電針太沖穴及曲池穴拮抗應(yīng)激性高血壓前期大鼠胸主動(dòng)脈外膜重構(gòu)的機(jī)制研究

謝曉佳, 曹 銳, 劉清國(guó), 黃 粵, 朱宏勛, 趙世同, 趙靜怡

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院 中醫(yī)科, 北京, 100020;2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院, 北京, 100105)

隨著現(xiàn)代社會(huì)生活節(jié)奏的加快，全球應(yīng)激性高血壓發(fā)病率逐年攀升，為將高血壓防治陣線(xiàn)前移，美國(guó)預(yù)防、檢測(cè)、評(píng)估與治療高血壓全國(guó)聯(lián)合委員會(huì)第七次報(bào)告(JNC 7)提出了“高血壓前期(收縮壓120～139 mmHg, 舒張壓80～89 mmHg)”的概念[1]。研究[2]表明，高血壓前期發(fā)病呈年輕化的趨勢(shì)，并且已經(jīng)出現(xiàn)了心、腦、腎等靶器官的損害，而血管重構(gòu)(VR)是導(dǎo)致靶器官損傷的病理基礎(chǔ)，若能在前期階段進(jìn)行有效的干預(yù)，則能較大程度上逆轉(zhuǎn)靶器官損傷進(jìn)程。近年來(lái)研究[3]表明，血管外膜是血管病變的始動(dòng)者，其病變順序應(yīng)該是“由外向內(nèi)”。目前，血管外膜已成為治療血管病變的新方向，“外膜炎癥”是動(dòng)脈硬化(AS)的始動(dòng)環(huán)節(jié)，在AS發(fā)生早期即被激活，產(chǎn)生白細(xì)胞介素-6(IL-6)等炎性因子，并可促使血管外膜成纖維細(xì)胞(AF)被激活，刺激細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成增多，進(jìn)而導(dǎo)致AS[4]。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)可參與調(diào)節(jié)AF增殖、轉(zhuǎn)化、遷移和ECM產(chǎn)生，是公認(rèn)的影響AF最直接、最重要的細(xì)胞因子。Smads是TGF-β1信號(hào)通路下游的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可將其信號(hào)由膜外轉(zhuǎn)至核內(nèi)[5]。TGF-β1可通過(guò)Smads通路促進(jìn)AF轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(MF)與ECM沉積，最終導(dǎo)致AS[6]。高血壓前期屬于中醫(yī)治未病的典型，在這一階段即運(yùn)用針刺治療方法具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本研究在針刺治未病理論的指導(dǎo)下，觀察電針太沖、曲池穴對(duì)應(yīng)激性高血壓前期大鼠(SIPR)血壓、血管外膜病理形態(tài)的影響，探討電針降壓及保護(hù)靶器官的具體機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

將30只由北京維通利華公司提供的無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)雄性Wistar大鼠飼養(yǎng)于北京呼吸疾病研究所動(dòng)物房，大鼠體質(zhì)量(220±30) g, 室溫(20±1)℃，相對(duì)濕度50%，通風(fēng)良好，定期紫外線(xiàn)消毒，清掃糞便，更換墊料。將30只大鼠隨機(jī)分為模型組、電針組、空白組，每組10只。

1.2 造模方法

運(yùn)用足底電擊結(jié)合噪聲刺激造模。采用MG-2型迷宮刺激器(上海繼德教學(xué)實(shí)驗(yàn)器械廠(chǎng))制備SIPR模型。模型組、電針組大鼠在每天上午、下午同一時(shí)間各接受1次持續(xù)2 h的電擊足底結(jié)合噪聲應(yīng)激刺激。應(yīng)激時(shí)將大鼠放入由細(xì)銅柵組成的90 cm×90 cm×50 cm的籠子底部，通過(guò)銅柵間斷給予大鼠足底電脈沖電刺激(脈沖電壓為40～80 V, 每2～25 s隨機(jī)發(fā)生1次，每次持續(xù)50 ms), 迷宮刺激器上方的蜂鳴器同時(shí)發(fā)出噪聲刺激，強(qiáng)度為80～100 db, 持續(xù)50 ms, 造模周期為14 d。

1.3 干預(yù)方式

將各組大鼠固定在特制鼠套中，露出四肢、尾部，固定20 min。選穴參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》: 雙側(cè)太沖穴(后肢足背1、2趾骨凹陷處)，直刺1 mm; 雙側(cè)曲池穴(肘關(guān)節(jié)外側(cè)前方凹陷中)，直刺4 mm。選用針具為中研太和牌一次性毫針(規(guī)格0.16 mm×7 mm), 電針組進(jìn)針后連接LH202H型韓式電針儀，陽(yáng)極接太沖，陰極接曲池穴，電流刺激強(qiáng)度為1 mA, 頻率2 Hz, 留針20 min。電針組大鼠從接受造模的第1天起接受針刺干預(yù)，直到第14天造模結(jié)束，所有操作均由同一人于每天下午固定時(shí)間進(jìn)行。

1.4 血壓測(cè)定

在復(fù)合應(yīng)激刺激開(kāi)始的前l(fā) d以及復(fù)合應(yīng)激刺激開(kāi)始的第3、5、7、9、11、13、15天下午刺激結(jié)束后2 h以及電針治療14 d結(jié)束后，分別用智能無(wú)創(chuàng)血壓儀(BP-98A，德國(guó)制造)測(cè)量各組大鼠尾動(dòng)脈的收縮壓(連測(cè)3次，取均值)，數(shù)值波動(dòng)范圍不超過(guò)±10 mmHg為宜。

1.5 動(dòng)物取材

采用20%氨基甲酸乙酯腹腔注射進(jìn)行全身麻醉，劑量為每100 g 1 mL, 將大鼠固定于手術(shù)架上，開(kāi)胸腔，剪取胸主動(dòng)脈0.5 cm, 立即置于冰上操作，剔除結(jié)締組織，采用生理鹽水清洗，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 蘇木素-伊紅染色(HE染色)觀察組織形態(tài)改變

取1.5步驟中的大鼠胸主動(dòng)脈組織約1 cm, 置于4%多聚甲醛中固定后脫水，石蠟包埋切片，經(jīng)二甲苯脫蠟乙醇水化, HE染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透化，中性樹(shù)膠封片固定，光鏡下觀察。

1.7 Masson染色觀察組織膠原纖維改變

取1.6步驟中的切片，將切片脫蠟至水，蘇木素染色，麗春紅浸染，磷鉬酸分化，苯胺藍(lán)染色，1%冰醋酸分化，中性樹(shù)膠固封，鏡下觀察。

1.8 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)定各組

大鼠主動(dòng)脈組織TGF-β1、IL-6、Smad3、白細(xì)胞介素-10(IL-10)的mRNA表達(dá)

取1.5步驟中的大鼠胸主動(dòng)脈組織約10 mg, 按照Trizol試劑(美國(guó) GBCO公司)說(shuō)明書(shū)提取主動(dòng)脈組織總RNA, 采用核酸蛋白分析儀檢測(cè)其濃度和純度，取總RNA, 參照RT-PCR試劑盒(日本 Toyobo)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，取2 μL的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，以TaqDAN 聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，以β-action為內(nèi)參，計(jì)算各樣本TGF-β1、IL-6、Smad3、IL-10的mRNA條帶光密度值與β-actionmRNA條帶的比值。

1.9 Western blot法檢測(cè)各組大鼠主動(dòng)脈中

Smad7、α-平滑肌激動(dòng)蛋白(α-SMA)、Ⅰ型和Ⅲ型膠原的蛋白表達(dá)水平

取1.5步驟中的大鼠胸主動(dòng)脈組織約30 mg, 加入300 μL 蛋白裂解液中研磨，提取胸主動(dòng)脈組織總蛋白，采用BCA定量法測(cè)定總蛋白濃度，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)制備分離膠與濃縮膠; 電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，室溫封閉60 min, 加入一抗Ⅰ型膠原 (1∶1 000)、Ⅲ型膠原 (1∶1 000)、Smad7 (1∶800)、α-SMA (1∶1 000) 4 ℃孵育過(guò)夜，室溫下用TBST清洗膜3次，添加二抗 (1∶10 000), 室溫孵育60 min, TBST洗膜，化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行曝光拍照保存，以β-actin蛋白為內(nèi)參，采用Image J軟件分析Smad7、α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ型膠原條帶的灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠收縮壓變化

3組大鼠針刺治療前的收縮壓比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第3天時(shí)，與空白組比較，模型組大鼠收縮壓升高到120 mmHg, 第14天時(shí)收縮壓持續(xù)升高并始終保持在高血壓前期狀態(tài)(120～139 mmHg), 提示造模成功。與模型組比較，電針組第5、7、9、11、13、15天時(shí)收縮壓下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表1。

mmHg

2.2 各組大鼠胸主動(dòng)脈外膜HE染色的病理變化

空白組胸主動(dòng)脈管壁無(wú)增厚，血管內(nèi)膜均勻光滑，外膜厚度均一，外膜與中膜分界明顯; 模型組胸主動(dòng)脈管壁增厚，外膜厚度明顯增加，細(xì)胞增生活躍，排列紊亂，有較多炎性細(xì)胞附著，有的出現(xiàn)剝脫甚至斷裂，血管內(nèi)皮欠光滑，不均勻，內(nèi)膜上有少量炎癥細(xì)胞附著，外膜與中膜分界不清晰; 電針組胸主動(dòng)脈內(nèi)膜較為光滑均勻，中層平滑肌細(xì)胞排列較規(guī)整，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，較空白組雖有外膜厚度增加、細(xì)胞輕度增生、排列欠整齊，但外膜與中膜分界較清晰，較模型組有明顯改善。見(jiàn)圖1(藍(lán)色箭頭處為增厚的血管外膜)。

圖1 各組大鼠胸主動(dòng)脈外膜HE染色(放大倍數(shù)200倍)

2.3 各組大鼠胸主動(dòng)脈Masson染色的病理變化

空白組胸主動(dòng)脈細(xì)胞排列整齊，血管內(nèi)膜、中膜、外膜細(xì)胞間質(zhì)散在有少量藍(lán)色膠原纖維; 模型組胸主動(dòng)脈細(xì)胞排列紊亂，血管內(nèi)膜、中膜、外膜均可見(jiàn)大量藍(lán)色膠原蛋白沉積，以外膜較為明顯; 電針組膠原沉積程度減輕。見(jiàn)圖2(黑色箭頭處為膠原蛋白沉積)。

圖2 各組大鼠胸主動(dòng)脈Masson染色(放大倍數(shù)200倍)

2.4 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織TGF-β1、IL-6、Smad3、IL-10的mRNA表達(dá)

與空白組比較，模型組大鼠TGF-β1、Smad3、IL-6、IL-10的mRNA表達(dá)量均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01); 與模型組比較，電針組大鼠TGF-β1、Smad3、IL-6的mRNA表達(dá)量均降低,IL-10mRNA增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織TGF-β1、IL-6、Smad3、IL-10的mRNA表達(dá)

2.5 各組大鼠胸主動(dòng)脈組織Smad7、α-SMA、Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)

與空白組比較，模型組大鼠Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白以及α-SMA蛋白表達(dá)均增加, Smad7蛋白表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01); 與模型組比較，電針組Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白、α-SMA蛋白表達(dá)降低, Smad7蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表3、圖3。

表3 各組大鼠胸主動(dòng)脈Smad7、α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ型膠原的蛋白表達(dá)

圖3 各組大鼠胸主動(dòng)脈Smad7、α-SMA、Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)

3 討 論

高血壓前期屬于中醫(yī)學(xué)“眩暈” “頭痛”“肝風(fēng)”等范疇[7-8], 屬本虛標(biāo)實(shí)之證，基本病機(jī)為氣血失調(diào)、氣血上逆，故應(yīng)采取清泄降逆、調(diào)和氣血為基礎(chǔ)的治療原則。太沖穴歸于少氣多血之足厥陰經(jīng)，為其輸穴，又是肝的原穴，故太沖穴具有較好的平?jīng)_降逆功效。陽(yáng)明經(jīng)氣血豐富，曲池穴為手陽(yáng)明經(jīng)之合，且大腸又為六腑之一，以通降為順，五行亦屬金，專(zhuān)克肝木，故曲池穴偏于清熱調(diào)氣和血，兩穴相配可標(biāo)本兼顧發(fā)揮平肝潛陽(yáng)、柔肝熄風(fēng)、調(diào)氣降逆之效，是臨床治療高血壓病常用且較好的穴位配伍[9-11]。本研究發(fā)現(xiàn)電針對(duì)于SIPR具有明顯的降壓效果，且短期效果較好，同時(shí)電針組主動(dòng)脈損害較輕，說(shuō)明電針對(duì)于SIPR主動(dòng)脈具有一定的保護(hù)作用[12-14]。本研究應(yīng)用足底電擊結(jié)合噪聲刺激的復(fù)合造模方法[15-16]制備SIPR大鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠均出現(xiàn)易激怒、互相撕咬打架、睛紅充血、毛色發(fā)黃變澀、食欲下降、糞便干結(jié)等外觀和行為變化，為近似高血壓中醫(yī)辨證肝陽(yáng)上亢型模型[17-18]。根據(jù)模型組HE染色、Masson染色結(jié)果顯示，在高血壓前期階段即可出現(xiàn)血管損傷，且外膜損傷出現(xiàn)早于內(nèi)膜，損傷程度重于內(nèi)膜[19-20]。

針對(duì)AS的發(fā)病機(jī)制，既往研究[3]多集中在血管內(nèi)膜方面，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)AS的本質(zhì)是血管壁炎癥反應(yīng)，而外膜炎癥是引起AS的始動(dòng)因素。作為血管外膜主要細(xì)胞成分的AF在生理?xiàng)l件下處于靜息狀態(tài)，當(dāng)受到缺氧、炎癥和細(xì)胞因子等因素刺激時(shí)，會(huì)被激活并表型轉(zhuǎn)化為MF，MF增殖、遷移能力增強(qiáng)，并分泌TGF-β1、TNF-α、IL-6、基質(zhì)金屬蛋白酶等多種細(xì)胞因子和Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白等ECM, 推動(dòng)AS的發(fā)生發(fā)展[4]。血管外膜的早期活化增殖及炎癥反應(yīng)在AS中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，血管外膜有可能成為治療血管重構(gòu)的新靶點(diǎn)。研究[21]表明SHR大鼠血管外膜AF上炎癥介質(zhì)表達(dá)上調(diào)，可進(jìn)一步增強(qiáng)大鼠血管外膜AF的遷移能力和炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加快AS進(jìn)程。IL-6是由血管外膜AF所產(chǎn)生，可以促進(jìn)外膜AF的增殖和ECM中膠原的合成，導(dǎo)致AS[22]。IL-10是由單核巨噬細(xì)胞分泌的一種抗炎細(xì)胞因子，已被證明可以抑制AF的增殖和Ⅰ型、Ⅲ型膠原的表達(dá)[23]。本研究表明，電針能降低IL-6mRNA并升高IL-10mRNA水平，提示電針太沖、曲池穴可改善SIPR血管外膜重構(gòu)，其機(jī)制可能與通過(guò)抑制IL-6mRNA和升高IL-10mRNA表達(dá)從而減輕血管外膜炎癥反應(yīng)有關(guān)。

AF是血管外膜的主要細(xì)胞成分，在生理?xiàng)l件下, AF處于靜息狀態(tài)。當(dāng)受到炎癥、缺氧和細(xì)胞因子的刺激時(shí)，其會(huì)被激活并轉(zhuǎn)化為MF, 研究[24]表明AF的增殖與膠原纖維等ECM的增加是AS的重要機(jī)制，TGF-β1參與其中，并且是公認(rèn)的影響AF生物功能最直接、最重要的細(xì)胞因子。TGF-β1可使AF表型發(fā)生改變而成為MF，其中α-SMA作為AF活化的主要標(biāo)記物，亦是探討血管老化的重要檢測(cè)指標(biāo)，可以用來(lái)衡量AS的程度[25]。目前TGF-β1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路已基本闡明。近年來(lái)研究[5]表明, TGF-β1及其介導(dǎo)的Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在血管外膜重構(gòu)機(jī)制中發(fā)揮重要作用。TGF-β1可以招募其下游效應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Smad2、Smad3、Smad4, 并將其磷酸化形成Smads復(fù)合物，能將信號(hào)從膜外轉(zhuǎn)導(dǎo)至核內(nèi)，上調(diào)與ECM合成相關(guān)的基因表達(dá)，導(dǎo)致膠原等沉積，并能促進(jìn)AF向MF轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致血管外膜重構(gòu)。Smad7是抑制性信號(hào)蛋白，是TGF-β信號(hào)通路關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子，能與Smad2、Smad3競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合TGF-β1受體并阻斷其激活，進(jìn)而抑制AS。本研究模型組大鼠胸主動(dòng)脈TGF-β1mRNA和Smad3mRNA表達(dá)量均明顯增加，而電針組均明顯下降，且電針能有效抑制SIPR胸主動(dòng)脈α-SMA以及Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)，增加Smad7蛋白表達(dá)[26], 表明電針改善SIPR血管外膜重構(gòu)機(jī)制可能與參與調(diào)控TGF-β1/Smads信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，電針太沖、曲池穴對(duì)SIPR的血管外膜重構(gòu)有良好的改善作用，電針發(fā)揮作用機(jī)制可能與參與調(diào)控TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和抑制血管外膜炎癥反應(yīng)相關(guān)。