?-聚賴氨酸對重要食源性致病菌的作用效果研究進展

趙昇，吳學(xué)妍，張碩，王君，黎京滔，吳瑜凡，申進玲，董慶利，王翔*

1(上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海，200093)2(華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院分析測試中心，上海，200237)3(上海海關(guān) 動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心，上海，200135)

據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，每年因食用受污染的食品而發(fā)生疾病的人數(shù)超過6億，這其中大多數(shù)是由食品中的致病菌引起[1]。我國2008—2015年的食品中毒調(diào)查結(jié)果顯示，62.0%的中毒事件是由致病菌引起的[2]，常見的食源性致病菌有沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌等。因此食品中致病菌的控制是食品安全研究關(guān)注的重要內(nèi)容[3]。

抗菌抑制劑是一類可以殺滅或者抑制細菌生長的物質(zhì)，既可以天然存在也可以人工合成。隨著消費者對較低限度加工和不含化學(xué)添加劑食品需求的增強，天然抗菌抑制劑因其無毒或低毒以及良好的抑菌效果而受到青睞[4]。?-聚賴氨酸(?-polylysine，?-PL)最早是由日本學(xué)者從白色鏈霉培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)并分離[5]，現(xiàn)在常通過發(fā)酵法、化學(xué)合成等方法進行工業(yè)生產(chǎn)。?-PL通過α-羧基和?-氨基之間的酰胺鍵連接、25～30個賴氨酸單體組成的多肽，現(xiàn)已公認至少需要10個賴氨酸殘基才可發(fā)揮抑菌作用，抑菌效果與賴氨酸殘基的數(shù)量成正比[6-7]。?-PL具有良好的熱穩(wěn)定性、水溶性、可食用性和生物降解性，是一種抑菌譜廣、穩(wěn)定性高和安全性強且應(yīng)用廣泛的抑菌劑[8-9]。

20世紀(jì)80年代?-PL在日本即被用作商用抑菌劑在牛肉、軟飲料、奶酪、沙拉調(diào)料、魚和土豆類等食品中廣泛應(yīng)用；2004年美國食品藥品監(jiān)督管理局將?-PL認為是一種安全的食品添加劑(GRAS編號：000135)；2014年我國也將?-PL批準(zhǔn)作為食品添加劑(GB 2760—2014)并對其作出了限量要求，焙烤食品中限量為0.15 g/kg，熟肉食品中限量為0.25 g/kg，果蔬汁類及其飲料中限量為0.2 g/L，同時也允許其在水產(chǎn)品、生鮮畜肉、乳及乳制品等其他種類食品中添加。

本文圍繞?-PL對不同食源性致病菌的抑菌效果，重點圍繞?-PL在實驗室培養(yǎng)基和食品基質(zhì)中單獨和聯(lián)合使用對致病菌控制效果，并闡述了?-PL對致病菌的抑菌機理，以期為?-PL在食品中合理高效的應(yīng)用提供參考。

1 ?-PL對重要的食源性致病菌控制效果

1.1 培養(yǎng)基中?-PL對致病菌的控制效果

?-PL對單增李斯特菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、致病性大腸桿菌等重要食源性致病菌都具有良好的抑菌效果[10]，其最低抑菌濃度(minimal inhibitory concerntration,MIC)大多低于100 μg/mL[11]。如表1所示，?-PL對致病菌的抑菌效果可通過細菌吸光度改變、抑菌圈大小、抑制菌落數(shù)目、存活率等方法和指標(biāo)判斷。

表1 培養(yǎng)基中?-PL對不同種致病菌的控制效果Table 1 Effect of ?-PL on the pathogens in culture medium

在培養(yǎng)基中，?-PL對重要食源性致病菌的控制效果因選用菌株和實驗條件不同而異。研究中?-PL工作濃度通常低于100 μg/mL，在此濃度下?-PL對重要食源性致病菌等都具有良好的抑菌效果。CHANG等[7]使用100 μg/mL ?-PL對大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌分別進行抑菌效果研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)48 h后其菌落數(shù)分別減少2.7、1.9和2.6 lg CFU/mL。?-PL的抑菌效果隨著其濃度的增加而增大，LI等[12]使用100 μg/mL ?-PL對大腸埃希氏菌進行抑菌實驗可獲得9.0 mm的抑菌圈，而使用200 μg/mL ?-PL抑菌圈擴大為10.0 mm。LIN等[13]對單增李斯特菌的研究也取得類似效果，100 μg/mL ?-PL處理4 h后，單增李斯特菌減少5.0 lg CFU/mL，而200 μg/mL處理減少6.0 lg CFU/mL。

通常情況下，革蘭氏陰性菌對?-PL的敏感性要高于革蘭氏陽性菌，這可能與細胞壁成分有關(guān)，革蘭氏陰性菌細胞壁表面的脂多糖層帶有大量負電荷，革蘭氏陽性菌細胞壁表面稀疏的磷壁酸帶有少量負電荷，因此革蘭氏陰性菌比陽性菌更容易吸附?-PL[18]。研究發(fā)現(xiàn)，在相同條件下?-PL對大腸埃希氏菌的控制效果優(yōu)于金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌[7,14]。然而也有觀點認為?-PL的抑菌效果可能不取決于細菌種類，而取決于細菌細胞的體積，細胞體積越大，細胞膜的比表面積越小，?-PL與細胞膜表面負電荷吸附數(shù)量比越低，從而敏感性越小[21]。MUTO[22]比較了大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、釀酒酵母等9種不同大小細胞對?-PL的敏感性，得出細胞體積與其對?-PL敏感性負相關(guān)。

1.2 食品基質(zhì)中?-PL對致病菌的控制效果

?-PL在不同的食品基質(zhì)中對致病性大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌等重要致病菌都具有較好的抑菌效果(表2)。GEORNARAS等[23]分別研究了200 μg/mL ?-PL在脫脂牛奶、全脂牛奶、牛肉、臘腸、米飯、蔬菜中對大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌和單增李斯特菌的作用效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6 d后致病菌減少了3.5～5.0 lg CFU/mL(g)，在不同食品中的作用效果稍有差異。在食品基質(zhì)中?-PL使用濃度越大，其對致病菌的抑制效果越好。李唐飛等[24]用50 μg/mL ?-PL在魚糜中可以保持12 d菌落總數(shù)保持不變，而100 μg/mL濃度下菌落總數(shù)下降了0.5 lg CFU/g。此外，在食品基質(zhì)中添加?-PL，可以使致病菌菌落數(shù)長時間不再增漲。LI等[25]研究發(fā)現(xiàn)200 μg/mL ?-PL在牛肉中可以保持12 d菌落數(shù)保持不變。該結(jié)果與孫鏈等[26]研究結(jié)果一致，他們將250 μg/mL ?-PL應(yīng)用于冷凍牛后腿肉中，可以保持55 d菌落數(shù)保持不變。

表2 食品基質(zhì)中?-PL對不同種致病菌的控制效果Table 2 Effects of ?-PL on foodborne pathogens in food matrix

相同工作濃度下，?-PL在食品基質(zhì)中的抑菌弱于培養(yǎng)基中的效果。對同一株大腸埃希氏菌研究發(fā)現(xiàn)，在TSB-YE培養(yǎng)基中48 h細菌數(shù)降低了2.7 lg CFU/mL，而在烤牛肉中7 d僅降低了1.9 lg CFU/g。單增李斯特菌在TSB-YE培養(yǎng)基中48 h降低了2.6 lg CFU/mL，而在烤牛肉中7 d僅降低了0.6 lg CFU/g。同樣地，鼠傷寒沙門氏菌在TSB-YE培養(yǎng)基中48 h降低了1.9 lg CFU/mL，而在烤牛肉中7 d僅降低了0.7 lg CFU/g[7]。

在食品基質(zhì)中，?-PL可能會與食品中某些食品大分子相互作用、被蛋白酶水解導(dǎo)致?-PL的抑菌效果降低。AASEN等[27]發(fā)現(xiàn)在生雞肉和魚中乳酸鏈球菌素(Nisin)可以快速吸附在食品的蛋白質(zhì)中，隨著蛋白質(zhì)水解，導(dǎo)致其抑菌活性逐漸喪失。因此，相比于在培養(yǎng)基中的理想環(huán)境，?-PL在食品基質(zhì)中抑菌效果有所降低。

2 ?-PL與其他抑菌劑聯(lián)合使用對重要的致病菌抑制效果

盡管單獨使用?-PL對重要食源性致病菌具有良好的抑菌效果，但是通過?-PL與其他抑菌劑聯(lián)合使用形成協(xié)同抑菌效應(yīng)，可以增強對致病菌的抑制效果，維持?-PL對致病菌的抑制穩(wěn)定期，還可以在取得較好抑制效果前提下減少?-PL使用劑量。協(xié)同抑菌效應(yīng)是指多個抑菌物質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用的效果高于各抑菌物質(zhì)單獨使用時的作用效果[28]。通過協(xié)同抑菌效應(yīng)能夠有效提高抑菌劑抑菌活性，降低抑菌劑使用量，提高食品安全性等[29-30]。

研究中常將?-PL與抗菌肽、精油、氨基酸等抑菌劑聯(lián)合使用(表3)。?-PL與抗菌肽聯(lián)合使用可以增強對致病菌的抑制效果。寧亞維等[31]研究發(fā)現(xiàn)，單獨使用3.9 μg/mL ?-PL、2.5 AU/mL抗菌肽brevilaterin時在24 h后菌落總數(shù)分別為8.0和7.0 lg CFU/mL，而在同濃度下將兩者聯(lián)合使用時24 h時菌落總數(shù)為5.0 lg CFU/mL。LIU等[32]通過分級抑菌濃度(fractional inhibitory concentration,FIC)指數(shù)大小來判斷2種抑菌劑聯(lián)合使用是否產(chǎn)生協(xié)同抑菌效應(yīng)，F(xiàn)IC<0.5則說明2種抑菌劑具有協(xié)同效應(yīng)，并且FIC值越小則表明協(xié)同效果越高。?-PL與Nisin聯(lián)合使用FIC為0.3，表明?-PL與Nisin對金黃色葡萄球菌具有協(xié)同抑菌效應(yīng)[33]。?-PL與精油、氨基酸聯(lián)合使用也可以產(chǎn)生協(xié)同抑菌效應(yīng)，?-PL與迷迭香、八角茴香精油、牛至精油聯(lián)合使用對致病菌的菌落總數(shù)比單獨使用都低約1.0 lg CFU/g。?-PL與香芹酚精油對金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌聯(lián)合使用FIC值分別為0.5和0.4。?-PL和甘氨酸在牛奶和豬后腿肉中聯(lián)合使用，與對照組相比都明顯減少了其菌落數(shù)。

表3 ?-PL與其他抑菌劑對不同食源性致病菌的控制效果Table 3 Combination effects of ?-PL and other bacteriostatic agents on different foodborne pathogens

在單獨使用?-PL取得相同抑制效果情況下，?-PL與其他抑菌劑聯(lián)合使用，可以減少?-PL使用劑量，同時還可以維持對致病菌的抑制時間。?-PL的抑菌作用隨著時間的延長而增加，在抑制初期，?-PL抑菌效果較低，無法很快地對致病菌進行抑制作用，而Nisin對致病菌的抑制作用是隨著時間的延長而降低。LIU等[32]通過?-PL和Nisin對枯草芽孢桿菌進行抑制發(fā)現(xiàn)，在24 h內(nèi)1 MIC的?-PL抗菌活性從0.4 U逐漸升至0.8 U，而1 MIC的Nisin抗菌活性從0.8 U逐漸降至0.4 U，但是兩者聯(lián)合使用可以在1/4 MIC下將抗菌活性穩(wěn)定在0.8 U左右。LIU等[39]通過1 MIC的?-PL和Nisin對糞腸球菌聯(lián)合作用發(fā)現(xiàn)，單獨使用?-PL或Nisin的抑菌效果與1/8 MIC的?-PL和Nisin聯(lián)合使用在22 h抑菌效果相同，菌落總數(shù)為5.5 lg CFU/g。因此，通過?-PL和Nisin聯(lián)合作用，可以更好的對致病菌進行抑制。

3 ?-PL的抑菌機理

由于細菌的外膜通常帶有一定的負電荷，而?-PL是一種帶正電荷的抗菌肽[40]，其可以通過靜電作用與細菌的細胞壁相結(jié)合。?-PL破壞細胞壁后，進而與細胞膜表面負電荷結(jié)合，使得細胞膜裂解，引起細胞內(nèi)的物質(zhì)、能量和信息傳遞中斷，最終導(dǎo)致細胞死亡[41]。這種作用機制使得細菌難以產(chǎn)生耐藥性，從而顯著提高了抑菌效率。?-PL主要作用于細菌細胞壁和細胞膜，同時對細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、DNA、ATP等也有影響作用，圍繞細胞成分或結(jié)構(gòu)可通過多種方法進行抑菌機理的研究(表4)。

表4 ?-PL作用對細胞的影響及檢測方法Table 4 Effect of ?-PL on cell and its detection method

3.1 ?-PL對細菌細胞壁的影響

根據(jù)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌細胞壁表面帶負電荷數(shù)量的不同，?-PL對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抑菌機制模型可分成桶板模型和氈毯模型[18,43]，如圖1所示。

革蘭氏陽性菌細胞壁主要成分是肽聚糖，帶負電荷的磷壁酸分散排布在肽聚糖層中，這使得革蘭氏陽性菌細胞壁表面所攜帶的負電荷分布較為分散。?-PL通過靜電吸附在磷壁酸后，形成中間空洞，隨后?-PL通過疏水區(qū)域接觸細胞膜并發(fā)生作用，親水區(qū)域則組成可以跨膜的離子通道，整個結(jié)構(gòu)如桶板狀形成離子通道，使得?-PL通過細胞壁接觸細胞膜。

革蘭氏陰性菌細胞壁外膜主要成分是脂多糖層，帶負電荷的脂多糖層可使?-PL大面積地覆蓋在細胞壁表面，形如毯狀對細菌表面結(jié)合。?-PL是以擴散的方式破壞其完整性，沒有在細胞膜上形成離子通道。當(dāng)?-PL的濃度達到一定程度后，細胞膜上會出現(xiàn)瞬時的孔洞，可使得?-PL通過細胞壁接觸細胞膜。

細胞壁與細胞膜之間存在一種堿性磷酸酶(alkaline phosphate,AKP)，這種酶被細胞壁包被在內(nèi)不能在細菌外部測出其活性。當(dāng)?-PL破壞細菌細胞壁后，該堿性磷酸酶會從細胞壁破裂處滲透出來，可以通過測量該酶的活性變化來判斷細胞壁破損程度[42]。藍蔚青等[44]通過檢測腐生葡萄球菌AKP的活力，對照組AKP活力為1.4 U/L，?-PL作用后AKP活力為2.2 U/L，結(jié)果表明該腐生葡萄球菌細胞壁被?-PL所破壞。

3.2 ?-PL對細菌細胞膜的影響

革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌細胞膜成分的完整性是細菌存活的關(guān)鍵決定因素，也是細菌細胞內(nèi)完成的各種重要生理活動的主要因素[45]。

?-PL通過靜電作用吸附在細菌細胞膜表面，可以破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，引起細胞膜裂解，此時細胞膜流動性降低，細胞內(nèi)外滲透壓失衡，使得細胞內(nèi)K+、Na+等陽離子大量外泄，造成細胞培養(yǎng)液電導(dǎo)率升高[46]，這些物質(zhì)的外泄，可以作為細胞膜破損的標(biāo)注。LIN等[13]對?-PL處理后的單增李斯特菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率進行測量發(fā)現(xiàn)，2 MIC組電導(dǎo)率在5 h時由0.2 mS/cm上升到0.3 mS/cm，其細菌表面ζ電位在5 h時由-32 mV上升到-10 mV。LI等[12]對?-PL處理后的大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率進行測量，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，3 h后處理組的電導(dǎo)率增加了92%。隨著時間的推移，其電荷流動速度也會逐漸減慢，表明細胞膜被完全破壞。

4 總結(jié)

?-PL作為一種優(yōu)良的生物抑菌劑，因其穩(wěn)定性、安全性和良好的抑菌能力，現(xiàn)在已被中國、美國和日本等國家批準(zhǔn)為食品添加劑，并廣泛應(yīng)用于肉制品、乳制品、果蔬制品及水產(chǎn)品等。在食品中添加?-PL不僅可以有效抑制食品中致病菌的生長并延長食品貨架期，而且不影響食品風(fēng)味。同時，?-PL可以與其他抑菌劑聯(lián)合使用，以增強?-PL的抑菌能力，提高食品的安全性。

在?-PL研究和應(yīng)用領(lǐng)域的工作，可以從以下方面進一步開展：?-PL對細菌的抑制作用機制研究并不完善，?-PL是否會改變細胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)等結(jié)構(gòu)，進而影響細胞生長，在更深層次對細胞進行抑制仍需研究；?-PL處理對細菌細胞環(huán)境抗性、毒力等其他生物學(xué)特征產(chǎn)生的影響；?-PL與其他抑菌劑聯(lián)合處理研究較多，未來可通過柵欄技術(shù)將?-PL與其他新型致病菌控制方式結(jié)合進行研究。