食品有害物誘發(fā)細(xì)胞焦亡的研究進(jìn)展

李浩,袁莉,駱瑩

(陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，西部果品資源高值利用教育部工程研究中心,陜西 西安,710119)

2001年,COOKSON等[1]首次使用細(xì)胞焦亡(pyroptosis)來(lái)形容在巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的半胱天冬酶-1(Caspase-1)依賴(lài)性細(xì)胞死亡方式,并證實(shí)細(xì)胞焦亡是一種新的程序性細(xì)胞死亡方式,其特征為依賴(lài)于Caspase-1活化,并伴有大量促炎癥因子釋放。直至2015年,邵峰院士團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn),Caspase-1并不是細(xì)胞焦亡發(fā)生的必要條件,細(xì)胞焦亡還可由脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)激活 Caspase-4/5/11引起,活化的Caspase-4/5/11通過(guò)切割激活Gasdermin家族蛋白最終誘發(fā)細(xì)胞焦亡[2-3]。因此,細(xì)胞死亡命名委員會(huì)進(jìn)一步修正了細(xì)胞焦亡的定義：由Gasdermin家族蛋白介導(dǎo)的質(zhì)膜膜孔形成的可調(diào)控性細(xì)胞死亡,經(jīng)常但并不總因炎癥性Caspase的活化而完成的細(xì)胞程序性壞死[4]。

1 細(xì)胞焦亡的概念及形態(tài)學(xué)特征

細(xì)胞焦亡的形態(tài)學(xué)特征、發(fā)生及調(diào)控機(jī)制等均不同于凋亡、壞死等其他細(xì)胞死亡方式(表1)[5-8]。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生焦亡時(shí),細(xì)胞核濃縮、DNA碎片化,細(xì)胞膜上出現(xiàn)直徑10～20 nm孔洞,細(xì)胞電解質(zhì)平衡喪失,細(xì)胞腫脹破裂、胞內(nèi)容物外釋,激發(fā)固有免疫并使之過(guò)度活化,最終導(dǎo)致細(xì)胞炎性死亡?？赏ㄟ^(guò)透射電子顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞膜孔洞生成,以及Caspase-1 FLICA和SYTOX blue染色呈現(xiàn)雙陽(yáng)性來(lái)觀(guān)測(cè)細(xì)胞是否發(fā)生焦亡。

表1 細(xì)胞焦亡、凋亡、自噬、壞死的特征Table 1 Characteristics of pyroptosis,apoptosis,autophagy and necrosis

2 細(xì)胞焦亡途徑及相關(guān)蛋白

細(xì)胞焦亡,是一種依賴(lài)炎性Caspase蛋白,并伴有炎癥反應(yīng)的程序性細(xì)胞死亡方式,長(zhǎng)期、過(guò)度的細(xì)胞焦亡會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡、機(jī)體組織損傷、器官衰竭、膿毒性休克等病理狀態(tài)[9-10]。最新研究表明,細(xì)胞焦亡本質(zhì)上由炎性Caspase蛋白切割其共同底物Gasdermin-D(GSDMD)蛋白形成的N端結(jié)構(gòu)域(GSDMD-NT)介導(dǎo)發(fā)生,即GSDMD蛋白才是細(xì)胞焦亡的執(zhí)行者[2]。

2.1 Caspase家族與NLRP3炎癥小體

Caspase家族全稱(chēng)為半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶,共有14個(gè)成員,在細(xì)胞死亡及炎癥過(guò)程中發(fā)揮核心作用。根據(jù)細(xì)胞生物學(xué)功能和底物特異性將Caspase家族蛋白分為兩大類(lèi)：與炎癥相關(guān)的Caspase和與細(xì)胞凋亡相關(guān)的Caspase。其中,炎癥相關(guān)的Caspase也與細(xì)胞焦亡密切相關(guān)[11],包含：Caspase-l、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11。

炎癥小體是一種多聚蛋白復(fù)合物。已發(fā)現(xiàn)的炎癥小體有NLRP3、AIM2、Pyrin、NLRC4、NLRP1,其中NLRP3炎癥小體的研究最為廣泛、深入。NLRP3炎癥小體由NLRP3受體蛋白先后募集凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing a CARD)和Caspase-1前體(Pro-Caspase-1)構(gòu)成。NLRP3炎癥小體形成后,Pro-Caspase-1蛋白會(huì)自剪切形成具有活性的Caspase-1,從而啟動(dòng)細(xì)胞焦亡。據(jù)報(bào)道,細(xì)胞內(nèi)、外源刺激物或危險(xiǎn)信號(hào),如：二氧化硅、石棉、細(xì)菌、病毒、真菌、細(xì)菌毒素、三磷酸腺苷等,均可激活NLRP3炎性小體,繼而誘發(fā)細(xì)胞焦亡[12]。

2.2 細(xì)胞焦亡途徑

最新研究指出,細(xì)胞焦亡是GSDMD蛋白介導(dǎo)發(fā)生的一種程序性細(xì)胞死亡方式,同時(shí)伴有大量炎性因子釋放,如IL-1β和IL-18等[2-3]。它是機(jī)體受到病原微生物侵襲時(shí)啟動(dòng)的一種保護(hù)性免疫防御反應(yīng),但是長(zhǎng)期、過(guò)度的細(xì)胞焦亡會(huì)誘發(fā)多種炎癥性和免疫性疾病。細(xì)胞焦亡廣泛參與動(dòng)脈粥樣硬化、肝炎和肝纖維化等疾病的發(fā)生發(fā)展[13-14]。

根據(jù)依賴(lài)的炎性Caspase和外界刺激不同,細(xì)胞焦亡被分為依賴(lài)Caspase-1的經(jīng)典焦亡途徑和依賴(lài)Caspase-4/5/11(Caspase-4、Caspase-5或Caspase-11)的非經(jīng)典焦亡途徑(圖1)[15]。其中,經(jīng)典焦亡途徑：細(xì)胞中Caspase-1蛋白以無(wú)活性酶原形式(Pro-Caspase-1)存在。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激(有毒物質(zhì)、病原體、輻射等)后,Pro-Caspase-1通過(guò)構(gòu)成NLRP3等炎癥小體而被激活成具有酶活性的Caspase-1,Caspase-1繼而特異性地將GSDMD蛋白切割活化形成N端結(jié)構(gòu)域(GSDMD-NT)和C端結(jié)構(gòu)域(GSDMD-CT),GSDMD-NT進(jìn)一步通過(guò)寡聚化在細(xì)胞膜上形成膜孔,最終導(dǎo)致細(xì)胞破裂、死亡;同時(shí),活性Caspase-1將促炎性因子白介素1β前體(Pro-IL-1β)和白介素18前體(Pro-IL-18)剪切為成熟型IL-1β和IL-18,經(jīng)膜孔釋放,并通過(guò)誘導(dǎo)其他炎性因子(如 IL-6,TNF-α)、黏附分子和趨化因子等合成來(lái)擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。非經(jīng)典焦亡途徑：細(xì)胞受到細(xì)菌LPS刺激后,LPS脂質(zhì)部分直接與Caspase-4/5/11結(jié)合促進(jìn)它們活化;活化的Caspase-4/5/11剪切GSDMD形成GSDMD-NT,啟動(dòng)焦亡進(jìn)程;同時(shí),GSDMD-NT也可通過(guò)激活NLRP3炎癥小體活化Caspase-1,Caspase-1進(jìn)而剪切Pro-IL-1β形成IL-1β,并外釋、產(chǎn)生炎癥。

圖1 細(xì)胞焦亡途徑Fig.1 Pyroptosis pathway

2.3 GSDMD蛋白在細(xì)胞焦亡中的作用

GSDMD蛋白是Gasdermin家族一員,是所有炎性Caspase(Caspase-1/4/5/11)的共同底物,也是人類(lèi)和鼠科動(dòng)物細(xì)胞焦亡的直接執(zhí)行者[3]。發(fā)生細(xì)胞焦亡時(shí),GSDMD蛋白被活化的Caspase-1/4/5/11蛋白切割成具有親脂性和成孔活性的GSDMD-NT,以及具有親水性和結(jié)構(gòu)自抑作用的GSDMD-CT;GSDMD-NT繼而選擇性地與細(xì)胞膜內(nèi)膜結(jié)合并寡聚化形成直徑10～20 nm的膜孔,引起細(xì)胞膜滲透性紊亂,最終導(dǎo)致細(xì)胞溶脹、破裂,發(fā)生焦亡性死亡;同時(shí),GSDMD-NT還能促進(jìn)炎性因子IL-1β和IL-18大量釋放[16-17],激發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)。

3 食品有害物誘發(fā)肝臟組織細(xì)胞焦亡的相關(guān)分子機(jī)制

肝臟是食品有害物損害機(jī)體的主要靶器官。大量研究報(bào)道[23-25,28],食品有害物可通過(guò)誘導(dǎo)肝細(xì)胞焦亡引發(fā)一系列肝臟疾病。如苯并(α)芘、黃曲霉毒素B1、As2O3等(表2);且相關(guān)分子機(jī)制如圖2所示。

圖2 食品有害物誘發(fā)細(xì)胞焦亡的相關(guān)分子機(jī)制Fig.2 Molecular mechanism of cell pyroptosis induced by food hazards

3.1 苯并芘

苯并芘作為一種多環(huán)芳烴類(lèi)物質(zhì),是由苯與芘稠合而成。它有2種同分異構(gòu)體,分別是：苯并(α)芘(3,4-苯并芘)和苯并(e)芘(1,2-苯并芘),前者毒性更強(qiáng)[18]。一方面,食品在油炸、燒烤等高溫條件下,其中的油脂、膽固醇等會(huì)發(fā)生熱裂解反應(yīng),經(jīng)環(huán)化、聚合,從而生成苯并(α)芘[19];另一方面,苯并(α)芘由人類(lèi)生活、生產(chǎn)中使用的煤炭、石油等燃料不完全燃燒產(chǎn)生[20]。肝臟是苯并(α)芘的主要靶器官[21-22]。前期研究發(fā)現(xiàn),20 μmol/L苯并(α)芘處理HL-7702人肝細(xì)胞24 h后,細(xì)胞相對(duì)電導(dǎo)率、NO釋放量、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)釋放率顯著升高;同時(shí)HL-7702人肝細(xì)胞內(nèi)焦亡特征指標(biāo)Caspase-1、IL-1β、IL-18的蛋白表達(dá)量增多[23]。說(shuō)明苯并(α)芘可誘導(dǎo)HL-7702人肝細(xì)胞發(fā)生焦亡性損傷?；诖?LI等[24]研究發(fā)現(xiàn)天然黃酮異葒草素通過(guò)降低電導(dǎo)率、LDH和NO水平,抑制Pro-Caspase-1、Cleaved-Caspase-1、iNOS、Cox-2蛋白表達(dá)量,降低IL-1β和IL-18的mRNA水平,減弱由苯并(α)芘誘導(dǎo)的人肝細(xì)胞焦亡性損傷。同時(shí),有研究證明苯并(α)芘通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路誘導(dǎo)HL-7702人肝細(xì)胞焦亡性死亡[25]。

3.2 黃曲霉毒素B1

黃曲霉毒素是一組毒性極強(qiáng)的二吹喃香豆素的衍生化合物,1993年被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer,IARC)認(rèn)定為I類(lèi)致癌物[26]。其中,黃曲霉毒素B1毒性最強(qiáng),可嚴(yán)重?fù)p傷肝臟組織[27]。張力引[28]研究發(fā)現(xiàn),采用1 mg/kg黃曲霉毒素B1隔天灌胃C57BL/6小鼠,4周后處理組小鼠肝組織中NLRP3、ASC、IL-1β、GSDMD的蛋白水平升高、IL-1β分泌增多,表明黃曲霉毒素B1能誘發(fā)肝臟組織炎癥反應(yīng);另外采用20 μmol/L黃曲霉毒素B1對(duì)HepaRG人肝細(xì)胞進(jìn)行處理,24 h后處理組細(xì)胞LDH釋放率、IL-1β、活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量均顯著升高,NLRP3、ASC、IL-1β、GSDMD蛋白表達(dá)量增多,焦亡細(xì)胞數(shù)目增多。張力引[28]在成功建立焦亡細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上利用環(huán)氧合酶-2去磷酸化修飾調(diào)控處理組細(xì)胞,結(jié)果顯示焦亡細(xì)胞數(shù)目、NLRP3等焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)量有所降低,同時(shí)間接說(shuō)明黃曲霉毒素B1可誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生依賴(lài)于NLRP3炎癥小體的焦亡性損傷。

3.3 As2O3

大量流行病學(xué)調(diào)查顯示,砷的長(zhǎng)期暴露會(huì)導(dǎo)致肝損傷、心血管代謝異常等疾病[29]。其中,肝臟是砷代謝的主要器官[30]。邱天明[31]研究了As2O3誘導(dǎo)非酒精性脂肪肝/非酒精性脂肪性肝炎的相關(guān)機(jī)制,結(jié)果發(fā)現(xiàn)As2O3能夠促進(jìn)NLRP3炎癥小體、Caspase-1等參與HepG2細(xì)胞焦亡,為砷中毒相關(guān)疾病控制提供新的思路。

除以上食品有害物外,有研究發(fā)現(xiàn)攝入過(guò)量的銅離子和長(zhǎng)期高脂飲食也會(huì)導(dǎo)致肝臟組織細(xì)胞焦亡性損傷。SU等[32]發(fā)現(xiàn)雞肝細(xì)胞經(jīng)CuCl2處理后ROS含量、膜電位升高,焦亡細(xì)胞數(shù)目增多,說(shuō)明Cu2+通過(guò)刺激肉雞肝線(xiàn)粒體呼吸產(chǎn)生大量ROS,造成細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化,發(fā)生焦亡性損傷。張?jiān)：鉡33]研究結(jié)果表明,活性氧清除劑NAC、Caspase-1抑制劑Z-YVAD-FMK的加入均可降低雞肝細(xì)胞中Caspase-1、IL-1β、IL-18的蛋白表達(dá)量,表明Cu2+是通過(guò)ROS介導(dǎo)的Caspase-1途徑誘導(dǎo)雞肝細(xì)胞焦亡。此外,隨著人們生活水平不斷提高,高脂肪食物攝入量占飲食結(jié)構(gòu)的比例逐年升高。大量研究表明,高脂飲食是肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的主要誘因之一[34]。陳璐等[35]研究發(fā)現(xiàn)C57BL/6小鼠攝入高脂飲食后,肝組織中Caspase-1、NLRP3等蛋白表達(dá)量升高,同時(shí)使得下游炎癥因子IL-1β分泌變多,從而導(dǎo)致焦亡細(xì)胞增多,肝臟損傷加重,充分證實(shí)NLRP3-Caspase-1信號(hào)通路與焦亡的關(guān)聯(lián)性。

唐標(biāo)等[36]指出,降脂理肝湯能夠減輕高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝癥狀,其干預(yù)機(jī)制與抑制非經(jīng)典的細(xì)胞焦亡途徑有關(guān)。降脂理肝湯的干預(yù)能顯著降低Caspase-11的水平,較低的Caspase-11水平會(huì)影響GSDMD蛋白活化,進(jìn)而減輕非酒精性脂肪肝癥狀。同時(shí),吳柳等[37]利用下瘀血湯干預(yù)改善非酒精性脂肪性肝炎,其機(jī)理之一是降低NLRP3蛋白表達(dá)、下調(diào)NLRP3炎癥小體相關(guān)基因。因此可將細(xì)胞焦亡關(guān)鍵基因作為靶點(diǎn),研發(fā)干預(yù)和治療非酒精性脂肪肝/非酒精性脂肪性肝炎的相關(guān)保健食品和藥品。

4 食品有害物誘發(fā)免疫組織細(xì)胞焦亡的相關(guān)分子機(jī)制

免疫細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的主要組成部分,在防御病原體入侵、協(xié)調(diào)機(jī)體系統(tǒng)等方面有重要作用。當(dāng)機(jī)體細(xì)胞因外來(lái)病原微生物入侵可能發(fā)生焦亡性死亡時(shí),免疫細(xì)胞將會(huì)被招募用于清除病原物,以維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,從而緩解機(jī)體細(xì)胞的焦亡性損傷[38]。據(jù)報(bào)道,一些食品有害物也可通過(guò)誘發(fā)免疫組織細(xì)胞焦亡損害機(jī)體健康,如表2所示。

表2 食品有害物誘發(fā)細(xì)胞焦亡性損傷Table 2 Food hazards induce pyroptosis

4.1 晚期糖基化產(chǎn)物

晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)是葡萄糖或其他還原糖(如半乳糖和果糖)與氨基酸、核苷酸堿基或脂肪酸反應(yīng)形成糖基化分子時(shí)形成的一組不同的化合物[39]。體內(nèi)AGEs水平過(guò)高可導(dǎo)致疾病[40]。大量研究表明,AGEs通過(guò)與細(xì)胞表面受體結(jié)合或與機(jī)體蛋白質(zhì)交聯(lián),改變其結(jié)構(gòu)和功能,從而促進(jìn)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[41]。

晚期糖基化白蛋白(advanced glycated albumin,AGE-alb)是AGEs的代表物質(zhì)之一。張昭強(qiáng)等[42]使用AGE-alb預(yù)處理RAW264.7巨噬細(xì)胞,與空白組相比細(xì)胞活力降低,LDH釋放率升高、IL-1β和IL-18分泌增多,NLRP3蛋白表達(dá)量增加,Caspase-1活性增強(qiáng),充分證明AGE-alb成功誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞焦亡性損傷。為驗(yàn)證AGE-alb是否通過(guò)NLRP3-Caspase-1信號(hào)通路引起細(xì)胞焦亡,張昭強(qiáng)等[42]采用NLRP3特異性抑制劑MCC950作用RAW264.7巨噬細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCC950可以顯著抑制AGE-alb誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡,同時(shí)證實(shí)AGE-alb通過(guò)NLRP3-Caspase-1信號(hào)通路誘導(dǎo)免疫細(xì)胞焦亡性損傷。

4.2 棉酚

棉酚(gossypol,GOS)是從棉花的種子、根和莖中提取的天然產(chǎn)物[43]。GOS一方面因?yàn)槎喾N藥理學(xué)活性,在防御害蟲(chóng)和病原體方面發(fā)揮重要作用[44]。另一方面因其細(xì)胞毒性,可誘導(dǎo)山羊精原干細(xì)胞、小鼠生精細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡[45-46]。GOS作為一種具有毒性的多酚類(lèi)化合物,關(guān)于其是否對(duì)免疫細(xì)胞中炎癥小體和細(xì)胞焦亡產(chǎn)生影響等,目前尚未清楚。為此,林秋茹[47]以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞以及RAW 264.7細(xì)胞系為研究對(duì)象,進(jìn)行深入探究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GOS可以誘導(dǎo)經(jīng)LPS刺激產(chǎn)生的巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜破碎及Pro-IL-1β、Pro-Caspase-11的大量釋放,最終使其發(fā)生細(xì)胞焦亡;GOS也可以誘導(dǎo)缺乏ASC的RAW 264.7細(xì)胞發(fā)生焦亡,說(shuō)明GOS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞焦亡并不依賴(lài)于經(jīng)典的Caspase-1活化。雖然GOS可以致使大量Pro-IL-1β的產(chǎn)生,但僅能誘導(dǎo)低水平的成熟IL-1β的分泌。同時(shí),利用其他的經(jīng)典焦亡抑制劑并沒(méi)有能夠抑制GOS誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡,表明GOS可能是通過(guò)非經(jīng)典炎癥小體通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生焦亡性損傷。

4.3 鎘

大量研究顯示,攝入過(guò)量的鎘會(huì)導(dǎo)致免疫組織損傷,引發(fā)骨質(zhì)疏松癥、腎功能不全、糖尿病、癌癥等[48]疾病。血管內(nèi)皮細(xì)胞是鎘的重要靶細(xì)胞,鎘會(huì)通過(guò)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放多種炎性因子,產(chǎn)生一系列心血管疾病[49]。為研究鎘誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的機(jī)制,陳海燕[50]使用80 μmol/L CdCl2對(duì)HUVECs人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行處理,24 h后鎘處理組HUVECs人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Caspase-1活性增強(qiáng),LDH釋放率升高,細(xì)胞發(fā)生焦亡性損傷。另外分別使用Caspase-1抑制劑Z-YVAD-FMK、NLRP3 siRNA以及ROS和mt ROS特異性抑制劑NAC和Mito-TEMPO對(duì)HUVECs細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理,結(jié)果顯示均可以緩解細(xì)胞發(fā)生焦亡性損傷。因此鎘誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生焦亡的機(jī)制為：首先通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,產(chǎn)生大量ROS和mt ROS刺激活化NLRP3炎癥小體,從而發(fā)生Caspase-1的經(jīng)典焦亡途徑。

5 小結(jié)

細(xì)胞焦亡是一種不同于壞死、自噬、凋亡等的細(xì)胞死亡方式,它分為依賴(lài)Caspase-1的經(jīng)典焦亡途徑和依賴(lài)Caspase-4/5/11的非經(jīng)典焦亡途徑。食品有害物可通過(guò)誘導(dǎo)肝臟組織細(xì)胞和免疫組織細(xì)胞發(fā)生焦亡,損傷機(jī)體健康。全面深入研究細(xì)胞焦亡的分子機(jī)制,可以為食品有害物毒性控制提供新的思路。目前研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞焦亡的發(fā)生會(huì)引發(fā)各種炎癥反應(yīng),因此應(yīng)當(dāng)更加著眼于充分了解焦亡參與炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展的關(guān)系和機(jī)制,將有助于開(kāi)發(fā)相關(guān)靶向藥物,對(duì)臨床患者的康復(fù)治療具有重要意義。