超微粉碎對山楂黃酮類化合物抗氧化活性的影響

付美玲，李丹丹*，修建華

（1.河北科技大學食品與生物學院，河北 石家莊 050000；2.河北省山楂加工技術創(chuàng)新中心，河北 承德 067300）

山楂，又名山里紅、胭脂果，屬于薔薇科，是一種藥食同源的果實，具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值[1-4]。山楂具有活血化瘀、消食化積的作用[5]，能降血脂和防治心血管疾病[6]，同時，山楂中所含的黃酮類化合物具有輔助治療心血管疾病、護肝、抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、保護大腦等多種保健功效[7-8]，能增強機體的免疫力，有防癌的作用[9-10]。

超微粉碎技術是通過機械或流體動力的途徑將物料粉碎至微米甚至納米級的過程，通過降低物料顆粒的粒度導致物料表面積和孔隙率發(fā)生變化，不僅可以改善原料的理化、功能、食用特性，還可促進原料中營養(yǎng)物質、生物活性組分的釋放和吸收[11]。施鍇云等[12]研究發(fā)現(xiàn)超微粉碎竹筍殼中的黃酮溶出率有所提高。張璐[13]將超微粉碎技術應用于功能性食品藜麥中，發(fā)現(xiàn)藜麥超微粉的總黃酮溶出量比普通粉提高了48.62%。有研究表明[14-15]，超微粉碎可以提高多種食品中功能性成分的溶出率。

對天然產(chǎn)物中黃酮類化合物及山楂中活性成分的提取已有一些文獻報道[16-19]，但是利用超微粉碎和超聲輔助方法研究山楂黃酮類化合物的提取工藝條件及理化性質的研究較少。因此本研究將超微粉碎技術應用于山楂黃酮類化合物的提取，研究超微粉碎技術對山楂黃酮類化合物提取率及抗氧化活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂干：市售；蘆丁、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海寶曼生物科技有限公司；2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：東京化成工業(yè)株式會社；無水乙醇：天津市永大化學試劑有限公司；亞硝酸鈉、過氧化氫、過硫酸鉀：天津市大茂化學試劑廠；氫氧化鈉：天津市大陸化學試劑廠；硝酸鋁：山東西亞化學工業(yè)有限公司；維生素C：天津市鼎盛鑫化工有限公司；檸檬酸：天津市華東試劑廠；硫酸亞鐵：天津市四通化工廠；水楊酸：天津市標準科技有限公司。以上化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

PL203電子天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；FW100高速萬能粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；ZM200超離心研磨儀：上海圣科儀器設備有限公司；V-5000可見光分光光度計：上海元析儀器有限公司；TDL-5-A臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；R201C恒溫水浴鍋：鞏義市英峪予華儀器廠；KQ5200DE超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超微粉碎山楂粉的制備

將山楂干投入高速萬能粉碎機中初步粉碎，每次打粉10 s，每次間隔1 min，共打粉3次，過20目篩得到普通山楂粉。取適量的普通山楂粉，投入超離心研磨儀中，少量多次投料，防止機身溫度過高，粉碎篩孔分別為 2.00、1.00、0.75、0.50、0.25、0.12、0.08 mm，得到粒度分別為 2.00、1.00、0.75、0.50、0.25、0.12、0.08 mm的超微粉碎山楂粉。

1.3.2 山楂黃酮類化合物的含量測定

參考黃芳[20]的方法并稍加改進，準確稱取不同粉碎粒度的山楂粉0.5 g置于燒杯中，采用超聲輔助法提取山楂黃酮類化合物，采用60%乙醇溶液，在料液比1∶50（g/mL）、超聲功率 100 W、超聲溫度 50℃，超聲時間20 min的條件下處理，得到黃酮類化合物的提取液。將提取液離心（3 000 r/min，10 min）后，取上清液置于50 mL的容量瓶中，用60%乙醇溶液定容，得到濃度為0.02 g/mL的7個不同粒度的超微粉碎山楂粉樣液，備用。

1.3.2.1 標準曲線的繪制

根據(jù)張旭等[21]的方法，精密稱取120℃干燥至恒重的蘆丁標準品25 mg，加入30 mL 60%的乙醇溶液，超聲助溶，轉移至50 mL容量瓶中，用60%的乙醇定容，準確量取20 mL蘆丁溶液，置于50 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，得對照品溶液。準確量取對照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，分別置于 25 mL 容量瓶中，加入 5%的亞硝酸鈉溶液1 mL，放置6 min后加入10%的硝酸鋁溶液1 mL，放置6 min；最后加入1 mL 4%的氫氧化鈉溶液，加水定容至刻度，搖勻，以60%乙醇溶液為空白，在500 nm處測其吸光度，測定3次取平均值。以蘆丁濃度（X）為橫坐標，吸光度（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程：Y=6.010 4X+0.154 1（R2=0.999 1）。

1.3.2.2 山楂黃酮類化合物含量的測定

精密移取2 mL樣液置于25 mL的容量瓶中，加入5%的亞硝酸鈉溶液1 mL，放置6 min后加入10%硝酸鋁溶液1 mL，放置6 min；最后加入1 mL的4%氫氧化鈉溶液，定容至刻度搖勻，放置15 min，以60%乙醇溶液為空白，在500 nm處測其吸光度。對照標準曲線，計算黃酮類化合物含量。

1.3.3 山楂黃酮類化合物提取率的計算

根據(jù)山楂黃酮類化合物含量，代入下式計算山楂黃酮類化合物提取率。

式中：X為樣品提取液總濃度，mg/mL；D為稀釋倍數(shù)；V為定容體積，mL；W為山楂粉質量，mg。

1.3.4 山楂黃酮類化合物抗氧化活性的測定

1.3.4.1 超微粉碎山楂粉粒度對山楂黃酮類化合物DPPH自由基清除能力的影響

根據(jù)安卓[22]的方法并稍加改進。稱取4 mg DPPH，用無水乙醇溶解，定容于50 mL容量瓶中，搖勻，備用。稱取5.0 mg檸檬酸，用無水乙醇溶解，定容于50 mL容量瓶中，搖勻，備用。

分別吸取4 mL檸檬酸、4 mL樣液于10 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，在10 mL比色管中加入DPPH溶液2 mL，各濃度樣液2 mL，搖勻，室溫26℃避光靜置30 min，在517 nm處測量吸光度Ai；用2 mL無水乙醇代替樣液，測量吸光度A0；用2 mL無水乙醇代替DPPH溶液，測量吸光度Aj。DPPH自由基清除率按下式計算。

1.3.4.2 超微粉碎山楂粉粒度對山楂黃酮類化合物羥自由基清除能力的影響

根據(jù)李新明等[23]的方法并稍加改進，分別取7種不同粒度超微粉碎山楂粉樣液1.0 mL于試管中，分別加入10 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL和10 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1.0 mL，混合均勻后加入10 mmol/L H2O2溶液1.0 mL，在37℃水浴條件下反應30 min，于波長510 nm處測定吸光度A1，使用蒸餾水替代H2O2作為參比對照，測定吸光度A2；用蒸餾水代替樣品作為空白對照，測定吸光度A0。按下式計算羥自由基清除率。

1.3.4.3 超微粉碎山楂粉粒度對山楂黃酮類化合物ABTS+自由基清除能力的影響

根據(jù)趙國超等[24]的方法并稍加改進，精密稱取0.038 4 g ABTS和0.013 4 g過硫酸鉀，用去離子水分別定容至10.0 mL，混勻后于4℃條件下避光放置16 h，得到7 mmol/L ABTS儲備液；使用前用無水乙醇對其進行稀釋，使其在734 nm處的吸光值達0.70±0.02。

將7個不同粒度的超微粉碎山楂粉樣液加入配制好的 ABTS溶液（體積比 1∶1），室溫（26℃）下暗反應0.25 h，測定其在734 nm波長處的吸光值（Ai）；測定ABTS溶液與無水乙醇等體積混合后在734 nm波長處的吸光值（A0）；測定無水乙醇與樣品溶液等體積混合后在734 nm波長處的吸光值（Aj）。ABTS+自由基清除率計算公式如下。

1.3.4.4 山楂黃酮類化合物與維生素C的抗氧化活性比較

選擇相同濃度的維生素C做陽性對照，維生素C的濃度為0.02 g/mL，根據(jù)不同粉碎粒度山楂粉對DPPH自由基、羥自由基、ABTS+自由基清除能力的影響結果，選擇對各自由基清除能力最強的粉碎粒度的超微山楂粉與維生素C作比較。

1.3.5 超微粉碎山楂粉的微觀結構觀察

取普通山楂粉與1.0 mm的超微粉碎山楂粉進行掃描電鏡觀察。取少量的普通山楂粉與1.0 mm的超微粉碎山楂粉，粘于樣盤的雙面膠上，噴金后進行掃描電鏡觀察，取500、1 000、5 000倍進行觀察比較。

2 結果與分析

2.1 超微粉碎山楂粉粒度對山楂黃酮類化合物提取率的影響

超微粉碎山楂粉粒度對山楂黃酮類化合物提取率的影響見圖1。

圖1 超微粉碎山楂粉粒度對山楂黃酮類化合物提取率的影響Fig.1 The effect of superfine crushed hawthorn powder particle size on the extraction rate of hawthorn flavonoids

由圖1可知，在超微粉碎山楂粉粒度為0.08 mm～2.00 mm時，隨著粒度的增大，山楂黃酮類化合物提取率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當粒度為1.0 mm時提取率最大，為13.01%。這可能是由于山楂黃酮類化合物存在于細胞中，超微粉碎山楂粉粒度為1.0 mm時，山楂粉的粒度均勻，增加了溶劑與山楂粉的接觸面積，有利于山楂黃酮類化合物的溶出[25]；當粒度小于1.0 mm時，山楂黃酮類化合物的提取率降低，可能是由于山楂黃酮類化合物結構被破壞，導致山楂中黃酮含量下降。當粒度大于1.0 mm時，山楂黃酮類化合物的提取率也會降低，可能由于山楂粉與溶劑不能充分接觸，導致其中的黃酮類化合物不能充分溶出。

2.2 超微粉碎山楂粉粒度對山楂黃酮類化合物抗氧化活性的影響

2.2.1 超微粉碎山楂粉粒度對山楂黃酮類化合物DPPH自由基清除率的影響

圖2為超微粉碎山楂粉粒度對山楂黃酮類化合物DPPH自由基清除能力的影響。

圖2 超微粉碎山楂粉粒度對山楂黃酮類化合物DPPH自由基清除率的影響Fig.2 The effect of superfine crushed hawthorn powder particle size on the scavenging rate of hawthorn flavonoids DPPH free radicals

由圖2可以看出，在超微粉碎山楂粉粒度為0.08 mm～2.00 mm時，隨著粒度的增大，山楂黃酮類化合物提取率呈現(xiàn)先急劇上升再緩慢上升后緩慢下降的趨勢。超微粉碎山楂粉粒度為1.0 mm時，對DPPH自由基的清除能力最高，達到了95.2%，但是當粒度超過1.0 mm時，隨著粒度的增加對DPPH自由基的清除效果呈現(xiàn)下降的趨勢。原因可能是超微粉碎山楂粉粒度為1.0 mm時，山楂組織被破碎的程度達到最大，山楂黃酮類化合物與提取溶劑的接觸面積增大，使得山楂黃酮類化合物更易溶出，對DPPH自由基清除率達到最高。

2.2.2 超微粉碎山楂粉粒度對山楂黃酮類化合物羥自由基清除率的影響

圖3為超微粉碎山楂粉粒度對羥自由基清除能力的影響。

圖3 超微粉碎山楂粉粒度對山楂黃酮類化合物羥自由基清除率的影響Fig.3 The effect of superfine crushed hawthorn powder particle size on the scavenging rate of hawthorn flavonoids and hydroxyl free radicals

由圖3可以看出，當粒度為0.08 mm～0.25 mm時，超微粉碎山楂粉隨粒度增大對羥自由基清除率急劇升高；而粒度為0.25 mm～1.00 mm時，羥自由基的清除率隨粒度增大呈緩慢升高的趨勢；超微粉碎山楂粉粒度為1.0 mm時，對羥自由基的清除率最高，達到了46.4%，但是當超微粉碎山楂粉粒度超過1.0 mm時，隨著粒度的增大其對羥自由基的清除效果呈現(xiàn)下降的趨勢。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是1.0 mm的超微粉碎山楂粉中有更多的抑制羥自由基生成的物質溶出，這些物質可以抑制Fenton反應，降低羥自由基的生成，羥自由基清除能力最高。當超微粉碎山楂粉的粒度大于1.0 mm時，由于粒徑太大，會降低原料與提取劑的接觸面積，會降低這種抑制羥自由基生成的物質的溶出，進而導致羥自由基清除率下降。當超微粉碎山楂粉的粒度小于1.0 mm時，由于粒徑太小，會破壞這種抑制羥自由基生成物質的結構，降低其抑制Fenton反應的效果，進而導致其羥自由基的清除率下降。

2.2.3 超微粉碎山楂粉粒度對山楂黃酮類化合物ABTS+自由基清除率的影響

圖4為超微粉碎山楂粉粒度對山楂黃酮類化合物ABTS+自由基清除能力的影響。

圖4 超微粉碎山楂粉粒度對山楂黃酮類化合物ABTS+自由基清除率的影響Fig.4 The effect of superfine crushed hawthorn powder particle size on the scavenging rate of hawthorn flavonoids ABTS+free radicals

由圖4可以看出，當粒度在0.08 mm～0.25 mm時，超微粉碎山楂粉對ABTS+自由基清除率隨粒度增大而急劇升高；而粒度在0.25 mm～1.00 mm時，ABTS+自由基清除率隨粒度增大呈緩慢升高的趨勢；超微粉碎山楂粉粒度為1.0 mm時，對ABTS+自由基的清除能力最高，達到了99.6%，但超微粉碎山楂粉粒度超過1.0 mm時，隨著粒度的增加其對ABTS+自由基的清除效果呈現(xiàn)下降的趨勢。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是超微粉碎山楂粉粒度為1.0 mm時，超微粉碎山楂粉的粒徑均勻，其與提取溶劑的接觸面積達到最大，有更多山楂黃酮類化合物溶出。

2.2.4 山楂黃酮類化合物與維生素C的抗氧化活性的比較

山楂黃酮類化合物（超微粉碎山楂粉粒度1.0 mm）與維生素C的抗氧化活性比較見表1。

表1 山楂黃酮類化合物與維生素C的抗氧化活性的比較Table 1 Comparison of antioxidant activity between hawthorn flavonoids and vitamin C

如表1所示，在清除自由基試驗中，山楂黃酮類化合物對DPPH自由基、羥自由基和ABTS+自由基均展示出良好的清除作用。通過比較，維生素C和超微粉碎山楂粉對DPPH自由基清除率以及ABTS+自由基清除率相差不大，但超微粉碎山楂粉對羥自由基的清除率明顯低于維生素C。雖然山楂黃酮類化合物抗氧化能力不如維生素C，但仍具有較好的抗氧化活性。

2.3 超微粉碎對山楂粉微觀結構的影響

圖5為超微粉碎山楂粉掃描電鏡圖。

圖5 普通山楂粉及超微粉碎山楂粉（粒度1.0 mm）的掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electron micrographs of ordinary hawthorn powder and superfine crushed hawthorn powder（particle size 1.0 mm）

由圖5a可以看出，普通山楂粉在放大500倍后，粉體表面層次較少，且表面較為平滑；由圖5b可以看出，超微粉碎山楂粉在放大500倍后，粉體表面層次增多，且表面較為粗糙；由圖5c可以看出，普通山楂粉在放大1 000倍后，孔隙率較少，比表面積較??；由圖5d可以看出，超微粉碎山楂粉在放大1 000倍后，孔隙率增加，比表面積變大；由圖5e可以看出，普通山楂粉在放大5 000倍后，粉體較大較圓，孔隙率變小，比表面積相對較小；由圖5f可以看出，超微粉碎山楂粉在放大5 000倍后，孔隙率變大，出現(xiàn)了團聚現(xiàn)象。

超微粉碎山楂粉粒度為1.0 mm時山楂黃酮類化合物提取率更高，抗氧化活性也更強，結合微觀結構觀察，其原因可能是山楂粉表面變粗糙，孔隙增多、比表面積大，增大了山楂粉與乙醇之間的接觸面積，更有助于山楂中黃酮類化合物的溶出。由璐[26]研究了山楂超微粉對高脂膳食誘導的C57BL/6J小鼠肥胖的調控作用，對比了山楂粗粉與山楂超微粉的掃描電鏡圖，結果表明山楂超微粉的粉體表面更加崎嶇、多層，有團聚現(xiàn)象，比表面積較大，具有較強的聚合力和吸附能力，能有效地吸附在食品表面，與本研究結果一致。

3 結論

山楂黃酮類化合物的提取技術多以溶劑提取法為主，本文以乙醇為提取溶劑，采用超微粉碎技術結合超聲輔助法對山楂黃酮類化合物進行提取，并探究了超微粉碎對山楂黃酮類化合物抗氧化活性的影響。通過不同粒度的超微粉碎山楂粉提取黃酮類化合物，得出超微粉碎山楂粉粒度為1.0 mm時，山楂黃酮類化合物的提取率達到最大，且抗氧化活性達到最高，其中DPPH自由基清除率為95.2%，羥自由基清除率為46.4%，ABTS+自由基清除率為99.6%。