復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中理化特性及抗氧化活性的變化研究

余思潔，李洪軍，李少博，張東，李敏涵，賀稚非

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

狹義上的酵素是指生物體利用發(fā)酵原料所產(chǎn)生的具有催化作用的活性大分子物質(zhì)，但目前市面上常見的酵素是廣義上的酵素，包含酶和其他生物活性成分的混合物[1]。目前國內(nèi)酵素市場還處于發(fā)展初期，市場上出現(xiàn)的酵素產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，進(jìn)口的酵素產(chǎn)品在國內(nèi)售價普遍偏高，難以滿足市場需求[2]。

果蔬中碳水化合物、酚類物質(zhì)、維生素、膳食纖維及礦物質(zhì)[3]等含量較高，是微生物發(fā)酵的優(yōu)良基質(zhì)，因此大量研究人員將果蔬作為發(fā)酵原料。從原料選擇到發(fā)酵時長、發(fā)酵溫度等各條件存在差異，生產(chǎn)過程中所發(fā)生的變化也有所不同，酵素生產(chǎn)的基本流程主要包括原料預(yù)處理、調(diào)整發(fā)酵液中的成分、發(fā)酵、后熟以及后處理等。在食用植物酵素生產(chǎn)中，常用到后熟陳釀這一工藝，專利CN105995684A公布了一種共生菌群酵素的制備方法，將所得的初酵素液靜置于25～30 ℃的環(huán)境中后熟1～2個月，最終所得產(chǎn)品中含有高質(zhì)量的酶以及益生菌分泌物。

植物酵素中的生物活性成分的差異會導(dǎo)致其功能活性的差異，市售酵素產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊，目前科學(xué)研究主要集中在開發(fā)不同原料酵素的發(fā)酵工藝方面，對植物酵素發(fā)酵、后熟過程中的變化情況，特別是對后熟過程中的變化情況研究較少。本試驗以復(fù)合蔬菜汁為原料，以植物乳桿菌PMO08為發(fā)酵菌種，采用儀器分析等研究方法，對植物酵素發(fā)酵和后熟期間的變化情況進(jìn)行研究，旨在對植物酵素在生產(chǎn)過程中的變化進(jìn)行初步探討，以期為該產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

配料表見表1，復(fù)合蔬菜酵素配料種類及比例由前期試驗確定；植物乳桿菌PMO08、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%的低聚果糖溶液，韓國圃美多公司。

表1 復(fù)合蔬菜酵素配料表Table 1 Ingredients for compound vegetable Jiaosu

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、NaH2PO4、Na2HPO4、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、乙酸標(biāo)準(zhǔn)品、磷酸、檸檬酸鈉、Na2CO3、Al(NO3)3、FeSO4，重慶躍翔化工有限公司；無水乙醇、三羥甲基氨基甲烷(trimethylol aminomethane，Tris)、FeCl3、NaOH、HCl，重慶市鈦新化工有限公司；ABTS，美國Sigma公司；福林酚，上海源葉生物科技有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品，北京索萊寶科技有限公司；平板計數(shù)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水楊酸、NaNO2，上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；甲醇，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；5-磺基水楊酸，北京華威銳科化工有限公司；鄰苯三酚，畢得醫(yī)藥公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1780紫外可見分光光度計、GCMS-QP2010Plus氣質(zhì)聯(lián)用儀、LC-20AD高效液相色譜，日本島津公司；UltraSan PRO測色儀，美國Hunter Lab公司；L-8800全自動氨基酸分析儀，日本日立公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將復(fù)合蔬菜汁(FQ)接種活化后的植物乳桿菌PMO08，接種量為0.01%(體積分?jǐn)?shù))，37 ℃發(fā)酵72 h后，當(dāng)總酸[(35.0±1.0) g/kg]、pH(3.3±0.5)、可溶性固形物[(13.0±1.0)%]時，停止發(fā)酵，得到復(fù)合蔬菜酵素(FH)，將得到的樣品FH與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%的低聚果糖溶液按1∶1(體積比)混合后進(jìn)入后熟階段，后熟溫度25 ℃，每周定時攪拌10 min，定時取樣，所取樣品以“SC-天數(shù)”形式命名。

1.3.2 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中的感官評價

參考T/CBFIA 08003—2017《食用植物酵素》感官要求及邢慧雅[4]的方法，結(jié)合本試驗研究的復(fù)合蔬菜酵素產(chǎn)品的感官特點，由10位接受過感官評價培訓(xùn)的專業(yè)人員(5男5女)根據(jù)感官評價標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，感官評價標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 復(fù)合蔬菜酵素感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory scoring standards for compound vegetable Jiaosu

1.3.3 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中的理化特性

1.3.3.1 理化指標(biāo)的測定

pH值測定參照GB 5009.237—2016《食品pH值的測定》。總酸含量(以乳酸計)測定參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》。還原糖含量(以葡萄糖計)測定參照GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》?？扇苄怨绦挝锖渴褂谜酃鈨x測定。

1.3.3.2 光學(xué)性質(zhì)的測定

使用測色儀測定色值。參考MEYDAV等[5]的方法測定褐變度。濁度：4 ℃，8 000 r/min離心10 min后取上清液，在660 nm處測定吸光度。

1.3.3.3 離心沉淀率的測定

取50 g樣品，5 000 r/min離心10 min，去除上清液，精確稱量剩余沉淀的質(zhì)量。

1.3.3.4 微生物指標(biāo)的測定

菌落總數(shù)測定參照GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》。霉菌數(shù)測定參照GB 4789.15—2016《食品微生物學(xué)檢驗霉菌和酵母計數(shù)》。

1.3.4 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中生物活性成分的含量

1.3.4.1 總酚含量的測定

參考ADOM等[6]和CHU等[7]的方法，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.021 3x+0.036 8(R2=0.994 9)。

1.3.4.2 總黃酮含量的測定

參考LIU等[8]的方法，以為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.013x-0.034(R2=0.996 6)。

1.3.4.3 有機(jī)酸含量的測定

參考GB 5009.157—2016《食品有機(jī)酸的測定》以及甘奕[9]的方法并稍作修改。色譜條件：LC-20AD型號高效液相色譜儀；紫外檢測器(檢測波長210 nm)；色譜柱：Chromplus C18柱，250 mm×4.6 mm×5 μm；柱箱溫度30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流動相為0.1%(體積分?jǐn)?shù))的磷酸溶液和甲醇；流速0.5 mL/min。8種有機(jī)酸的回歸方程見表3。

表3 八種有機(jī)酸的回歸方程Table 3 Regression equations for the eight organic acids

1.3.4.4 游離氨基酸含量的測定

采用全自動氨基酸分析儀進(jìn)行測定。取1 mL樣品，加入1 mL 30 g/L的5-磺基水楊酸溶液，4 ℃靜置30 min取出，加入0.06 mol/L的HCl溶液0.5 mL、1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的EDTA-2Na溶液0.5 mL，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液，加入pH 3.0檸檬酸鈉緩沖溶液2 mL，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜得到待測樣品。

1.3.5 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中抗氧化能力的變化

1.3.5.1 ·OH清除能力的測定

配制不同濃度的待測液，在1 mL待測液中加入1 mL 3 mmol/L的FeSO4溶液、1 mL 3 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液和1 mL 3 mmol/L的H2O2溶液，37 ℃水浴30 min，510 nm處測定吸光度值。

1.3.5.2 ·O2-清除能力的測定

配制不同濃度待測液，參考MHATRE等[10]的方法取1 mL待測液進(jìn)行反應(yīng)，加入0.5 mL 10 mmol/L的HCl溶液終止反應(yīng)，325 nm處測定吸光度值。

1.3.5.3 ABTS陽離子自由基清除能力的測定

配制不同濃度待測液，參考EREL[11]的方法取待測液1 mL進(jìn)行試驗，反應(yīng)結(jié)束后在734 nm處測定吸光度值。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗平行進(jìn)行3次，采用Origin 8.1繪制圖表，采用SPSS 21.0、Excel 2007等進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中感官評價的變化

如圖1所示，經(jīng)過植物乳桿菌PMO08發(fā)酵后，復(fù)合蔬菜酵素的總體可接受度略有提升，但總體評分仍然偏低，后熟過程對復(fù)合蔬菜酵素的感官評分有顯著影響，可見其對提高復(fù)合蔬菜酵素的感官品質(zhì)十分必要。這可能是未經(jīng)發(fā)酵的復(fù)合蔬菜汁帶有較強(qiáng)青草氣味，風(fēng)味不協(xié)調(diào)，導(dǎo)致香味、滋味得分較低，發(fā)酵后，復(fù)合蔬菜酵素中含有豐富的微生物代謝產(chǎn)物，豐富了滋味，但發(fā)酵后酸味過濃，影響了感官評分，后熟過程中，酵素內(nèi)部發(fā)生復(fù)雜的反應(yīng)，香氣更協(xié)調(diào)，總體評分上升。

圖1 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中感官評價雷達(dá)圖Fig.1 Radar chart for sensory evaluation of compound vegetable Jiaosu during fermentation and post-ripening

2.2 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中理化特性的變化

2.2.1 理化指標(biāo)的變化

由表4可知，F(xiàn)Q中的總酸含量低，pH值相對較高，發(fā)酵后，F(xiàn)H總酸含量大幅上升，pH值降至3.40，這是由于植物乳桿菌的代謝過程產(chǎn)生了酸類物質(zhì)，使總酸含量增加，pH值降低。后熟過程中，總酸含量先上升后下降，pH值總體來說變化范圍不大(3.37～3.43)，與高慶超[12]的研究一致，可能是因為剛進(jìn)入后熟階段時，剩余的植物乳桿菌繼續(xù)利用糖類發(fā)酵產(chǎn)生酸類物質(zhì)，后熟14 d后，剩余的菌利用、消耗有機(jī)酸，使總酸含量減少后熟過程中，還原糖和可溶性固形物含量均先升高后降低，最后趨于穩(wěn)定，可能是因為在后熟初期，剩余活菌數(shù)較少，對糖類的代謝較慢，而植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生了胞外多糖，消耗速率比產(chǎn)生速率慢，使發(fā)酵液中還原糖和可溶性固形物含量有所上升，而在后熟后期，糖類消耗速率增加，或胞外多糖產(chǎn)生速率降低，使發(fā)酵液中還原糖和可溶性固形物含量有所下降。[13]。

表4 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中理化指標(biāo)的變化Table 4 Changes in physio-chemical indexes of compound vegetable Jiaosu during fermentation and post-ripening

2.2.2 光學(xué)性質(zhì)的變化

由表5可知，在發(fā)酵、后熟過程中L*、a*、b*值發(fā)生顯著變化，F(xiàn)H與FQ相比，L*值顯著上升，a*值顯著下降，b*值顯著上升。在后熟過程中，紅度逐漸減小，體系越來越偏綠。經(jīng)過發(fā)酵后，樣品褐變程度顯著降低，色澤更鮮亮，與L*值反應(yīng)情況一致，樣品濁度顯著降低，隨著后熟的進(jìn)行，褐變程度顯著下降后趨于穩(wěn)定，濁度先降低后上升，這可能與多酚物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用相關(guān)[14]。

表5 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中光學(xué)性質(zhì)的變化Table 5 Changes in the optical properties of compound vegetable Jiaosu during fermentation and post-ripening

2.2.3 離心沉淀率的變化

如圖2所示，發(fā)酵、后熟過程中離心沉淀率顯著下降，可能是發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量酶類，使原料中的大分子物質(zhì)降解為小分子，體系穩(wěn)定性提高。徐萌萌[15]研究發(fā)現(xiàn)果蔬汁的離心沉淀率均較高，多在7%～10%，發(fā)酵果蔬汁中可溶性固形物含量較高容易使產(chǎn)品出現(xiàn)沉淀或分層的現(xiàn)象，而本試驗中的復(fù)合蔬菜酵素后熟90 d后的離心沉淀率為3.3%，說明植物乳桿菌PMO08發(fā)酵復(fù)合蔬菜汁能顯著提高體系的穩(wěn)定性。

圖2 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中離心沉淀率的變化Fig.2 Change of centrifugal sedimentation rate during fermentation and post-ripening of compound vegetable Jiaosu注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2.4 微生物指標(biāo)的變化

如表6所示，菌落總數(shù)在發(fā)酵后略微降低，但不顯著(P>0.05)，在后熟階段，菌落總數(shù)增至6.95 lg CFU/mL，這可能是發(fā)酵后，原料中的營養(yǎng)物質(zhì)無法滿足微生物生長的需求，加入糖原后在短時間大量繁殖，隨著后熟的進(jìn)行，過多的糖原以及總酸的增加抑制微生物的生長繁殖，導(dǎo)致菌落總數(shù)不斷下降，也可能是因為酚類物質(zhì)的增多，在后熟期間抑制了微生物的生長繁殖。在整個發(fā)酵、后熟過程中，霉菌均未檢出。

表6 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中微生物指標(biāo)的變化Table 6 Changes in microbial indicators during fermentation and post-ripening of compound vegetable Jiaosu

2.3 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中生物活性成分的變化

2.3.1 總酚含量的測定

如圖3所示，發(fā)酵后總酚含量顯著增加了71%，這與KAYATH等[16]的研究結(jié)果一致，由于植物乳桿菌發(fā)酵能夠從植物細(xì)胞壁中釋放出酚類化合物[17]。同時植物乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵會使pH值降低，從而激活能參與復(fù)雜酚類物質(zhì)水解的各種酶，有助于簡單酚類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和高分子質(zhì)量酚類化合物的解聚[18]，研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸也能使原料中的酚類物質(zhì)呈游離態(tài)，進(jìn)而增加總酚含量[19]。在后熟60 d后，總酚顯著下降的原因可能是酚類物質(zhì)濃度上升到一定程度后抑制了某些微生物的生長，而這些微生物為了正常繁殖會產(chǎn)生酶類，從而達(dá)到降解酚類物質(zhì)的目的[20]。但總體來說發(fā)酵和后熟均能顯著提高復(fù)合蔬菜酵素的總酚含量。

圖3 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中總酚含量的變化Fig.3 Changes in total phenolic content during fermentation and post-ripening of compound vegetable Jiaosu

2.3.2 總黃酮含量的測定

如圖4所示，發(fā)酵后總黃酮含量顯著增加。在植物內(nèi)，黃酮類物質(zhì)主要以與糖結(jié)合的形式存在，經(jīng)過發(fā)酵后，糖類被消耗，黃酮類物質(zhì)析出，使發(fā)酵體系內(nèi)總黃酮含量增加，此外，與酚類類似，黃酮類物質(zhì)能在微生物發(fā)酵過程中從植物細(xì)胞內(nèi)釋放出來，從而使其含量增加。在后熟45 d達(dá)到最大值，隨后顯著下降，發(fā)酵和后熟均能顯著提高復(fù)合蔬菜酵素的總黃酮含量。

圖4 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中總黃酮含量的變化Fig.4 Changes in total flavonoid content during fermentation and post-ripening of compound vegetable Jiaosu

2.3.3 有機(jī)酸含量的測定

如表7所示，本試驗中的復(fù)合蔬菜酵素中含有酒石酸、乳酸、抗壞血酸、甲酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸7種有機(jī)酸，其中乳酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他有機(jī)酸，在發(fā)酵后樣品中乳酸含量顯著上升，達(dá)到12.98 mg/mL。在后熟期間乳酸含量略有波動，總體顯著上升，后熟90 d時乳酸質(zhì)量濃度為12.28 mg/mL。酒石酸、抗壞血酸、乙酸含量均在發(fā)酵后和后熟期間顯著上升。甲酸、檸檬酸、琥珀酸的含量在發(fā)酵后顯著降低，尤其是檸檬酸，含量由0.25 mg/mL下降到0.02 mg/mL，與YU等[21]的研究一致，在后熟過程中甲酸、檸檬酸、琥珀酸的含量不斷波動，但含量與后熟0 d相比顯著上升。

2.3.4 游離氨基酸含量的測定

如表8所示，F(xiàn)Q中含有17種游離氨基酸，發(fā)酵后，游離氨基酸含量顯著減少，蛋氨酸未檢出，這與KHAN等[22]的研究結(jié)果一致，這有可能是原料中的氨基酸為植物乳桿菌PMO08提供了氮源，這些氨基酸為其他代謝產(chǎn)物的合成提供了前體物質(zhì)，或者由于復(fù)雜反應(yīng)的進(jìn)行，導(dǎo)致游離氨基酸含量顯著降低，如美拉德反應(yīng)和酶轉(zhuǎn)化等[23]。在后熟期間，半胱氨酸在后熟30 d后沒有檢出，谷氨酸含量顯著降低，其余游離氨基酸含量均顯著上升，原因可能是后熟階段剩余的植物乳桿菌利用蛋白質(zhì)，將其分解產(chǎn)生氨基酸，使其含量升高。

2.4 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中抗氧化能力的變化

2.4.1 ·OH清除能力的測定

如圖5所示，濃度為400 μL/mL時，所有樣品的·OH清除率均在97.85%～99.98%，F(xiàn)Q的IC50值顯著高于其他樣品(P<0.05)，說明植物乳桿菌PMO08發(fā)酵能顯著增強(qiáng)復(fù)合蔬菜酵素對·OH抑制能力，在后熟期間，后熟0 d時，IC50值最大，說明后熟過程有利于增強(qiáng)復(fù)合蔬菜酵素的·OH抑制能力。

a-·OH清除率；b-·OH的半抑制濃度IC50圖5 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中·OH清除能力的變化Fig.5 Changes in hydroxyl radical scavenging capacity during fermentation and post-ripening of compound vegetable Jiaosu

2.4.2 ·O2-清除能力的測定

如圖6所示，濃度為800 μL/mL時，·O2-清除率均在60%以上，經(jīng)發(fā)酵后·O2-清除能力減弱，隨著后熟的進(jìn)行，IC50值不斷降低，最終趨于穩(wěn)定，后熟90 d的IC50值為273.30 μL/mL，顯著低于FQ，說明后熟過程能提高復(fù)合蔬菜酵素對·O2-的抑制能力。

a-·O2-清除率；b-·O2-的半抑制濃度IC50圖6 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中·O2-清除能力的變化Fig.6 Changes in superoxide anion radical scavenging capacity during fermentation and post-ripening of compound vegetable Jiaosu

2.4.3 ABTS陽離子自由基清除能力的測定

如圖7所示，濃度為50 μL/mL時，所有樣品的ABTS陽離子自由基清除率在93.51%～99.95%，F(xiàn)Q的清除率最低，為93.51%，其余均在98.65%以上。FQ的IC50值為12.28 μL/mL，F(xiàn)H為10.63 μL/mL，發(fā)酵后ABTS陽離子自由基清除能力增強(qiáng)，后熟0 d的IC50值為8.05 μL/mL，隨著后熟的進(jìn)行，IC50值不斷降低，最終趨于穩(wěn)定，說明后熟過程能顯著提高復(fù)合蔬菜酵素對ABTS陽離子自由基清除的抑制能力(P<0.05)。

a-ABTS陽離子自由基清除率；b-ABTS陽離子自由基的半抑制濃度IC50圖7 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中ABTS陽離子自由基清除能力的變化Fig.7 Changes in ABTS free radical scavenging capacity during fermentation and post-ripening of compound vegetable Jiaosu

3 結(jié)論與討論

本研究采用茄子、奶白菜、水白菜等作為原料，用植物乳桿菌PMO08發(fā)酵，探究復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中感官評價、理化特性、生物活性成分以及抗氧化活性的變化情況。研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌PMO08發(fā)酵及后熟過程均能提高產(chǎn)品的品質(zhì)，在后熟后期產(chǎn)品品質(zhì)趨于穩(wěn)定，這可能是發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量酶類，使原料中的大分子物質(zhì)降解為小分子，使產(chǎn)品更穩(wěn)定。發(fā)酵和后熟2個過程對產(chǎn)品的生物活性成分含量以及抗氧化活性有顯著影響，發(fā)酵過程能顯著提高復(fù)合蔬菜酵素的·OH、ABTS陽離子自由基清除能力，后熟過程中，7種有機(jī)酸含量均顯著上升，·O2-、ABTS陽離子自由基清除能力顯著提升，這可能是發(fā)酵使多酚等生物活性成分從植物細(xì)胞壁中釋放出來，從而影響了復(fù)合蔬菜酵素的生物活性成分及其抗氧化活性。在復(fù)合蔬菜酵素生產(chǎn)過程中，不同時期的產(chǎn)品中各類物質(zhì)的含量及抗氧化活性變化顯著。綜上所述，發(fā)酵能顯著提高復(fù)合蔬菜酵素生物活性成分含量及抗氧化活性，后熟過程能使產(chǎn)品更加穩(wěn)定并進(jìn)一步提高其抗氧化活性。本文研究結(jié)果為酵素后熟過程的研究提供參考，為提高該酵素的市場競爭力提供了一定的理論基礎(chǔ)，為消費者了解產(chǎn)品品質(zhì)提供了參考，促進(jìn)酵素行業(yè)健康發(fā)展。