牦牛酥油乳脂肪球膜蛋白分離純化和蛋白組鑒定及功能分析

談婷，羅毅皓，孫萬成

(青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧，810016)

牦牛酥油主要以牦牛乳為原料加工而成，其脂肪含量約為87.77%，蛋白質(zhì)含量僅為1.98%[1]。乳脂肪球膜(milk fat globule membrane, MFGM)具有三層膜結(jié)構(gòu)[2]，乳脂球表面是一層厚10～20 nm的薄膜[3]。MFGM蛋白在MFGM中分布不對稱，含量為奶牛MFGM的25%～60%，是乳中蛋白質(zhì)總量的1%～2%[4]。MFGM蛋白主要組成有黏蛋白1(mucin1, MUC1)、嗜乳脂蛋白黃嘌呤氧化還原酶(xanthine oxidoreductase, XOR)、乳脂球表皮生長因子8、組織糖蛋白高碘酸薛夫6/7、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白(CD36)、脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid binding protein, FABP)和脂肪細(xì)胞分化相關(guān)蛋白(adipocyte differentiation related proteins, ADRP或ADPH)等[5]。

目前國內(nèi)外對乳中蛋白質(zhì)分離純化的研究有很多。采用DEAE-52離子交換層析和SephadexG-100凝膠層析可分離純化驢乳乳清中蛋白質(zhì)[6]。通過鈉離子磷酸鹽緩沖溶液和蒸餾水，結(jié)合聚乙二醇辛基苯基醚溶液分離得到乳中MFGM蛋白[7]。用Tris-HCl緩沖液及DEAE SepharoseTMFast Flow離子交換柱從牛奶酪蛋白膠束中分離純化β-酪蛋白和κ-酪蛋白[8]。利用樹脂及SephadexG-1 50 層析分離純化出牛奶中XDH/XO[9-10]。NGUYEN等[11]采用非標(biāo)記定量液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法技術(shù)對水牛乳和牛乳MFGM蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較，篩選出220個水牛乳MFGM蛋白質(zhì)和234個牛乳MFGM蛋白質(zhì)。李墨翰等[12]通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究驢初乳和驢常乳差異蛋白組，在驢初乳和驢常乳中分別鑒定到216和215種MFGM蛋白。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用在人初乳MFGM蛋白中鑒定出1 076種蛋白，在牛初乳MFGM蛋白中鑒定出682種蛋白[13]。

目前國內(nèi)外對MFGM蛋白質(zhì)的研究多以乳汁為原料，研究其蛋白質(zhì)組成和功能特性，對酥油中MFGM蛋白的研究鮮有報道。在青藏高原上，酥油多為牧民家庭手工制作，方法較為多樣，可以將牛奶加熱熬煮，上層為酥油(粗酥油)，下層為乳清和奶渣；或者可以將牛乳靜置發(fā)酵成全脂酸乳，對酸乳進(jìn)行上下捶打直到出現(xiàn)脂肪球，加熱熬煮浮出酥油[14-15]。酥油制作時將牦牛乳中大部分乳清排除，以酥油為原料提取MFGM蛋白可以在一定程度上減少乳清蛋白對提取結(jié)果的干擾，為此本論文利用牦牛酥油提取其MFGM蛋白，并進(jìn)行純化，再利用液質(zhì)聯(lián)用對純化前后蛋白進(jìn)行鑒定，將鑒定后的結(jié)果通過基因本體(Gene Ontology, GO)功能注釋以及KEGG場景進(jìn)行分析，對MFGM蛋白組成和潛在功能進(jìn)一步挖掘，為后期深入研究酥油MFGM蛋白提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酥油，青海省河南蒙古族自治縣牧民家。

Real Band蛋白預(yù)染Marker、3kDa超濾管、costar 96孔板，上海生工生物工程股份有限公司；溴酚藍(lán)，上海廣諾化學(xué)科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)R-250、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，福州飛凈生物科技有限公司；甘氨酸、SDS、Tris、曲拉通X-100，北京索萊寶科技有限公司；福林酚、牛血清白蛋白V(bovine serum albumin,BSA)、Na2CO3、CuSO4、酒石酸鈉、NaH2PO4、Na2HPO4、NaOH、KCl、KH2PO4、NaCl、蔗糖，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Q Exactive Plus液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；AKTA pure 25蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)、DEAE-Sepharose FF(DEAE瓊脂糖凝膠)，美國GE公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell凝膠垂直電泳系統(tǒng)、GelDoc XR System凝膠成像系統(tǒng)，美國伯樂公司；5424臺式高速離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；ESJ110-413電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；HH-6水浴鍋，常州市金壇友聯(lián)儀器研究所；PHS-3C 型pH計，上海佑科儀器儀表有限公司；UV-1780紫外可見分光光度計，島津儀器(蘇州)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 牦牛酥油MFGM蛋白分離純化及組分分析

1.3.1.1 牦牛酥油MFGM蛋白提取

參照文獻(xiàn)[7]的方法，略有修改。用pH為7.4的鈉離子磷酸鹽緩沖溶液和蒸餾水對牦牛酥油中乳脂肪粗提物洗滌，加入體積分?jǐn)?shù)為3.4% 的聚乙二醇辛基苯基醚溶液和2.6%的鈉離子磷酸鹽緩沖溶液溶解MFGM上的脂質(zhì)而得到MFGM蛋白。

1.3.1.2 MFGM蛋白含量測定

用福林酚法(Lowry法)測定蛋白質(zhì)含量。紫外可見雙光束分光光度計在 500 nm 下比色測定，以 BSA 為標(biāo)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]。

1.3.1.3 牦牛酥油MFGM蛋白分離純化

利用AKTA pure 25M蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)階躍梯度法洗脫。將MFGM蛋白用PBS稀釋成2 mg/mL備用，用PBS平衡層析柱10個柱體積，取樣品溶液500 μL上樣，用PBS清洗陰離子交換柱，再用洗脫液進(jìn)行洗脫，不同濃度NaCl洗脫液占比為30%、50%、80%，收集峰值處的溶液，放于離心管標(biāo)記貯藏[17]。

1.3.1.4 階躍梯度洗脫法提取MFGM蛋白FABP 3正交實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以FABP 3得率為指標(biāo)，通過L16(44)正交試驗，考察PBS的pH、洗脫液濃度、洗脫流速、洗脫體積對FABP 3得率的影響，確定FABP 3最優(yōu)純化工藝。

1.3.1.5 SDS-PAGE

本研究通過SDS-PAGE根據(jù)分子質(zhì)量大小對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，用5% 的濃縮膠和8% 的分離膠制作底膠，采用Tris-甘氨酸-SDS 為電泳緩沖液，分離膠采用25 mA電流，濃縮膠提高電流至35 mA。結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)R-250 染色1～2 h，再用脫色液脫色直至底膠清晰，采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)和image.lab軟件以獲得最優(yōu)圖像并拍照分析。

1.3.1.6 質(zhì)譜檢測及數(shù)據(jù)分析

質(zhì)譜分析由邁維代謝公司完成。質(zhì)譜分析使用Thermo公司的Q Exactive Plus液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)進(jìn)行。樣品通過納升流速的液相UltiMate 3000 RSLCnano系統(tǒng)進(jìn)行分離。肽段樣品經(jīng)過上樣緩沖液溶解，富集到C18捕獲柱(3 μm, 120 ?， 100 μm×20 mm)，再經(jīng)分析柱(2 μm, 120 ?, 75 μm×150 mm)分離。利用2個流動相(流動相A:3% DMSO, 0.1%甲酸, 97% H2O和流動相B:3% DMSO, 0.1%甲酸, 97% ACN)建立分析梯度。液相的流速設(shè)置為300 nL/min。質(zhì)譜DDA模式分析時，每個掃描循環(huán)中包含一個MS全掃描，以及隨后的15個MS/MS掃描。HCD碰撞能量28；四級桿的篩選窗口1.6 Da；離子重復(fù)采集的動態(tài)排除時間35 s。

1.4 計算公式

MFGM蛋白得率按公式(1)計算：

(1)

式中：YMFGM，牦牛酥油MFGM蛋白得率，%；mMFGM，提取的MFGM蛋白凍干粉質(zhì)量，g；m，原料酥油質(zhì)量，g。

MFGM蛋白質(zhì)含量按公式(2)計算：

(2)

式中：WMFGM，牦牛酥油MFGM蛋白含量，%；C1，福林酚測得蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；C0，MFGM蛋白粗品質(zhì)量濃度，mg/mL。

AKTA pure 25M系統(tǒng)配有UV檢測器，在洗脫過程中會形成紫外吸收曲線和紫外吸收峰。FABP 3含量按公式(3)計算：

(3)

如公式(4)(5)(6)所示，由朗伯-比爾定律可得：

(4)

CMFGM=0.1 g/50 mL=2 mg/mL

(5)

(6)

式中：YFABP 3，F(xiàn)ABP 3得率，%；CFABP 3，所收集組分中FABP 3的質(zhì)量濃度，mg/mL；A，組分平均紫外吸收，AU；S，紫外峰面積，由ATKA pure 25M系統(tǒng)自動積分算出，mL×mAU；V1，所收集組分的體積，mL；V2，上樣量0.5 mL；d，UV紫外流通池長度，cm，根據(jù)AKTA pure 25M系統(tǒng)說明書，d=0.2 cm；Ext.coef，在使用波長下蛋白的消光系數(shù)。

經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫查詢FABP 3(序列號：E5G7E7)，再經(jīng)過ExPASy工具輸入該蛋白氨基酸序列算出FABP 3在280 nm下的消光系數(shù)為0.946 [L/(g·cm)]。

將公式(1)(2)(3)(4)整理得到公式(7)(8)：

(7)

(8)

式中：C總，F(xiàn)ABP 3在牦牛酥油中的質(zhì)量濃度，mg/mL；V酥油，酥油融化的體積，mL；mMFGM，酥油粗提MFGM蛋白的總質(zhì)量，mg。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SPSS 26.0進(jìn)行方差分析；Q Exactive Plus產(chǎn)生的質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過MaxQuant (V1.6.2.10)進(jìn)行檢索，采用的數(shù)據(jù)庫檢索算法是MaxLFQ。檢索使用的數(shù)據(jù)庫是Uniprot中Bos的蛋白質(zhì)組參考數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛酥油MFGM蛋白分離純化及組分分析

2.1.1 牦牛酥油MFGM蛋白含量

將MFGM蛋白用蒸餾水溶解成2 mg/mL溶液后，用Lowry法測定蛋白質(zhì)含量，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.001 4x+0.005 4,R2=0.993 2。根據(jù)公式(2)計算MFGM蛋白含量為22.28%。蛋白含量較低，表明MFGM蛋白提取后仍殘留一些MFGM其他成分如磷脂、鞘磷脂、甘油三酸酯、膽甾醇及鹽類[18]。

2.1.2 階躍梯度洗脫法提取MFGM蛋白FABP 3正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，為綜合考慮各因素對牦牛酥油MFGM蛋白FABP 3得率的影響，進(jìn)行正交試驗確定最佳的純化工藝條件，正交試驗因素水平見表1，正交試驗結(jié)果見表2。

表1 正交試驗因素水平表L16(44)Table 1 Orthogonal experiment factors and levels L16 (44)

表2 正交試驗結(jié)果表Table 2 Results of orthogonal test

對正交試驗結(jié)果進(jìn)行極差分析，如表3所示。各因素對牦牛酥油MFGM蛋白中FABP 3的提取效果影響次序為：RD>RA>RC>RB，即洗脫體積對牦牛酥油MFGM蛋白中FABP 3的提取效果影響最大，再依次是緩沖液pH、洗脫速度和洗脫液濃度。FABP 3的最優(yōu)提取工藝組合為A2B1C3D2，即洗脫體積為50 mL，緩沖液pH為7.4，洗脫速度為1.6 mL/min，洗脫液濃度為0.50 mol/L時，該條件下，F(xiàn)ABP 3的得率達(dá)83.19%。

表3 FABP 3提取正交試驗方差分析表Table 3 FABP 3 extraction of orthogonal test variance analysis table

F檢驗結(jié)果表明，洗脫體積、緩沖液pH、洗脫液濃度、洗脫速度對MFGM蛋白FABP 3提取得率影響差異顯著(P<0.05)。

2.1.3 FABP 3得率及濃度計算

利用AKTA pure 25M蛋白純化系統(tǒng)，結(jié)合陰離子交換柱對牦牛酥油MFGM蛋白FABP 3洗脫純化。陰離子交換柱交換基質(zhì)由帶正電荷的樹脂或纖維素組成，其交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，這類蛋白質(zhì)被吸附在柱子上，通過提高洗脫液中鹽濃度等措施將吸附在柱子上的蛋白洗脫下來[19]。FABP 3等電點是6.73，將MFGM蛋白用pH 7.0的PBS溶解，使目標(biāo)蛋白帶負(fù)電荷上樣后被吸附在柱子上，洗脫時進(jìn)一步調(diào)整洗脫A液PBS的pH提高洗脫得率。洗脫條件選擇和AKTA pure 25M操作方法在孫琳[17]研究基礎(chǔ)上略有改動。

如圖1利用AKTA pure 25M系統(tǒng)進(jìn)行純化操作。待柱平衡后，將V2體積的MFGM溶液注入AKTA pure 25M系統(tǒng)進(jìn)行洗脫，洗脫過程中出現(xiàn)3個紫外吸收峰，第1個紫外峰為流穿峰，所收集的組分為雜蛋白[17]；經(jīng)SDS-PAGE證實，第2個紫外吸收峰為目的蛋白形成的洗脫峰，即所收集的組分是FABP 3；第2個紫外吸收峰的面積為S，代入公式(7)和公式(8)，得到FABP 3得率和酥油中FABP 3的濃度。

圖1 階躍梯度洗脫層析圖Fig.1 Step gradient elution chromatogram

2.1.4 粗提MFGM蛋白質(zhì)和純化MFGM蛋白組分分析

2.1.4.1 SDS-PAGE法分析MFGM蛋白質(zhì)組分

取等量的粗提MFGM蛋白和純化后的MFGM蛋白，用分離膠濃度為8%、濃縮膠濃度為5%的變性聚丙烯凝膠電泳分析樣品中的蛋白質(zhì)組成，結(jié)果如圖2所示。

圖2 MFGM蛋白經(jīng)SDS-PAGE結(jié)果圖Fig.2 SDS-PAGE results of MFGM protein

本研究粗提酥油MFGM蛋白鑒定出7個電泳條帶，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)研究結(jié)果[20-22]，和蛋白marker條帶根據(jù)分子質(zhì)量大小比對，從上至下，第1個條帶顯示蛋白可能是RAB11家族相互作用蛋白5(RAB11FIP 5)、肌球蛋白IG(JAK1)、受體蛋白酪氨酸激酶(MYO1G)和酪氨酸蛋白激酶(EPHB 3)。其中MFGM蛋白主要有FABP 3、鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白G(i) α-1(GNAI 1)、蛋白質(zhì)NDRG2和脂肪細(xì)胞相關(guān)蛋白(ADPH)4種。粗提和純化蛋白均在13 kDa處都形成了較明顯的區(qū)代(圖2)，與FABP 3理論分子質(zhì)量一致。粗提MFGM蛋白質(zhì)中還含有部分未除去的酪蛋白、乳球蛋白和乳白蛋白。MFGM蛋白經(jīng)AKTA pure 25M純化后，去除了部分酪蛋白和乳清蛋白以及脂肪細(xì)胞相關(guān)蛋白(ADPH)和分子質(zhì)量位于100 k～140 kDa的高分子質(zhì)量蛋白，顯著提高了牦牛酥油FABP 3的純度。

2.1.4.2 LC-MS/MS分析MFGM蛋白組分

樣品經(jīng)質(zhì)譜檢測共鑒定到以FABP 3、脂蛋白脂肪酶、α-S1-酪蛋白、肌動蛋白，細(xì)胞質(zhì) 1、L-乳酸脫氫酶、β-乳球蛋白、乳轉(zhuǎn)鐵蛋白等為主的31種蛋白。純化后蛋白主要是FABP 3。

根據(jù)表4，粗提和純化MFGM蛋白主要是 α-S1-酪蛋白和FABP 3，經(jīng)iBAQ處理，粗提MFGM蛋白FABP 3含量為20.005%，純化MFGM蛋白FABP 3含量為13.542%。

表4 iBAQ定量主要蛋白結(jié)果展示Table 4 Demonstration of iBAQ quantitative analysis of major proteins

2.1.4.3 粗提MFGM蛋白和純化MFGM蛋白熱圖分析

熱圖分析結(jié)果如圖3所示，純化后脂肪球膜蛋白種類變少，說明在純化過程中去除了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等17種蛋白，純化前后高豐度蛋白主要是α-S1-酪蛋白和FABP 3，其中FABP 3是MFGM蛋白中一種膜蛋白。

圖3 粗提和純化MFGM蛋白熱圖分析圖Fig.3 Cluster analysis diagram of crude and purified MFGM protein注：紅色表示蛋白表達(dá)量高；藍(lán)色表示蛋白表達(dá)量低；每列表示一次重復(fù)試驗，每行表示一個蛋白質(zhì)

李瑋軒[20]在驢初乳和常乳中鑒定到61種差異性表達(dá)MFGM蛋白。本實驗中粗提MFGM蛋白和純化MFGM蛋白差異蛋白種類見表5，其中列出了主要的17種差異蛋白，少于驢初乳和驢常乳差異性表達(dá)蛋白種類。

表5 粗提和純化MFGM蛋白中的差異蛋白Table 5 Differential expressed protein of crude and purified MFGM protein

2.1.4.4 粗提MFGM蛋白和純化MFGM蛋白GO注釋

如圖4所示，從生物過程、細(xì)胞組分、分子功能分析所有31種粗提MFGM蛋白和純化MFGM蛋白，用GO功能注釋分析對所有蛋白進(jìn)行注釋，分子功能富集分析中有22種蛋白主要富集在結(jié)合作用；28種蛋白在細(xì)胞解剖學(xué)實體組分內(nèi)高度富集；有22種蛋白主要參與生物調(diào)節(jié)過程。

圖4 粗提和純化MFGM蛋白差異蛋白GO功能注釋圖Fig.4 Functional annotation of GO terms crude and purified MFGM protein

如圖5所示，對粗提MFGM蛋白和純化MFGM蛋白20種差異蛋白進(jìn)行GO注釋，參與的主要生物過程有生物調(diào)節(jié)、刺激反應(yīng)、多細(xì)胞組織化過程、代謝過程等16類。在分子功能富集分析中，差異MFGM蛋白主要富集在結(jié)合作用、催化活性、分子功能調(diào)節(jié)器、轉(zhuǎn)運(yùn)等6類分子功能中。此外MFGM蛋白主要在細(xì)胞、細(xì)胞解剖學(xué)實體、細(xì)胞內(nèi)等5類細(xì)胞組分內(nèi)高度富集。以往研究表明MFGM蛋白可以通過上調(diào)Akt和mTOR蛋白激酶的表達(dá)，顯著促進(jìn)細(xì)胞生長，抑制C2C12細(xì)胞凋亡[23]。酥油MFGM蛋白GO注釋分析可為MFGM蛋白生物學(xué)具體作用機(jī)制研究提供參考。

a-生物學(xué)過程(BP);b-細(xì)胞組成(CC);c-分子功能(MF)圖5 粗提和純化MFGM蛋白差異蛋白GO注釋Fig.5 GO annotation of the differential protein between crude and purified MFGM protein

對篩選的差異蛋白進(jìn)行了3個層級3個類別的GO注釋。生物學(xué)過程(biological process，BP)，細(xì)胞組成(cellular component，CC)與分子功能(molecular function，MF)的二級GO注釋結(jié)果如圖5所示。

2.1.4.5 粗提MFGM蛋白和純化MFGM蛋白差異蛋白KEGG通路分析

20種差異蛋白參與的前15條通路如圖6所示，參與的代謝途徑分別是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工、軍團(tuán)桿菌病、抗原的處理和表達(dá)、弓形蟲病、吞噬體、程序性細(xì)胞壞死、代謝信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、麻疹、長壽調(diào)節(jié)通路-多個物種、甲型H1N1流感、雌激素信號通路、愛潑斯坦-巴爾二氏病毒感染、內(nèi)噬作用、阿爾茲海默癥、糖異生作用。其中差異蛋白參與最多的通路是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工，F(xiàn)ABP 3參與與免疫相關(guān)的過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)信號通路[24]。

圖6 粗提和純化MFGM蛋白差異蛋白KEGG通路分析圖Fig.6 KEGG pathway analysis diagram of crude and purified MFGM protein

2.1.4.6 參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的加工相關(guān)的蛋白及KEGG通路分析

由表6可知，通過在線KEGG通路檢索，牦牛酥油MFGM差異蛋白中有3種蛋白參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的加工。

表6 參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的加工KEGG通路的蛋白Table 6 Proteins involved in the processing of the KEGG pathway for proteins in the ER

由圖7可知，紅色標(biāo)注代謝物上調(diào)，藍(lán)色標(biāo)注代謝物下調(diào)。3種蛋白質(zhì)在該通路中調(diào)控代謝物甘露糖寡糖a-1,3-葡萄糖苷酶上調(diào)進(jìn)一步誘導(dǎo)凝集素的形成和去糖基化，進(jìn)而調(diào)控蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的加工，進(jìn)一步運(yùn)輸至高爾基體中對蛋白質(zhì)加工；通過下調(diào)分子伴侶HtpG和熱休克70 kDa蛋白1/2/6/8，進(jìn)而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解過程。

圖7 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的加工Fig.7 Protein processing in endoplasmic reticulum

2.1.4.7 參與PPAR信號通路相關(guān)的蛋白及KEGG通路分析

KEGG代謝通路分析得出，牦牛酥油MFGM差異蛋白參與PPAR信號通路的蛋白質(zhì)是FABP 3。

通過在線KEGG通路檢索，牦牛酥油MFGM蛋白FABP 3參與內(nèi)分泌系統(tǒng)——PPAR信號通路。PPAR是由脂肪酸及其衍生物激活的核激素受體[25]。PPAR 有3種亞型(PPARα、β/δ和γ)，它們分別編碼在一個單獨的基因中，并結(jié)合脂肪酸和類花生酸[26]，參與脂質(zhì)代謝和炎癥的控制，并在所有主要細(xì)胞類型的動脈粥樣硬化病變中表達(dá)[27]。PPARα通過調(diào)節(jié)肝臟和骨骼肌中脂質(zhì)代謝蛋白的基因表達(dá)，在清除循環(huán)或細(xì)胞脂質(zhì)中發(fā)揮作用，控制許多參與細(xì)胞脂肪酸進(jìn)入和氧化的基因的表達(dá)，在正常和病變心臟能量代謝基因調(diào)控中發(fā)揮作用[28]。PPARβ/δ參與脂質(zhì)氧化和細(xì)胞增殖。推測FABP可以通過PPARγ促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化以提高血糖攝取[29]。

由圖8可知，F(xiàn)ABP的表達(dá)誘導(dǎo)肝臟骨骼肌、骨骼肌脂肪細(xì)胞、脂肪相關(guān)代謝物表達(dá)，進(jìn)而使PPAR在3種亞型中均被不飽和脂肪酸和9-順式-視黃酸激活后通過識別特異的核苷酸序列并與之結(jié)合來啟動和調(diào)控FABP 3和FABP 4的表達(dá)。推測FABP 3可能參與其中與脂肪酸降解、膽汁酸合成、甘油磷脂代謝相關(guān)的類脂物代謝作用，F(xiàn)ABP 4參與脂肪細(xì)胞分化，但并未通過該數(shù)據(jù)庫查找到具體作用位點。為進(jìn)一步探究脂肪酸結(jié)合蛋白3的作用位置和參與途徑提供參考。

圖8 PPAR信號通路Fig.8 PPAR signaling pathway

同時FABP的表達(dá)誘導(dǎo)了3種亞型PPAR信號通路的代謝，在a-亞型通路中，PPARα被不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸、類十二烷酸、纖維化藥物、非甾體抗炎藥和9-順式-視黃酸激活；PPARβ/δ被不飽和脂肪酸和9-順式-視黃酸激活；PPARγ被不飽和脂肪酸、類十二烷酸、噻唑烷衍生物、非甾體抗炎藥和9-順式-視黃酸激活；3種亞型被激活后通過識別特異的核苷酸序列并與之結(jié)合來啟動和調(diào)控線粒體解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein 1, UCP 1)的表達(dá)。UCP 1是來自小鼠棕色脂肪的線粒體解偶聯(lián)蛋白，UCP 1是唯一在褐色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)中表達(dá)的解偶聯(lián)蛋白質(zhì)，有別于解偶聯(lián)蛋白家族其他成員的功能，UCP 1的主要功能是參與BAT的產(chǎn)熱調(diào)節(jié)和能量代謝來維持機(jī)體的能量代謝平衡[30]。目前有研究指出UCP 1基因啟動子核苷酸片段形成的G-四鏈體構(gòu)型調(diào)節(jié)其表達(dá)，具有誘導(dǎo)白色脂肪棕色化的潛力，在肥胖的防治中有一定的應(yīng)用開發(fā)價值[31]。

3 結(jié)論

本論文對牦牛酥油中MFGM蛋白FABP 3的分離純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出最優(yōu)條件：洗脫體積50 mL，緩沖液pH 7.4，洗脫速度1.6 mL/min，洗脫液濃度0.50 mol/L，該條件下FABP 3的得率達(dá)83.19%。

采用SDS-PAGE和液質(zhì)聯(lián)用對純化前后酥油MFGM鑒定，共鑒定到31種MFGM蛋白和20種差異蛋白。GO分析結(jié)果表明，在生物過程方面，這些蛋白質(zhì)參與生物調(diào)節(jié)、刺激反應(yīng)、多細(xì)胞組織化過程、代謝過程等；細(xì)胞成分方面，在細(xì)胞、細(xì)胞解剖學(xué)實體、細(xì)胞內(nèi)等5類細(xì)胞組分內(nèi)高度富集；在分子功能方面，主要參與結(jié)合作用、催化反應(yīng)、分子功能調(diào)節(jié)器、轉(zhuǎn)運(yùn)等等。

通過KEGG代謝通路分析可知，牦牛酥油MFGM蛋白純化前后差異蛋白共參與15條KEGG代謝通路，其中有3種蛋白參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工相關(guān)的KEGG通路，進(jìn)而調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)的加工；FABP 3參與了PPAR信號通路，推測可能參與其中與脂肪酸降解、膽汁酸合成、甘油磷脂代謝相關(guān)的類脂物代謝作用，為進(jìn)一步探究牦牛酥油FABP 3的作用位置和參與途徑提供參考。