提高乳桿菌屬冷凍干燥存活率研究進(jìn)展

寇佳祥，喬建軍,，朱宏吉*，吳昊，張悅

1(天津大學(xué) 化工學(xué)院，天津，300072)2(天津大學(xué) 浙江紹興研究院，浙江 紹興，312300)

2014年6月10日，國(guó)際益生菌和益生元科學(xué)協(xié)會(huì)在NatureReviewsGastroenterology&Hepatology雜志上發(fā)表文章，系統(tǒng)介紹了益生菌的定義和范圍[1]。文章肯定了FAO/WHO 在2001年對(duì)益生菌的定義，即當(dāng)食用足夠數(shù)量時(shí)，對(duì)所在宿主產(chǎn)生健康益處的活性微生物。對(duì)益生菌如何更好地發(fā)揮益生作用以及如何更好地被應(yīng)用于食品、保健品當(dāng)中，正在成為營(yíng)養(yǎng)科學(xué)、合成生物學(xué)、食品科學(xué)等學(xué)科深度融合及學(xué)科交叉發(fā)展的熱點(diǎn)領(lǐng)域。乳桿菌是目前開發(fā)研究較為深入的一類重要的益生菌[2]，是人類腸道中重要的生理菌，在食品開發(fā)方面有廣闊的市場(chǎng)空間，但菌株在產(chǎn)品開發(fā)及應(yīng)用過(guò)程中容易受到外界溫度、壓力、含氧量等不利因素的影響，導(dǎo)致乳桿菌存活率降低，影響乳桿菌的生理活性[3]，這是影響乳桿菌在食品方面更深層應(yīng)用的一大障礙。通過(guò)冷凍干燥技術(shù)能夠獲得具有長(zhǎng)期保持細(xì)胞活力和穩(wěn)定性的乳桿菌菌粉，并且對(duì)細(xì)菌損傷較小，但在凍干過(guò)程中細(xì)胞仍然會(huì)受到胞外冰晶的形成和由此導(dǎo)致的滲透壓的增加對(duì)細(xì)胞的損害，因此研究人員針對(duì)如何增強(qiáng)乳桿菌的抗凍能力，進(jìn)而提高乳桿菌的冷凍干燥存活率做了許多研究。如乳桿菌菌粉制備工藝流程(圖1)所示，培養(yǎng)基優(yōu)化、脅迫預(yù)處理、添加凍干保護(hù)劑、優(yōu)化預(yù)冷凍條件這4方面是影響菌株凍干存活率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，本文從這4方面總結(jié)了提高乳桿菌凍干存活率的最新研究進(jìn)展。

圖1 乳桿菌菌粉制備工藝流程圖Fig.1 Process flow chart for preparation of Lactobacillus powder

1 優(yōu)化培養(yǎng)基組成提高乳桿菌的凍干存活率

1.1 優(yōu)化培養(yǎng)基增強(qiáng)乳桿菌生理活性

乳桿菌的體外培養(yǎng)離不開培養(yǎng)基，培養(yǎng)基是通過(guò)添加各種適合微生物生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)得到的混合物，包括碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、金屬離子和水等[4]。常規(guī)的MRS培養(yǎng)基能夠滿足絕大多數(shù)乳桿菌的正常培養(yǎng)，但在冷凍干燥前需要培養(yǎng)出生理活性更強(qiáng)的乳桿菌，才能更好地抵抗真空冷凍干燥過(guò)程對(duì)菌株的損傷。通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基中各成分的比例，可以更好地保護(hù)乳桿菌中參與能量代謝的關(guān)鍵酶，如β-半乳糖苷酶、Na+K+-ATP酶和乳酸脫氫酶的活力，從而增強(qiáng)菌株的生理活性[5]。優(yōu)化培養(yǎng)基比例可使菌株生理活性增強(qiáng)，生長(zhǎng)能力就越強(qiáng)，通過(guò)高密度培養(yǎng)就會(huì)產(chǎn)生越多菌株，李娜等[6]通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了MRS培養(yǎng)基組成及比例，蔗糖43 g/L、玉米漿干粉60 g/L、Na2HPO4-檸檬酸0.12 mol/L、MgSO4·7H2O 0.20 g/L、MnSO4·H2O 0.10 g/L、吐溫80 1 m L/L時(shí)，植物乳桿菌ZJ316活菌數(shù)比常規(guī)培養(yǎng)基提高了3.44倍。CHOI等[7]通過(guò)優(yōu)化MRS培養(yǎng)基比例，提高了植物乳桿菌200665的生長(zhǎng)能力，在相同時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的菌種量是常規(guī)培養(yǎng)基的1.58倍。此外，研究人員還開發(fā)了新型培養(yǎng)基，LIEWSKA等[8]開發(fā)了以小麥、玉米、大麥和黑麥粉為原料的培養(yǎng)基，使鼠李糖乳桿菌有更好的生理活性，其最大生長(zhǎng)速率比在常規(guī)MRS培養(yǎng)基中提高了1倍。乳桿菌能夠利用的碳源較多，除葡萄糖外，還有蔗糖、半乳糖、乳糖、果糖、甘露糖、水蘇糖、低聚果糖、低聚木糖等。由于乳桿菌基因的特異性及多樣性，不同的乳桿菌對(duì)培養(yǎng)基中碳源利用的偏好性不同，針對(duì)不同的乳桿菌可以添加或替換不同碳源以達(dá)到增強(qiáng)菌株活性的目的。如CARVALHO等[9]比較了葡萄糖、果糖、乳糖、甘露糖4種糖分別作為碳源時(shí)保加利亞乳桿菌的生理活性和抗凍性能，結(jié)果表明以甘露糖為碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)出的菌株生長(zhǎng)量最大，同時(shí)菌株具有最好的抗凍效果。以蔗糖代替葡萄糖為碳源得到優(yōu)化培養(yǎng)基用以培養(yǎng)植物乳桿菌LIP-1，凍干存活率也會(huì)有很大提升[10]。除了對(duì)常規(guī)培養(yǎng)基進(jìn)行碳源的添加或替換，在培養(yǎng)基中添加一些生長(zhǎng)因子也能提高乳桿菌的生理活性，使乳桿菌更好地適應(yīng)凍干過(guò)程中的不利環(huán)境，這些生長(zhǎng)因子包括無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、天然產(chǎn)物等。如在MRS培養(yǎng)基中添加了0.5 mmol/L的Ca2+，不但使植物乳桿菌LIP-1的凍干存活率從55.15%提高到76.67%，并且常溫儲(chǔ)存8周后，比未添加組活菌數(shù)提高了13.65倍[10]。在常規(guī)培養(yǎng)基中額外添加氨基酸能夠提高保加利亞乳桿菌L2的抗冷凍干燥能力，添加了L-半胱氨酸的培養(yǎng)基得到了活性更高的菌株[11]。同樣在MRS液體培養(yǎng)基中添加了10%的番茄汁作為嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)因子，也增強(qiáng)了菌株活性，提高了菌株的抗凍能力。此外，一些天然分子添加到培養(yǎng)基中也會(huì)增強(qiáng)菌株的抗凍能力。CHEN等[12]將NaCl、甜菜堿、谷氨酸鈉、山梨醇、甘露醇、甘露糖6種天然分子分別添加到MRS培養(yǎng)基中，研究添加天然分子對(duì)德氏乳桿菌生長(zhǎng)活性及凍干存活率的影響，發(fā)現(xiàn)NaCl、山梨醇對(duì)菌株的凍干存活率有顯著影響，當(dāng)二者的濃度分別為0.6%、0.15%時(shí)，保加利亞乳桿菌的凍干存活率最高，分別為42.7%和45.4%。以上研究可以看出，針對(duì)不同的乳桿菌開發(fā)出對(duì)應(yīng)的優(yōu)化培養(yǎng)基能夠得到活性更強(qiáng)的菌株，進(jìn)而能提高菌株應(yīng)對(duì)冷凍干燥不利條件的能力。

1.2 優(yōu)化培養(yǎng)基促進(jìn)乳桿菌生物膜的形成

生物膜可以維持細(xì)胞之間的化學(xué)物質(zhì)交換，調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)，并具有一定的機(jī)械穩(wěn)定性，因此通過(guò)培養(yǎng)基優(yōu)化促進(jìn)乳桿菌形成更多生物膜有利于增強(qiáng)菌株抵抗不利環(huán)境的能力，提高菌株的冷凍干燥存活率。研究表明，若培養(yǎng)基中無(wú)碳源，則乳桿菌很難形成生物膜，當(dāng)培養(yǎng)基中碳源濃度過(guò)高，也會(huì)抑制生物膜的形成[13]。因此，針對(duì)不同乳桿菌選擇合適的碳源濃度能促進(jìn)生物膜的形成。另外一些金屬離子對(duì)生物膜的形成也有影響，Mn2+、Fe3+、Mg2+和Na+等金屬離子能促進(jìn)生物膜形成，這是由于部分金屬離子能直接促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá)，有學(xué)者將生物膜測(cè)定與轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中K+顯著促進(jìn)植物乳桿菌LIP-1中的luxs/ai-2群體感應(yīng)系統(tǒng)中l(wèi)uxs基因的表達(dá)，促進(jìn)了AI-2信號(hào)分子的合成，上調(diào)了生物膜形成的關(guān)鍵基因cysE基因的表達(dá)，從而促進(jìn)了生物膜的形成，增強(qiáng)菌株的抗凍性能[14]。若加入D-半乳糖抑制劑則會(huì)抑制luxS和cysE基因的表達(dá)，減少生物膜的形成，降低凍干性能。而Cu2+、Al3+、Pb+和Zn+等金屬離子對(duì)生物膜的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，不利于菌株抵抗外界環(huán)境[15-16]，導(dǎo)致乳桿菌存活率降低，因此在培養(yǎng)基中選擇性地添加一些金屬離子能夠促進(jìn)生物膜的形成，增強(qiáng)菌株的抗凍能力，進(jìn)而提高凍干存活率。

1.3 優(yōu)化培養(yǎng)基改變細(xì)胞膜不飽和脂肪酸比例

在冷凍干燥過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)外形成的冰晶會(huì)刺破細(xì)胞膜，影響細(xì)胞膜的完整性；細(xì)胞由于脫水導(dǎo)致流動(dòng)性降低，代謝功能受到影響，降低了冷凍干燥存活率。脂肪酸是影響細(xì)胞膜流動(dòng)性的關(guān)鍵因素，不飽和脂肪酸的含量決定了細(xì)胞膜的黏度和厚度，不飽和脂肪酸所占比例越高，細(xì)胞膜的流動(dòng)性越好，細(xì)胞抵抗冷凍能力就越強(qiáng)。因此研究人員通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基組分等方式提高細(xì)胞膜不飽和脂肪酸比例。通過(guò)調(diào)節(jié)pH、添加適宜濃度的油酸、無(wú)機(jī)鹽離子、吐溫80等能夠提高不飽和脂肪酸的比例。若將MRS培養(yǎng)基初始pH從7.4下調(diào)至6.8，則植物乳桿菌LIP-1的凍干存活率由72.43%增加至81.76%[17]。研究發(fā)現(xiàn)pH為6.8的培養(yǎng)基能更好地提高細(xì)胞膜不飽和脂肪酸的含量、更好地保持代謝關(guān)鍵酶活性、更好地維持細(xì)胞膜的完整性，減少菌株的凍干損傷，從而提升菌株的抗冷凍干燥性能。錢志浩等[18]通過(guò)氣相質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加2 mL/L的吐溫80能顯著提高細(xì)胞膜不飽和脂肪酸比例，使鼠李糖乳桿菌FJND和短乳桿菌173-1-2的凍干存活率有了顯著提升。在培養(yǎng)基中添加適宜濃度的K+能促進(jìn)基因簇中trkA基因和lysR型轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)，而lysR的上調(diào)促進(jìn)了acc和fab家族基因上調(diào)。acc和fab基因的上調(diào)增加了植物乳桿菌LIP-1細(xì)胞膜不飽和脂肪酸C18:ln9c、C18:2n6c、C20:3n6和C20:4n6的含量，提高了細(xì)胞膜流動(dòng)性，增強(qiáng)了植物乳桿菌LIP-1抗凍干性[19]。在培養(yǎng)基中添加0.001%的油酸同樣能夠提高細(xì)胞膜不飽和脂肪酸比例，提高植物乳桿菌冷凍干燥后的存活率，并且不同的乳桿菌具有不同的最佳油酸濃度[20]。

總之，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基組成能夠增強(qiáng)菌株的代謝能力，提高菌株生理活性，促進(jìn)菌株生物膜的形成增強(qiáng)自我保護(hù)能力，提高細(xì)胞膜不飽和脂肪酸含量增強(qiáng)細(xì)胞膜流動(dòng)性并保護(hù)關(guān)鍵酶活性，進(jìn)而提高乳桿菌的冷凍干燥存活率。

2 脅迫預(yù)處理增強(qiáng)乳桿菌抗凍能力

脅迫預(yù)處理是指在凍干前將菌液轉(zhuǎn)移至特定環(huán)境中一段時(shí)間，使菌株在該環(huán)境影響下增強(qiáng)抗凍能力，進(jìn)而提高菌株的凍干存活率。具體的脅迫預(yù)處理方式包括冷脅迫[21]、熱脅迫[22]、酸脅迫[23]等。

2.1 冷脅迫預(yù)處理增強(qiáng)乳桿菌抗凍能力

冷脅迫預(yù)處理是將菌株放置于低于其最適生長(zhǎng)溫度的環(huán)境一定時(shí)間，以增強(qiáng)其抗凍能力。冷脅迫對(duì)菌株抗凍能力的提升體現(xiàn)在維持細(xì)胞膜流動(dòng)性、刺激冷應(yīng)激蛋白的表達(dá)2個(gè)方面。研究表明冷凍環(huán)境下細(xì)胞膜的流動(dòng)性會(huì)受到影響，冷脅迫能改變?nèi)闂U菌細(xì)胞膜脂肪酸的組成，提高其抗凍能力。不飽和脂肪酸所占比例越高，細(xì)胞膜流動(dòng)性越好，抗凍能力也相應(yīng)越強(qiáng)。王曉萌等[24]采用冷脅迫方法對(duì)嗜酸乳桿菌 ATCC 4356進(jìn)行處理，8 ℃冷脅迫處理15 h，冷凍干燥后的存活率提升至96.64%，比未冷脅迫組提高了17.65%。乳桿菌為適應(yīng)寒冷環(huán)境會(huì)上調(diào)冷應(yīng)激蛋白的表達(dá)。冷應(yīng)激蛋白(cold shock proteins，CSPs)是在冷刺激條件下產(chǎn)生的一系列抗凍蛋白質(zhì)，分子質(zhì)量約為7 ku，能使菌株更好地適應(yīng)低溫環(huán)境和增強(qiáng)抗凍能力。李夢(mèng)洋等[25]利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究了冷脅迫處理對(duì)保加利亞乳桿菌LM1冷應(yīng)激蛋白表達(dá)的影響，冷脅迫條件為20 ℃環(huán)境中靜置2 h，該處理能使菌株的cspA基因的mRNA拷貝數(shù)增加3.34倍左右，由此可以推測(cè)CSPs的表達(dá)量有所增加。EROGLU等[26]發(fā)現(xiàn)微生物菌體內(nèi)的CSPs在低溫條件下，其蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，保持了與底物的結(jié)合能力，仍具有較高的催化活性，提高了細(xì)胞的抗凍干能力，同時(shí)CSPs能保護(hù)細(xì)胞膜上相關(guān)酶，防止因酶變性而損害細(xì)胞[27]。以上研究均表明在乳桿菌冷凍干燥前進(jìn)行冷脅迫預(yù)處理能夠增強(qiáng)其凍干存活率，并且不同的乳桿菌最適預(yù)冷凍溫度有差異。

2.2 熱脅迫預(yù)處理增強(qiáng)乳桿菌抗凍能力

熱脅迫預(yù)處理是指將乳桿菌放置在高于其最適生長(zhǎng)溫度的環(huán)境中一定時(shí)間。經(jīng)過(guò)熱脅迫與處理的乳桿菌抵抗不利環(huán)境能力增強(qiáng)，對(duì)冷凍干燥不利條件的抵抗能力也有一定的增強(qiáng)。研究顯示，熱脅迫處理使細(xì)菌細(xì)胞在冷凍干燥后能夠更快地恢復(fù)生長(zhǎng)和產(chǎn)酸[28]。另外熱脅迫能促進(jìn)熱休克蛋白的表達(dá)，這是細(xì)胞為適應(yīng)不利熱環(huán)境選擇性上調(diào)表達(dá)的一類蛋白(Hsps)，包括伴侶蛋白(DnaK和GroEL)和輔因子(GOES)。熱休克蛋白能夠促進(jìn)正確的蛋白質(zhì)折疊，并幫助恢復(fù)變性蛋白質(zhì)和新生多肽的結(jié)構(gòu)-功能，保持菌株的代謝功能更為穩(wěn)定[29]。ZHEN等[30]以45 ℃條件熱休克處理嗜酸乳桿菌 ATCC 4356 30 min，其凍干成活率由39.1%提高到56.3%。除了凍干存活率有所提升，菌株的糖代謝和能量代謝能力也有一定程度的增強(qiáng)。熱脅迫處理后，菌株的胞內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)化率提高了24.04%，胞外多糖的產(chǎn)量增加，半乳糖的產(chǎn)量從17%增加到26%，Na+-K+-ATPase活性顯著升高，這些變化共同提高了細(xì)菌細(xì)胞在凍干環(huán)境中的活力和存活率。嗜酸乳桿菌通過(guò)熱脅迫處理也能提高凍干存活率，當(dāng)脅迫處理?xiàng)l件為46 ℃溫度下熱脅迫處理30 min，凍干存活率為56.77%，比對(duì)照組存活率提高了50.66%[31]。以45 ℃熱脅迫處理嗜酸乳桿菌ATCC 4356 30 min并結(jié)合凍干保護(hù)劑，菌株的存活率達(dá)到92.8%[32]。總之，熱脅迫預(yù)處理對(duì)菌株的積極作用體現(xiàn)在促進(jìn)熱休克蛋白表達(dá)、維持細(xì)胞的正常能量代謝，維持細(xì)胞在不利環(huán)境中的活力，進(jìn)而增強(qiáng)其抗凍能力，提高冷凍干燥存活率。

2.3 酸脅迫預(yù)處理增強(qiáng)乳桿菌抗凍能力

酸脅迫預(yù)處理是指將菌株放置于低于其最適生長(zhǎng)pH的環(huán)境一定時(shí)間，以增強(qiáng)其抗凍能力。不同的乳桿菌有不同的最適酸脅迫條件。低pH環(huán)境對(duì)菌株抗凍能力的增強(qiáng)主要是通過(guò)調(diào)節(jié)其代謝途徑使菌株更加適應(yīng)冷凍條件。酸脅迫對(duì)菌株代謝途徑影響最大的是糖酵解途徑和脂肪酸代謝途徑。研究人員通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，一方面酸脅迫促進(jìn)了糖酵解途徑中丙酮酸向乳酸的轉(zhuǎn)化，在酸脅迫下，乳酸脫氫酶基因表達(dá)上調(diào)，加速了糖酵解，為菌株生長(zhǎng)提供了更多的能量，菌株可以利用這些能量來(lái)提高對(duì)惡劣環(huán)境的適應(yīng)能力[33]。另一方面，酸脅迫促進(jìn)了ACC家族基因、Fab家族基因和丙酮酸脫氫酶基因表達(dá)上調(diào)，ACC家族基因和Fab家族基因的表達(dá)促進(jìn)了脂肪酸碳鏈的延伸，增加了碳鏈上的不飽和雙鍵，提高了不飽和脂肪酸的相對(duì)含量，而丙酮酸脫氫酶基因表達(dá)上調(diào)能促使丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，進(jìn)而影響了細(xì)胞膜脂肪酸的代謝和合成[34]。由此可見，經(jīng)過(guò)酸脅迫預(yù)處理乳桿菌細(xì)胞膜不飽和脂肪酸的比例更高，使菌株細(xì)胞膜有更好的流動(dòng)性，細(xì)胞膜完整性更高，因此具有更高的凍干存活率。

目前除了單一條件的脅迫預(yù)處理，也有將多種脅迫預(yù)處理方式交互使用的研究，并且取得了良好的效果。如楊婕等[35]研究發(fā)現(xiàn)酸-冷交互脅迫對(duì)發(fā)酵乳桿菌ATM的凍干存活率有很大提升，存活率達(dá)到87.19%。交互脅迫預(yù)處理對(duì)于不同的脅迫條件有更為嚴(yán)格的要求，因此需要更加深入的研究。

3 添加凍干保護(hù)劑降低乳桿菌冷凍干燥損傷

3.1 凍干保護(hù)劑分類

冷凍干燥技術(shù)被認(rèn)為是最為溫和的脫水技術(shù)，廣泛應(yīng)用于各類益生菌菌粉的制備。但在凍干過(guò)程中，由于低溫、干燥、高滲等多重不利因素影響，菌體細(xì)胞膜易受到環(huán)境中及胞內(nèi)水分子形成的不規(guī)則冰晶的破壞，代謝能力下降導(dǎo)致菌株受到不可逆的損傷，因此需要在冷凍干燥之前加入保護(hù)劑以保持凍干過(guò)程中菌株的穩(wěn)定性，提高菌株的存活率，維持細(xì)胞內(nèi)部關(guān)鍵酶活性。保護(hù)劑的種類很多，按照滲透性可以分為滲透類、半滲透類和不滲透類保護(hù)劑。如圖2所示，滲透類保護(hù)劑指保護(hù)劑能夠透過(guò)細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，調(diào)節(jié)胞內(nèi)胞外滲透壓平衡。甘油是經(jīng)典的滲透類保護(hù)劑，能夠增強(qiáng)細(xì)胞膜的流動(dòng)性，抑制細(xì)胞過(guò)度脫水，冰與水結(jié)合，抑制冰晶的形成，從而達(dá)到保護(hù)菌株的效果。半滲透類保護(hù)劑指保護(hù)劑能透過(guò)細(xì)胞壁但無(wú)法透過(guò)細(xì)胞膜，一般包括小分子糖如海藻糖[36]、甘露糖[37]、棉籽糖[38]、蔗糖[39]等，小分子糖含有的游離羥基能夠與蛋白質(zhì)極性基團(tuán)和細(xì)胞膜上磷脂結(jié)合形成氫鍵，為細(xì)胞提供機(jī)械保護(hù)。另外這類保護(hù)劑能夠誘導(dǎo)細(xì)菌質(zhì)壁分離，集中在細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間阻止冰晶的生長(zhǎng)。不滲透類保護(hù)劑指保護(hù)劑不能進(jìn)入細(xì)胞壁及細(xì)胞膜，在細(xì)胞的外側(cè)為細(xì)菌提供保護(hù)，包括乳清蛋白[40]、脫脂乳[41]等大分子。這類保護(hù)劑可以吸附在細(xì)菌壁外表面形成保護(hù)殼[42]，為菌株提供一個(gè)相對(duì)封閉的環(huán)境，阻止細(xì)胞與冰晶的接觸并能減少與氧氣的接觸，從而減少菌株損傷。

圖2 凍干保護(hù)劑的分類Fig.2 Classification of lyophilized protective agents

3.2 凍干保護(hù)劑對(duì)乳桿菌的保護(hù)

由于不同類型保護(hù)劑的保護(hù)機(jī)制不同，單一類型的凍干保護(hù)劑往往不能達(dá)到很好的保護(hù)效果，因此研究人員通常將多種類型的保護(hù)劑進(jìn)行復(fù)配從而得到復(fù)合凍干保護(hù)劑，從多個(gè)方面對(duì)菌株進(jìn)行保護(hù)。復(fù)合凍干保護(hù)劑的開發(fā)一般通過(guò)正交試驗(yàn)或響應(yīng)面法，將不同類型的保護(hù)劑進(jìn)行組合，以菌株的凍干存活率為響應(yīng)值，通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)出最佳復(fù)合凍干保護(hù)劑配方并加以驗(yàn)證，最終得到保護(hù)效果最好的凍干保護(hù)劑。表1總結(jié)了近年來(lái)針對(duì)不同的乳桿菌開發(fā)的凍干保護(hù)劑。由表1可以看出，凍干保護(hù)劑的種類較多，添加了復(fù)合凍干保護(hù)劑的乳桿菌凍干存活率都在80%以上。

4 優(yōu)化預(yù)冷凍條件降低乳桿菌冷凍干燥損傷

4.1 預(yù)冷凍溫度對(duì)乳桿菌冷凍干燥存活率的影響

合適的預(yù)冷凍溫度是冷凍干燥技術(shù)的重要一環(huán)，若預(yù)冷凍溫度不足夠低，則樣品將無(wú)法完全冷凍，真空升華過(guò)程中融化并且膨脹發(fā)泡，影響最終的菌粉狀態(tài)。若預(yù)冷凍溫度過(guò)低，不僅會(huì)增加能耗浪費(fèi)資源，而且會(huì)加重菌體損傷，降低菌株的凍干存活率，因此預(yù)冷凍溫度對(duì)菌株的凍干存活率有重要影響。如表1所示針對(duì)不同的菌株和保護(hù)劑，研究人員采用不同的預(yù)冷凍溫度最大程度降低對(duì)菌株的損傷。不同屬的乳桿菌有不同的最適預(yù)冷凍溫度，如鼠李糖乳桿菌Lr-1的最適預(yù)冷凍溫度為-20 ℃，植物乳桿菌SC1的最適預(yù)冷凍溫度為-70 ℃。同屬的乳桿菌在不同條件時(shí)最適預(yù)冷凍溫度也有所差異。WANG等[52]的研究表明，當(dāng)使用山梨醇為保護(hù)劑時(shí)，植物乳桿菌AR113、AR307和WCFS1的最佳預(yù)冷凍溫度分別為-196、-40和-20 ℃，當(dāng)使用海藻糖為保護(hù)劑時(shí)，植物乳桿菌AR113、AR307和WCFS1的最佳預(yù)冷凍溫度分別為-20、-60和-60 ℃，可見最佳預(yù)冷凍溫度的選擇與保護(hù)劑種類和菌株的特異性有關(guān)。

表1 不同乳桿菌對(duì)應(yīng)的凍干保護(hù)劑Table 1 Lyophilized protective agents corresponding to different Lactobacillus

4.2 降溫速率對(duì)乳桿菌冷凍干燥率的影響

降溫速率是影響菌株在預(yù)冷凍過(guò)程中保持活性的關(guān)鍵因素。如圖3所示，在預(yù)冷凍階段，合理控制降溫速率能夠減少細(xì)胞冷凍損傷[53]，A表示降溫速率過(guò)慢，細(xì)胞會(huì)由于過(guò)度脫水而收縮，細(xì)胞內(nèi)部溶質(zhì)集中，過(guò)度濃縮，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活，進(jìn)而引起細(xì)胞死亡；C表示降溫速率過(guò)快，胞外環(huán)境以及胞內(nèi)水分子容易形成大量細(xì)小的無(wú)規(guī)則冰晶，容易刺破細(xì)胞對(duì)菌體造成嚴(yán)重?fù)p傷；B表示最佳降溫速率，在最佳降溫速率條件下不會(huì)出現(xiàn)溶質(zhì)效應(yīng)和胞內(nèi)結(jié)冰，降溫速率與細(xì)胞內(nèi)部水分的滲透率相適應(yīng)，能最大程度降低細(xì)胞損傷。不同乳桿菌的最佳降溫速率不同，植物乳桿菌ST-3在降溫速率為-1 ℃/min條件下得到最高凍干存活率，干酪乳桿菌LC2 W在-10 ℃/min條件下凍干存活率最高[54]。目前針對(duì)乳桿菌冷凍干燥過(guò)程中降溫速率對(duì)存活率的影響研究有限，因此設(shè)計(jì)合理的降溫速率進(jìn)行梯度降溫還有很大的研究空間。

圖3 不同降溫速率對(duì)細(xì)菌存活的影響(修改自RAJU等[53])Fig.3 Effects of different cooling rates on bacterial survival

5 展望

近年來(lái)，對(duì)于如何將乳桿菌更好地應(yīng)用于產(chǎn)品開發(fā)成為食品學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。生產(chǎn)出具有高活菌數(shù)并且能夠很好耐受胃液、腸液、膽鹽環(huán)境等不利條件的乳桿菌菌粉是研究人員的目標(biāo)。目前針對(duì)增強(qiáng)乳桿菌抗凍性能，提高乳桿菌冷凍干燥存活率的研究仍在不斷探索當(dāng)中，針對(duì)特定的菌株確定特定的培養(yǎng)及優(yōu)化、脅迫預(yù)處理、凍干保護(hù)劑和預(yù)冷凍條件的研究較多，但對(duì)不同乳桿菌具有普適性保護(hù)效果的凍干保護(hù)劑及保護(hù)條件研究較少。對(duì)于既能起到凍干保護(hù)作用，又能促進(jìn)菌株生長(zhǎng)發(fā)育的新型益生元類凍干保護(hù)劑也在不斷開發(fā)當(dāng)中，這對(duì)提高乳桿菌冷凍干燥存活率及后續(xù)乳桿菌在腸道中的生長(zhǎng)定植有著重要意義，同時(shí)也對(duì)人類健康發(fā)展有著重要的意義。