣泛關注。然而,由于蛋白質(zhì)與多肽類產(chǎn)品在胃部耐受性差,遇酸易變性,小腸吸收率低,導致其功能性嚴重損耗[1]。研究者為提高蛋白質(zhì)及多肽類的生物利用度,構(gòu)建了諸多遞送體系。聚電解質(zhì)納米載藥體系主要是指帶相反電荷的聚離子電解質(zhì)通過靜電作用力形成納米尺寸(10 nm~1 000 nm)的復合物,具有對活性物質(zhì)緩釋以及pH值響應釋放的優(yōu)良特性,對蛋白質(zhì)進行負載,可以實現(xiàn)提高其穩(wěn)定性與利用率[2],現(xiàn)已成為近年來國內(nèi)外學者研究熱點。

    多糖納米載體體系除具有安全無毒、價格低廉等優(yōu)點外,還具有靶向特異性酶降解以及酸堿環(huán)境觸發(fā)性解離的性質(zhì),使其在蛋白質(zhì)遞送系統(tǒng)領域有較高的應用價值[3-4]。殼寡糖(chitooligosaccharides,COS)是自然界少有的天然堿性寡糖,除具有分子量低、空間位阻小的結(jié)構(gòu)特點外,還具有低溶血活性、低細胞毒性與易被人體吸收利用等特性[5-6]。銀耳多糖(Tremella fuciformis polysaccharides,TFP)由葡萄糖醛酸、木糖以及少量葡萄糖組成,是一種具有良好的抗炎、抗腫瘤、成膜性等多種生物活性的天然多糖,并且進入體內(nèi)很少引起副反應[7-11]。除此之外,葡萄糖醛酸的存在使銀耳多糖在水溶液中具有負電荷,使其容易與帶正電荷的聚電解質(zhì)通過靜電自組裝形成復合物。近年來,對于殼寡糖和銀耳多糖,分別出現(xiàn)了許多以其復合物負載功能性食品的研究:Chebl等[12]研究發(fā)現(xiàn),殼寡糖與乳酸可通過自組裝作用形成包含5個特殊疏水微區(qū)的納米聚集體,并利用疏水微區(qū)對姜黃素實現(xiàn)了負載;Wang等[13]制備了納米結(jié)構(gòu)的銀耳多糖-殼聚糖復合物,并證實其具有良好的控釋性能;蔣艷榮等[14]研究發(fā)現(xiàn)殼寡糖與黃芩苷的復合物可用于保護穩(wěn)定性較低的活性物質(zhì);Tian等[15]證明玉米醇溶蛋白和銀耳多糖可作為胃腸道輸送藥物的硬膠囊材料。目前,尚無學者對銀耳多糖-殼寡糖(Tremella fuciformis polysaccharide and chitosan oligosaccharide,TFP-COS) 納米復合體系的構(gòu)建以及控釋特性進行研究。

    因此,本研究將殼寡糖與銀耳多糖通過聚電解質(zhì)絡合法復合,并對復合物穩(wěn)定性進行研究;以牛血清蛋白為模型蛋白質(zhì),探究COS-TFP納米復合物對牛血清蛋白(bovine serum protein,BSA)的包埋率以及在不同pH值緩沖溶液(pH值分別為2.0、4.0與7.0)釋放情況的載藥與釋藥特性,以期提高功能性蛋白質(zhì)的生物利用度,為相關功能性產(chǎn)品的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    銀耳多糖(多糖含量不低于74%):河北韓美生物科技有限公司;殼寡糖(脫乙酰度90.14%):上海麥克林生化科技有限公司;牛血清蛋白(純度不低于96%):白鯊生物科技有限公司;氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉(均為分析純):天津市科密歐化學試劑有限公司。

    1.2 儀器與設備

    臺式pH計(FiveEasy):上海梅特勒-托利多儀器有限公司;電子天平(ALC-2103):北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;多功能酶標儀(Tecan Infinite M1000 PRO):上海新領生物科技發(fā)展有限公司;納米粒度儀(Nano S90)、電位分析儀(Zetasizer NanoZ):英國馬爾文儀器有限公司;臺式恒溫振蕩搖床(THZ-312):上海精宏實驗設備有限公司;臺式高速離心機(TGL-16C):上海菲恰爾分析儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 COS-TFP復合物的合成

    參考Ye等[16]的制備方法并稍作改進:首先,準確稱取一定質(zhì)量的TFP、COS樣品,分別溶于去離子水中,得到濃度分別為10 mg/mL的TFP和COS溶液,備用。其次,制備COS-TFP復合物,具體制備過程如下:控制 COS 與 TFP 總濃度(1、2、3、4、5、6、7 mg/mL,固定COS 與 TFP 濃度比為 1∶3,NaCl濃度為 20 mmol/L,pH值為4.0)為一定值,按照一定COS與TFP濃度比(2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6,固定 COS 與 TFP 總濃度為 2 mg/mL,NaCl濃度為 20 mmol/L,pH 值為 4.0)加入TFP貯藏溶液,按照對應比例緩慢滴加COS貯藏溶液,混勻后加入一定濃度 NaCl溶液(0、2.5、5、10、20、30、50 mmol/L,固定 COS 與 TFP 濃度比為 1∶3,COS 與TFP總濃度為2 mg/mL,pH值為 4.0),調(diào)節(jié) pH值(3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0,固定 COS 與 TFP 濃度比為 1∶3,COS 與 TFP 總濃度為 2 mg/mL,NaCl濃度為30 mmol/L),在轉(zhuǎn)速為 300 r/min、25 ℃的條件下,攪拌30 min,2 500 r/min離心10 min,取上層清液,即得到COS-TFP分散溶液,以研究COS與TFP濃度比、COS與TFP總濃度、NaCl濃度、pH值對COS-TFP復合物穩(wěn)定性的影響。

    1.3.2 電位、粒徑、分散性指數(shù)的測定

    將復合物溶液進行稀釋并分散均勻后,取1 mL放入樣品池,采用納米粒度分析儀與Zeta電位分析儀分別測定COS-TFP復合物的電位、粒徑、分散性指數(shù)[17]。

    1.3.3 COS-TFP-BSA復合物的合成

    稱取一定量BSA溶解于去離子水中,以200 r/min的速度于25℃條件下攪拌30min,得到濃度為25mg/mL的 BSA 溶液,按照一定濃度比(1∶0.1、1∶0.2、1∶0.4、1∶0.6、1∶0.8、1∶1、1∶2、1∶4)將 BSA 與 1.3.1 中制備的 COS-TFP分散溶液混合得到COS-TFP-BSA復合物。

    1.3.4 BSA包埋率以及釋放率的測定

    1.3.4.1 BSA標準曲線的測定

    配制不同濃度的BSA標準溶液,采用Bradford法[18]測上清液BSA的濃度,繪制吸光度-牛血清蛋白質(zhì)量濃度標準曲線,得到線性回歸方程(1)。

    式中:A為上清液吸光度;C為牛血清蛋白質(zhì)量濃度,mg/L;R為相關系數(shù)。

    1.3.4.2 包埋率的測定

    將COS-TFP-BSA溶液高速離心獲得上清液,并以高速離心后的COS-TFP復合物溶液作為空白對照組,采用1.3.4.1所示方法測上清液BSA溶液的質(zhì)量濃度;按照公式(2)計算BSA的包埋率[18]。

    式中:N為COS-TFP復合物負載BSA的質(zhì)量,μg;M為溶液中總BSA的質(zhì)量,μg。

    1.3.4.3 不同pH值緩沖溶液釋放曲線測定

    取COS-TFP-BSA樣品溶液100 mL,離心后向沉淀中加入100 mL不同pH值緩沖溶液(模擬胃液pH4.0磷酸鹽緩沖溶液,模擬腸液pH7.0磷酸鹽緩沖溶液),混合均勻后分裝于離心管中,在37℃、100 r/min條件下恒溫振蕩6 h,每間隔0.5 h取樣,按照1.3.4.1所示方法測定蛋白含量,并用公式(3)計算累計釋放率[19]。

    式中:Ct為t時刻溶液中游離BSA的濃度,μg/mL;Vt為t時刻溶液體積,mL;C0為0時刻溶液中游離BSA 的濃度,μg/mL;V0為 0 時刻溶液體積,mL;M 為在COS-TFP復合物負載BSA全部溶解時的pH值條件下BSA最大釋放量,μg。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    采用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,Origin 2021與Excel 2016進行繪圖,以上所有試驗均重復3次,結(jié)果取平均值,并以平均值±標準差表示。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 COS與TFP溶液的電位隨pH值變化趨勢

    圖1為在不同pH值條件下COS與TFP溶液電位變化趨勢。

    圖1 不同pH值條件下COS溶液與TFP溶液電位變化曲線Fig.1 The electric of chitooligosaccharide and Tremella fuciformis polysaccharide solution at different pH

    由圖1可知,在pH值小于6.0的溶液中,COS分子的-NH2被質(zhì)子化形成-NH3而帶有正電荷,pH值范圍為2.5~3.5時,COS溶液電位隨pH值升高而逐漸增加,從6.64 mV升高至19.83 mV,推測是殼寡糖在此pH值范圍溶液中呈現(xiàn)球形,表面暴露的氨基數(shù)目少;當pH值繼續(xù)增大至4.5時,溶液中質(zhì)子的逐漸減少導致殼寡糖電位逐漸降低至接近0 mV。隨著溶液pH值的升高,TFP分子所帶負電荷先緩慢增加后迅速增加,電位絕對值呈現(xiàn)上升趨勢,分析其原因,可能是由于TFP的羧基基團酸度系數(shù)pKa≈3.5,當pH值小于3.5時,羧基基團電離程度低,TFP溶液電位較低[20]。

    2.2 不同TFP與COS總濃度對COS-TFP復合物的影響

    不同TFP與COS總濃度對復合物粒徑、分散性指數(shù)、電位的影響見圖2。

    圖2 不同TFP與COS總濃度對復合物粒徑、分散性指數(shù)、電位的影響Fig.2 The effect of biopolymer concentrations of TFP and COS in the particle size,PDI,zeta-potential of the COS-TFP nanocomposites

    由圖2可知,隨著TFP與COS總濃度從1 mg/mL升高到7 mg/mL,形成的復合物粒徑逐漸增大,且濃度為1 mg/mL與2 mg/mL時不存在顯著性差異(p>0.05);這可能是由于隨著濃度增高,單位體積溶液中存在的復合物越多,分子間靜電結(jié)合作用更易發(fā)生,從而形成粒徑較大的聚集體[21]。隨總濃度增大,分散性指數(shù)變化程度小,且在2 mg/mL時達到最低值0.21;電位絕對值隨總濃度升高而降低,當總濃度小于2 mg/mL時,電位絕對值高于15 mV(體系處于穩(wěn)定狀態(tài)[22]);綜上,復合物形成的最適合TFP與COS總濃度為2 mg/mL。Coelho等[23]也發(fā)現(xiàn),只有當溶液中多糖濃度較低時,才會形成尺寸較小且穩(wěn)定的復合物。

    2.3 不同COS與TFP濃度比對COS-TFP復合物的影響

    不同COS與TFP濃度比對COS-TFP復合物電位、粒徑、分散性指數(shù)如圖3所示。

    圖3 不同COS與TFP濃度比對復合物粒徑、分散性指數(shù)、電位的影響Fig.3 The effect of concentration ratios of COS and TFP in the particle size,PDI,zeta-potential of the COS-TFP nanocomposites

    隨著COS與TFP濃度比增加,復合物的粒徑呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢,其中COS與TFP濃度比范圍為1∶5~1∶3粒徑尺寸低于400 nm且無顯著性差異(p>0.05);COS 與 TFP 濃度比范圍為 1∶5~1∶2 時,分散性指數(shù)均低于0.3且無顯著性差異(p>0.05);電位絕對值隨COS與TFP濃度比增加而呈現(xiàn)出降低趨勢,當 COS 與 TFP 濃度比范圍為 1∶6~1∶3 時,電位絕對值超過15 mV。

    COS/TFP濃度比增加時,復合物的電位絕對值降低,這歸因于TFP所帶負電荷逐漸被越來越多的COS正電荷中和,導致復合物所帶電荷逐漸減少[24]。而COS與TFP濃度比高于1∶3時,可與COS結(jié)合的TFP負電荷處于稀少狀態(tài),導致粒子間靜電斥力降低,出現(xiàn)聚集狀態(tài)[25],粒徑從311 nm迅速增加到1 076 nm。體系均一分布狀態(tài)也被破壞,多分散指數(shù)大。杜志陽[26]研究殼寡糖靜電結(jié)合三聚磷酸鈉時也發(fā)現(xiàn)相同結(jié)論。綜上所述,COS 與 TFP 濃度比為 1∶5~1∶3 時,體系分布更均一,粒徑更小,更加穩(wěn)定。

    2.4 不同NaCl濃度對COS-TFP復合物的影響

    不同NaCl濃度對復合物粒徑、分散性指數(shù)、電位的影響見圖4。

    圖4 不同NaCl濃度對復合物粒徑、分散性指數(shù)、電位的影響Fig.4 The effects of NaCl concentrations in the particle size,PDI,zeta-potential of the COS-TFP nanocomposites

    從圖4中可以看出,粒徑隨NaCl濃度增加出現(xiàn)先增大后降低的趨勢,其中,當20 mmol/L<NaCl濃度≤50 mmol/L時,粒徑處于300 nm附近,并且無顯著差異(p>0.05)。隨著 NaCl濃度增加,電位絕對值增加,且當20 mmol/L≤NaCl濃度≤50 mmol/L時,電位絕對值超過15 mV。隨著NaCl濃度增大,分散性指數(shù)逐漸增大,在NaCl濃度為50 mmol/L時增大較多,分散性指數(shù)超過0.3,體系均一性較差。分析其原因,NaCl濃度<5 mmol/L時,TFP分子的-COO-基團被屏蔽,分子鏈趨于柔軟,更易于與COS形成聚集,粒徑增大[20]。5 mmol/L≤NaCl濃度≤10 mmol/L時,TFP分子可能進一步彎曲,同時顆粒間靜電斥力增大,不易聚集,粒徑降低[27];之后,NaCl濃度>10 mmol/L 時,NaCl在溶液中解離出的正負離子會靜電結(jié)合到TFP與COS上的相反電荷上,引起靜電作用的競爭效應,少了TFP與COS結(jié)合位點,導致COS-TFP復合物形成能力隨離子濃度增加而降低,表現(xiàn)為分散性指數(shù)增大[28]。

    綜上,NaCl濃度為20 mmol/L~50 mmol/L,電位絕對值處于復合物穩(wěn)定范圍,分散性指數(shù)小于0.3,粒徑分布無顯著差異。該結(jié)果與張立彥等[29]研究NaCl對殼寡糖/果膠靜電自組裝作用影響的結(jié)論相似。

    2.5 不同pH值對COS-TFP復合物的影響

    不同pH值對復合物粒徑、分散性指數(shù)、電位的影響如圖5所示。

    圖5 不同pH值對復合物粒徑、分散性指數(shù)、電位的影響Fig.5 The effect of pH in the particle size,PDI,zeta-potential of the COS-TFP nanocomposites

    隨著pH值升高,粒徑先升高后降低,且pH值范圍為3.0~4.0時不存在顯著性差異(p>0.05);隨著pH值升高由3.0至4.0時,分散性指數(shù)由0.317降低達到0.221;復合物電位的絕對值隨pH值增大而增加。pH值為3.0時,分散性指數(shù)高于0.3,可能是由于此時COS與TFP所帶電荷數(shù)目低,復合物形成程度低,體系存在不同尺寸物質(zhì)。隨著pH值升高,帶有相反電荷的TFP與COS通過靜電相互作用形成一定尺寸的聚電解質(zhì)復合物,表現(xiàn)為粒徑增加[20],分散性指數(shù)降低,體系趨于均一化。隨著pH值繼續(xù)升高至5.0,體系中電位絕對值突然增大,復合物之間排斥力增大,復合物進一步卷曲,致使粒徑呈現(xiàn)降低趨勢[30]。綜合考慮分散性指數(shù)、電位、粒徑,選擇pH值為4.0時作為制備穩(wěn)定復合物的pH值。

    2.6 負載BSA的COS-TFP復合物包埋率

    表1是負載不同BSA含量的COS-TFP復合物的包埋率情況。

    表1 不同COS-TFP與BSA濃度比下銀耳多糖-殼寡糖復合物對牛血清蛋白的包埋率Table 1 The effect of COS/TFP∶BSA of the encapsulation efficiency of BSA

    隨著BSA濃度的增加,BSA包埋率逐漸降低。其中當 COS-TFP 與 BSA 濃度比為 1∶0.1、1∶0.2、1∶0.4、1∶0.6時,COS-TFP復合物對BSA的包埋率均達到90%以上,且無顯著性,該結(jié)果與之前研究結(jié)果相同[31];當BSA濃度繼續(xù)增加,可能由于過量添加BSA超出COS-TFP包埋能力,包埋率繼續(xù)降低。綜上所述,選擇1∶0.6的濃度比更具有經(jīng)濟效益。

    2.7 負載BSA的COS-TFP復合物在不同pH值緩沖溶液中的釋放

    圖6顯示了負載BSA復合物在不同pH值緩沖液條件下的累計釋放率變化情況。

    圖6 不同pH值緩沖溶液中BSA的釋放情況Fig.6 Release of BSA in buffer solutions with different pH values

    pH值為4.0(體外模擬飽食胃部pH值)時,累計釋放率隨時間變化而圍繞10%釋放率呈現(xiàn)平穩(wěn)波動狀態(tài),說明此條件下,BSA幾乎不被釋放。分析其原因,COS分子在pH值低于6.2時氨基質(zhì)子化形成-NH3+,可與TFP分子上的-COO-通過靜電相互作用形成復合物,而BSA在等電點(PI=4.7)以下溶液中帶負電荷,也可與TFP形成復合物。因此,飽食(胃部pH值為3.0~4.0后服用可保護蛋白質(zhì)不被胃酸破壞[32]。pH值為2.0(體外模擬空腹胃部pH值)時,BSA釋放情況可以分為兩個階段:第一階段為釋放時間≤240 min,BSA釋放率從0%上升至89.87%,釋放時間>240 min,BSA幾乎全部釋放。分析其原因,在pH值為2.0時,BSA與COS帶正電荷,且TFP所帶負電荷較少,導致三者靜電作用減弱,BSA游離。pH值為7.0(體外模擬小腸pH值)時,隨時間變化載BSA釋放情況分為3個階段:釋放時間≤60 min時,為快速釋放階段,釋放率由0變?yōu)?8.74%。60 min<釋放時間≤210 min時,為慢速釋放階段,釋放率由58.74%變?yōu)?4.97%。釋放時間>210min時,剩余BSA極緩慢釋放至完全。殼寡糖幾乎不帶電,且BSA帶負電荷,此時復合物解離,BSA游離[25]。

    3 結(jié)論

    本文討論了COS與TFP濃度及質(zhì)量比、鹽離子濃度、溶液pH值對COS-TFP聚電解質(zhì)復合體系分散性指數(shù)、粒徑、電位的影響。結(jié)果表明,TFP與COS相互作用形成穩(wěn)定復合物的條件:TFP與COS總濃度為 2 mg/mL、TFP 與 COS 濃度比為 1∶5~1∶3、NaCl濃度為20 mmol/L~50 mmol/L、pH值為4.0。利用此條件下形成的復合物對BSA進行負載,當COS-TFP復合物與BSA濃度比為時1∶0.6,BSA包埋率達到91%,pH值為4.0時,BSA幾乎不被釋放,pH值為7.0時,BSA釋放速率較快,60 min累計釋放率達到58.75%,在一定程度上提高蛋白質(zhì)及多肽類的生物利用率。因此,COS-TFP實現(xiàn)對蛋白以及多肽類的控釋,可作為潛在的蛋白質(zhì)類控釋運載體系,同時也為銀耳多糖的綜合應用開辟了新途徑。

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