UPLC-MS-MS法同時測定雞肉食品中37種獸藥殘留

黃華，謝文東，谷雨，孟照琦，孫元潔，杜洪淼，孫婭娜，康帥

(北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，北京，101300)

隨著人們對雞肉食品由需求型向質(zhì)量型的轉(zhuǎn)變，雞肉食品中的獸藥殘留已逐漸成為全世界關注的焦點。獸藥在防治動物疾病、提高生產(chǎn)效率、改善畜產(chǎn)品質(zhì)量等方面起著十分重要的作用。然而，由于養(yǎng)殖人員對科學知識的缺乏以及一味地追求經(jīng)濟利益，濫用獸藥現(xiàn)象在當前畜牧業(yè)中普遍存在。濫用獸藥極易造成雞肉食品中有害物質(zhì)的殘留，這不僅對人體健康造成直接危害，而且對養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和生態(tài)環(huán)境也造成極大危害。我國農(nóng)業(yè)部在2003年(265)號公告中明文規(guī)定，不得使用不符合《獸藥標簽和說明書管理辦法》規(guī)定的獸藥產(chǎn)品，不得使用《食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單》所列21類藥物及未經(jīng)農(nóng)業(yè)部批準的獸藥，不得使用進口國明令禁用的獸藥，畜禽產(chǎn)品中不得檢出禁用藥物。但事實上，養(yǎng)殖戶為了追求最大的經(jīng)濟效益，將禁用藥物當作添加劑使用的現(xiàn)象相當普遍，如飼料中添加鹽酸克侖特羅(瘦肉精)引起的豬肉中毒事件等。在養(yǎng)殖過程中，普遍存在長期使用藥物添加劑，隨意使用新或高效抗生素，大量使用醫(yī)用藥物以及重復使用幾種商品名不同但成分相同藥物的現(xiàn)象。所有這些因素都造成藥物在體內(nèi)過量積累，導致獸藥殘留。

不同藥物在化學性質(zhì)上有很大差別，現(xiàn)有的藥物殘留分析方法一般是按照化學結(jié)構(gòu)類似的原則，開發(fā)同種族藥物的檢測方法，同時針對多類藥物的檢測分析方法較少，而現(xiàn)有分析方法能同時分析的藥物種類較少，不能滿足當前獸藥種類不斷增加，分析通量不斷提高的需求。隨著超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜[1-6]技術的快速發(fā)展，雞肉食品中獸藥多殘留檢測范圍已逐步從單一類別發(fā)展為多種不同類別獸藥的同時定性與定量分析。

本文建立了一種全新的以QuEChERS為樣品前處理技術與超高效液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法(ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS-MS)[7-11]有機結(jié)合，快速測定雞肉食品中37種獸藥殘留的檢測方法，以期為雞肉食品中獸藥殘留的檢測與監(jiān)控提供依據(jù)。

1 實驗方法

1.1 儀器和試劑

UPLC-MS-MS檢測器質(zhì)譜聯(lián)用儀、DISQUETM萃取管(50 mL，內(nèi)含4 g MgSO4、1 g NaCl、1.5 g檸檬酸鈉)，美國Waters公司；3-18K型高速冷凍離心機，德國SIGMA公司；渦旋混合器，美國Thermo公司；OA-SYSTM型氮吹儀，美國Organomation公司；CQ25-12D型超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司；Milli-Q Academic 超純水系統(tǒng)，美國MilliPore公司；C18填料、N-丙基乙二胺(primary secondary amine，PSA)填料、石墨化碳黑(graphitized carbon black，GCB)，天津博納艾吉爾公司。

乙腈、甲醇，HPLC級，美國Fisher公司；甲酸、乙酸銨，HPLC級，德國CNW公司；正己烷、乙酸，分析純。

大環(huán)內(nèi)酯類標準品：鹽酸克林霉素(lindamycin,DA)、替米考星(tilmicosin，TM)；青霉素類標準品：青霉素V(penicillin V， PVC)、泰勒菌素(tylosin，TL)、氨芐西林(ampicilin，AMP)、雙氯青霉素(dicloxacillin，MDIC)、四環(huán)素(tetracydine，TE)、強力霉素(doxycydine， DOXY)、土霉素(oxytetracydine，OTC)；苯并咪唑類標準品：阿苯達唑砜(albendazone sulfone，ASF)、阿苯達唑氨基砜(albendazole-2-2-aminosulfone hydrochloride，AASF)；磺胺類標準品：磺胺地索辛(sulfadimethoxine，SDM)、磺胺噻唑(sulfathiazole，ST)、磺胺嘧啶(sulfadiazine，SDZ)、磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole，SMX)、磺胺氯噠嗪(sulfachloropyridazine，SCP)、磺胺對甲氧嘧啶(sufameter，SMT)、磺胺甲基嘧啶(sulfamerazine，SMR)、磺胺吡啶(sulfapyridine， SPD)、磺胺間甲氧嘧啶(sulfamonomethoxine，SMM)、磺胺甲二唑(sulfamethizol，SM)、磺胺甲氧噠嗪(sulfamethoxypyridazine，SMPD)、磺胺二甲基嘧啶(sulfadimidine，SDMD)、磺胺喹惡啉(sulfaquinoxaline、SQX)、磺胺二甲異惡唑(sufisoxazole，SSZ)；喹諾酮類標準品：二氟沙星(difloxacin，DIF)、奧比沙星(orbifloxacin，ORB)、司帕沙星(sparfloxacin，SPA)、沙拉沙星(sarafloxacin，SAR)、氟羅沙星(flerofloxacin，F(xiàn)LE)、氧氟沙星(ofloxacin，OFL)、恩諾沙星(enrofloxacin，ENR)、馬波沙星(3-pyriolidinol，MAR)、丹諾沙星(danofloxacin，DAN)、培氟沙星(pefloxacin，NOR)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin，CIP)、依諾沙星(enoxacin，ENO)，德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 標準工作液的配制

將各標準品用甲醇配制成1 μg/mL的標準儲備液，并根據(jù)需要用甲醇稀釋成適當質(zhì)量濃度的混合標準工作溶液，于棕色儲存瓶中保存。

1.3 UPLC-TQS條件

1.3.1 超高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm×2.1 mm×100 mm)；柱溫40 ℃；樣品室溫度10 ℃；進樣體積10 μL；流速0.3 mL/min；流動相：甲醇(A)和0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨水溶液(B)；梯度洗脫程序：0～14 min，10%A～95%A；14～17 min，95%A～95%A；17～18 min，95%A～10%A；18～20 min，10%A～95%A。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(electrospray ionization, ESI)：正離子模式；毛細管電壓3.3 kV；離子源溫度150 ℃；錐孔反吹氣流量150 L/h；脫溶劑氣溫度400 ℃；脫溶劑氣流量900 L/h；多反應監(jiān)測(multi-reaction monitoring mode，MRM)模式。定性分析時每種藥物選擇1個母離子和2個子離子，試樣中若目標物的色譜峰保留時間與標準品一致(偏差<±2.5%)，所選擇離子均出現(xiàn)，且離子相對豐度比與標準品中對應離子的相對豐度比一致，容許偏差滿足2002/657/EC 的要求，則判定為樣品中存在該待測獸藥，各藥物質(zhì)譜條件見表1。

1.4 樣品前處理

準確稱取雞肉組織試樣2.0 g，加入DISQUETM萃取管中，加入20 mLV(甲醇)∶V(乙腈)=2∶1混合液，渦旋充分混合，超聲提取10 min，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，移取上清液10 mL于離心管中，加入10 mL正己烷，渦旋振蕩混勻，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，棄除正己烷層，下層提取液氮氣流吹干，加入1 mLV(乙腈)∶V(乙酸銨)=1∶9混合液溶解殘渣，濾膜過濾至進樣瓶中，測定分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 UPLC-MS-MS條件的優(yōu)化

實驗發(fā)現(xiàn), 在流動相中加入體積分數(shù)0.1%甲酸來控制流動相的pH，加入揮發(fā)性電解質(zhì)乙酸銨可以在保持較好分離度的前提下獲得理想的色譜峰、減小加合峰、增大分子離子峰的峰強度。本文分別對比了0.1%甲酸乙酸銨-甲醇和0.1%甲酸乙酸銨-乙腈為流動相，發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸乙酸銨-乙腈為流動相目標物的響應值比0.1%甲酸乙酸銨-甲醇為流動相時低, 可能因為乙腈降低了目標化合物的離子化效率, 使其響應值亦隨之降低。

對50 μg/L的各藥物的單一標準溶液分別在ESI+和ESI-離子化模式下進行自動全掃描。實驗表明，所有目標分析物在ESI+電離方式下采用[M+H]+，各藥物的檢測離子信息見表1。

表1 37種藥物的部分質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS paramenters of 37 drugs

2.2 前處理條件的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化

動物組織中獸藥殘留常用的提取溶劑包括乙腈、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、緩沖溶液，或者有機溶劑添加一定比例的酸或堿等。選取總體回收率較差的四環(huán)素、青霉素V、阿苯達唑砜、培氟沙星4種化合物作為依據(jù)，樣品在加標量為5 μg/kg的情況下，以樣品加標回收率為指標，分別考察了甲醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷為提取溶劑對雞肉中4種獸藥的提取效率。

如圖1所示，使用甲醇、乙腈、二氯甲烷作為提取溶劑，獸藥的回收率普遍高于乙酸乙酯和正己烷；但二氯甲烷作為提取溶劑時，提取液中雜質(zhì)較多，故初步選定甲醇、乙腈作為提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑的回收率(n=6)Fig.1 Recovery of different extract solvent(n=6)

但由于獸藥種類不同，性質(zhì)各異，因此使用單一溶劑提取不能完全兼顧所有待測獸藥的回收率，為了兼顧多獸藥同時檢測的需要，進一步提高提取回收率，考察了不同比例的混合溶劑對獸藥的提取回收率?？紤]到37種藥物的快速篩查需要通用、快速、回收率優(yōu)化的前處理方法，考察前處理提取方法既能夠滿足提取回收率70%～120%的實驗要求，又能夠有效地凈化基質(zhì)中的干擾，選取總體回收率較差的四環(huán)素、青霉素V、阿苯達唑砜、培氟沙星4種化合物作為依據(jù)，樣品在相同加標量5 μg/kg的情況下，分別考察了甲醇∶乙腈和1%乙酸甲醇∶乙腈不同濃度比例下獸藥的提取回收率。結(jié)果如圖2所示。使用V(甲醇)∶V(乙腈)=2∶1混合液作為提取溶劑，獸藥的回收率較高，所以選定V(甲醇)∶V(乙腈)=2∶1的混合溶劑作為提取溶劑。

圖2 不同混合提取溶劑的回收率(n=6)Fig.2 Recovery of different compound extract solvent(n=6)

2.2.2 凈化條件的優(yōu)化

本實驗采用QuEChERS的提取方法, 根據(jù)雞肉食品的基質(zhì)特點，樣品中的脂類物質(zhì)會干擾目標化合物的檢測。而N-丙基乙二胺(primary secondary amine, PSA)通常用于去除提取液中的脂肪酸、有機酸、糖和酚類等, 還可吸附部分極性色素, 且在無水的條件下能發(fā)揮更好的效果；C18及GCB都具有良好的除脂能力, 因此選用PSA、C18和GCB作為凈化吸附劑?？疾炝薖SA、C18、GCB，均為50～100 mg這3種常用的吸附劑材料及起脫水作用的無水MgSO4(100～500 mg)對四環(huán)素、青霉素V、阿苯達唑砜、培氟沙星的吸附凈化作用，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同凈化條件的凈化效果(n=6)Fig.3 Clean-up effect of different clean-up methods(n=6)

雖然GCB具有一定的脂肪吸附能力，但同時對于目標化合物也有一定的吸附，導致回收率偏低，所以本文選用100 mg PSA、100 mg C18為凈化劑組合，對樣品基質(zhì)干擾最小且回收率最高，可以達到37種藥物較好的前處理提取凈化效果，目標化合物的回收率均在70%以上。

2.3 線性關系和檢出限

分別準確移取適量的37種獸藥混合標準工作溶液，添加到2.0 g空白雞肉中，按1.4的前處理方法，制得目標藥物含量為1、2、5、10、20、50 μg/kg的系列空白添加試樣，然后上機測定，以目標組分峰面積為縱坐標，相應的添加含量為橫坐標，繪制標準曲線。在1～50 μg/kg各組分峰面積與相應的添加含量呈線性關系，相關系數(shù)為0.984 1～0.999 4，結(jié)果見表2。

采用在空白基質(zhì)中添加目標組分的方法，依據(jù)特征離子色譜峰的信噪比(S/N)>3為檢出限(limit of determination, LOD)，S/N>10為定量限(limit of quantitation, LOQ)，得到37種藥物的LOD為0.5 μg/kg，LOQ為1 μg/kg。

2.4 回收率與精密度

取1、5、10、20 μg/kg的陽性添加試樣，按照1.4的步驟操作，每一個添加水平重復6次，計算回收率，以相對標準偏差(relative standard deviation, RSD)計算精密度。結(jié)果表明，陽性添加1、5、10、20 μg/kg平均回收率為71%～109%，RSD為1.7%～14.7%，結(jié)果滿足要求，見表2和電子增強出版附件(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.029328)。

表2 37種藥物線性回歸方程、相關系數(shù)及加標回收率(n=6)Table 2 Linear regression equation,correlation coefficient and adding standard recovery of 37 drugs(n=6)

續(xù)表2

3 結(jié)論

本文將在蔬菜水果農(nóng)藥殘留分析中采用的樣品處理技術QuEChERS引入到雞肉中獸藥多殘留的分析，通過優(yōu)化樣品預處理及色譜質(zhì)譜測定條件，建立了UPLC-MS-MS同時測定雞肉中37種獸藥的方法。該方法樣品前處理成本低廉、簡便快速、靈敏可靠，適合對雞肉中磺胺類、喹諾酮類、苯并咪唑類、四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類和青霉素類藥物殘留進行確證和定量測定。