蛋白質(zhì)高產(chǎn)株小球藻MBFJNU-17的異養(yǎng)培養(yǎng)基優(yōu)化

周有彩，肖雪花，梁志波，何勇錦,2，陳必鏈,2*

1(福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州，350117)2(工業(yè)微生物教育部工程研究中心(福建師范大學(xué))，福建 福州，350117)

小球藻(Chlorellasp.)富含蛋白質(zhì)、色素、多種脂肪酸和淀粉，是食品、醫(yī)藥和能源產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)來源[1- 2]。當(dāng)前，小球藻的全球年產(chǎn)量可達2 500 t，但仍處于供不應(yīng)求的局面[3]。原因在于，小球藻的培養(yǎng)主要是利用開放池和光反應(yīng)器2種形式，這種通過吸收光能的自養(yǎng)培養(yǎng)模式存在很多弊端，如培養(yǎng)周期長、產(chǎn)量低和采收成本高等問題[4]。為填補市場缺口，微藻生產(chǎn)商只能通過加大用地面積，加大培養(yǎng)規(guī)模來提高產(chǎn)量。而擴培手段又無法從根本上解決小球藻培養(yǎng)成本高和產(chǎn)率低的問題，如何經(jīng)濟高效地培養(yǎng)小球藻一直都是學(xué)者和生產(chǎn)商的研究熱點。

研究發(fā)現(xiàn)，部分小球藻可以利用有機碳源來獲取能量以提供自身細胞代謝合成，進行異養(yǎng)生長。與光自養(yǎng)相比，異養(yǎng)培養(yǎng)的小球藻菌株能有效利用葡萄糖，極大提高生長速率，獲得更高的產(chǎn)量[5]。小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基的組成及用量是影響細胞生長的關(guān)鍵因素[6-7]。適合的培養(yǎng)基往往能使小球藻具有較快的生長速率以及高的細胞密度[8]。因此通過優(yōu)化培養(yǎng)基的組分及用量既可以降低小球藻的生產(chǎn)成本又可以提高產(chǎn)量。然而，小球藻細胞在異養(yǎng)條件下通常產(chǎn)生低蛋白質(zhì)(<40%)和高脂肪/碳水化合物含量的生物量[9-10]。為有效地提高異養(yǎng)小球藻的蛋白質(zhì)含量，研究人員開發(fā)了一些有效的工藝來促進微藻的蛋白質(zhì)合成，如串聯(lián)異養(yǎng)/自養(yǎng)培養(yǎng)法[11]和氮饑餓-過度補償法[12]。但這些工藝具有過程繁瑣、培養(yǎng)時間長以及成本昂貴等弊端，因此需要探索更為簡單、有效的方法。

本文用實驗室保藏的1株小球藻MBFJNU-17，研究不同氮源對微藻細胞生長及生理生化的影響，并對小球藻生長培養(yǎng)基關(guān)鍵影響成分的用量進行優(yōu)化，對小球藻的細胞組分進行分析，評估蛋白質(zhì)的氨基酸品質(zhì)，旨在為開發(fā)優(yōu)質(zhì)的動物飼料或人類食品蛋白質(zhì)來源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種與培養(yǎng)基

小球藻Chlorellasp.MBFJNU-17，由本實驗室保藏。保種斜面瓊脂培養(yǎng)基為添加了5 g/L葡萄糖和20 g/L瓊脂的BG11[13]培養(yǎng)基。

HA-SK培養(yǎng)基[11](g/L)：葡萄糖 30、MgSO4·7H2O 0.7、CaCl25 mL/L、Fe-EDTA 16 mL/L、KNO39.25、KH2PO40.7、微量元素母液2.5 mL/L，配制完成后將pH調(diào)節(jié)至7.5。

Fe-EDTA母液：稱取Fe2SO4·7H2O 1.745 g、EDTA 8.2 g，溶于少量蒸餾水后定容至1 L。

CaCl2母液：無水CaCl220.6 g，H2O 1 L。

微量元素母液(g/L)：H3BO311.42、ZnSO4·7H2O 8.22、MnCl2·4H2O 1.95、Co(NO3)2·6H2O 0.49、(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.870 7、CuSO4·5H2O 1.57。

所有培養(yǎng)基使用前于115 ℃滅菌20 min。

1.2 實驗儀器與試劑

1.2.1 儀器

SBA-40E生物傳感分析儀，山東省科學(xué)研究院；海能K9840全自動凱氏定氮儀，濟南海能儀器股份有限公司；BS224S電子秤，北京賽多利斯系統(tǒng)儀器有限公司；HVE50高壓蒸汽滅菌鍋，中遠機械有限公司；DHG-9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；H1650-W湘儀離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；DELTA320 pH計，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；IS-RDS3恒溫振蕩搖床，賽伯樂上海儀器有限公司。

1.2.2 試劑

酵母粉，索萊寶生物科技有限公司；蛋白胨粉，生工生物工程(上海)股份有限公司；KNO3、尿素，西隴科學(xué)股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 藻種制備

從葡萄糖BG11培養(yǎng)基斜面挑取適量小球藻體，接種于裝有100 mL HA-SK培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，置于28 ℃恒溫振蕩搖床中培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，培養(yǎng)時長約72 h。

1.3.2 小球藻生長曲線的繪制

取培養(yǎng)至72 h的新鮮小球藻種子液，以體積分數(shù)為10%的接種量接入HA-SK培養(yǎng)基，與藻種相同條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)時長168 h，每天取樣測定生物量，并繪制其生長曲線。

1.3.3 氮源種類的優(yōu)化

根據(jù)HA-SK培養(yǎng)基的初始氮含量，探究相同氮質(zhì)量濃度(以總氮分子質(zhì)量計)的4種不同氮源對小球藻細胞生長以及生物質(zhì)組分的影響，即KNO3(9.25 g/L)、酵母粉(9.21 g/L)、蛋白胨粉(9.21 g/L)和尿素(2.8 g/L)，篩選出小球藻MBFJNU-17異養(yǎng)培養(yǎng)的最適氮源。將小球藻MBFJNU-17藻種以10%的接種量，接種于裝有100 mL不同氮源HA-SK培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，置于恒溫振蕩搖床中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，黑暗條件下培養(yǎng)5 d。每天測定培養(yǎng)液的pH，并測定最終的小球藻生物量、蛋白質(zhì)、碳水化合物以及油脂等理化組分。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化

以Plackett-Burman設(shè)計法[14]，設(shè)計以培養(yǎng)基中葡萄糖、氮源、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2母液、Fe-EDTA母液和微量元素母液為不同因素，在原始HA-SK培養(yǎng)基各因素濃度的附近取高低2個水平，其中高水平為低水平的2倍，并以小球藻培養(yǎng)120 h的生物量為響應(yīng)值，篩選出HA-SK培養(yǎng)基成分中對小球藻MBFJNU-17生長最重要的幾個因素。隨后用最陡爬坡來快速逼近各重要因素最佳用量的區(qū)域。最后再利用響應(yīng)面法[15]優(yōu)化得到各培養(yǎng)基的最佳用量。

1.4 分析測試

1.4.1 小球藻生物量的測定

采用干重法測定小球藻的生物量。取1 mL的小球藻藻液，移至預(yù)先烘干稱重的2 mL離心管中，離心棄上清液，加純水重復(fù)離心，洗滌3次，置于80 ℃烘箱內(nèi)至恒重，稱重并記錄。

1.4.2 小球藻生物質(zhì)主要成分的分析

采用凱氏定氮法測定微藻蛋白質(zhì)含量[16]。采用苯酚硫酸法測定微藻的碳水化合物含量[17]。采用氯仿-甲醇法測定微藻細胞的油脂含量[18]。

1.4.3 蛋白質(zhì)中氨基酸組成測定及品質(zhì)評價

采用高效液相色譜法測定小球藻蛋白質(zhì)的氨基酸組分[19]。利用必需氨基酸指數(shù)(essential amino acids index，EAAI)評價小球藻的蛋白質(zhì)營養(yǎng)價值，將小球藻MBFJNU-17的必需氨基酸與FAO /WHO的建議模式進行比較[20]。

1.4.4 培養(yǎng)基氮含量計算

培養(yǎng)基氮含量計算如公式(1)所示：

(1)

式中：ρ(N)，培養(yǎng)基中氮含量，g/L；m，氮源質(zhì)量，g；Pn，氮源的總氮占比，%；L，培養(yǎng)基體積，L。

2 結(jié)果與分析

2.1 小球藻 MBFJNU-17生長曲線

由圖1可知，小球藻MBFJNU-17種子接入HA-SK培養(yǎng)基后快速生長，迅速進入指數(shù)生長期，幾乎沒有延滯期。培養(yǎng)至96 h，小球藻的生物量達最大值9.32 g/L；96～168 h，不再增加，甚至輕微衰減?？赡苁谴藭r培養(yǎng)體系內(nèi)某些影響小球藻細胞生長的關(guān)鍵營養(yǎng)成分被消耗，殘余量不足以繼續(xù)供應(yīng)細胞正常的生長繁殖，整個細胞群體的凋亡速度大于新細胞合成速度。因此，選擇以培養(yǎng)120 h為1個周期。

圖1 小球藻MBFJNU-17在HASK培養(yǎng)基的生長曲線Fig.1 Growth curve of Chlorella sp.MBFJNU-17 cultivated in HA-SK medium

2.2 小球藻培養(yǎng)基氮源的篩選

氮源是微藻培養(yǎng)中最重要的常量營養(yǎng)元素，藻細胞的蛋白質(zhì)、色素和核酸合成都需要氮元素參與。由圖2-a可知，以尿素為氮源小球藻MBFJNU-17培養(yǎng)120 h后生物量最高(10.85 g/L)，KNO3組為9.44 g/L。而以蛋白胨、酵母粉為氮源的實驗組小球藻生物量遠低于尿素組和KNO3組，最終生物量僅約3 g/L。表明小球藻MBFJNU-17不能很好地利用酵母粉和蛋白胨等有機氮源，而更傾向于利用尿素和KNO3。肖雪花等[21]發(fā)現(xiàn)，酵母粉更適于作為蛋白核小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)的氮源，與本研究結(jié)果不一致，可能是因為藻的種間差異。而利用尿素為氮源比以KNO3為氮源的細胞干重略有優(yōu)勢，主要是由于小球藻在選擇利用尿素時，脲酶將尿素分解成氨態(tài)氮和CO2，過程不需要消耗能量[22]，而利用硝態(tài)氮時需轉(zhuǎn)化為氨態(tài)氮才能被利用，這個過程需要多消耗能量，造成有機碳源的損耗[23]。

a-生長情況；b-pH；c-理化成分圖2 不同氮源對小球藻MBFJNU-17的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources on Chlorella sp.MBFJNU-17

圖2-b記錄了以不同氮源培養(yǎng)異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻MBFJNU-17過程的pH變化情況。以尿素為氮源，小球藻培養(yǎng)液的pH始終在7.5左右?？赡苁且驗槟蛩厥欠肿邮綖镃H4N2O的有機化合物，其主要成分為碳和氮，在被微藻吸收利用后，不會殘留大量陰離子和陽離子，因此不會影響培養(yǎng)基的pH。而以KNO3、蛋白胨和酵母粉為單一氮源則使培養(yǎng)液pH變化較大。其中以蛋白胨、酵母粉為氮源，培養(yǎng)小球藻120 h后，培養(yǎng)液的pH從7.5降至約6，而KNO3組的藻液pH迅速升高，升至9.5左右。KNO3作為微藻培養(yǎng)的氮源時，微藻對NO3-的吸收比K+更多，因此有部分K+殘留在培養(yǎng)基質(zhì)中生成K2CO3等弱酸強堿鹽，升高了培養(yǎng)環(huán)境的pH值。而酵母粉和蛋白胨粉作為有機氮源成分相對復(fù)雜，其影響微藻培養(yǎng)pH值的機制尚不清楚，今后還需更多地利用多組學(xué)技術(shù)來闡述其代謝活動。據(jù)報道，培養(yǎng)液pH值的變化會影響小球藻生長[24]。SHI等[25]發(fā)現(xiàn)在同等氮濃度下，尿素作為氮源在藻類生長過程中優(yōu)于常用的硝酸鹽，在培養(yǎng)基中引起的pH波動小，藻類的生物量相對較高，這與本研究結(jié)果相似。

另外，氮源的種類對小球藻MBFJNU-17的理化成分影響顯著。如圖2-c所示，以尿素和KNO3為氮源更有利于蛋白質(zhì)的合成(40%～45%)，而以蛋白胨和酵母粉為氮源則更有利于油脂的積累(30%～35%)。

綜上可得，以KNO3或尿素為唯一氮源時，有利于小球藻細胞生長。此外，對生物量、蛋白質(zhì)含量和氮源添加量進行計算可知，獲得相同生物量的小球藻時，所需的KNO3質(zhì)量約為單獨使用尿素的3.8倍，且利用KNO3獲得的小球藻蛋白質(zhì)產(chǎn)量僅為使用尿素為唯一氮源時的81.2%。同時，在以尿素為唯一氮源時也更有利于穩(wěn)定培養(yǎng)液的pH。小球藻在規(guī)模化異養(yǎng)培養(yǎng)過程中，若頻繁調(diào)節(jié)pH勢必會增加操作工序和培養(yǎng)成本，也更容易造成染菌。根據(jù)調(diào)查，尿素的市場價格也會比KNO3的價格更低[26]。因此后續(xù)培養(yǎng)小球藻MBFJNU-17選取尿素作為異養(yǎng)培養(yǎng)的氮源，可以減少物料的投入成本，同時無需調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH，易于規(guī)?；瘧?yīng)用。

2.3 小球藻異養(yǎng)培養(yǎng)基配方優(yōu)化

2.3.1 Plackett-Burman優(yōu)化小球藻培養(yǎng)基

選取小球藻培養(yǎng)基里的葡萄糖、尿素、MgSO4·7H2O、CaCl2母液、Fe-EDTA母液、KH2PO4和微量元素母液7類組分為自變量，每個因素設(shè)計高低2個水平，以培養(yǎng)120 h的小球藻生物量作為響應(yīng)值。實驗結(jié)果見表1。在眾多因子中，葡萄糖、尿素和微量元素母液顯著影響(P<0.05)小球藻MBFJNU-17的生長。其中葡萄糖和尿素為正效應(yīng)(T>0)，而微量元素母液為負效應(yīng)(T<0)。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計方差分析表Table 1 Analyses of variance for Plackett-Burman design

2.3.2 最陡爬坡試驗

根據(jù)Plackett-Burman選取最顯著的3個因素，即葡萄糖、尿素和微量元素母液，進行最陡爬坡試驗。由于葡萄糖和尿素是正效應(yīng)，而微量元素母液為負效應(yīng)，因此葡萄糖和尿素的濃度水平應(yīng)增加，微量元素母液濃度水平應(yīng)減少。根據(jù)效應(yīng)值大小，確定步長，設(shè)計及結(jié)果如表2。試驗組3的小球藻生物量最大，達15.25 g/L。因此選取試驗組3的水平條件作為中心點進一步通過響應(yīng)面優(yōu)化最佳濃度水平。

表2 最陡爬坡試驗設(shè)計及其結(jié)果Table 2 Designs and result of steepest ascent search

2.3.3 響應(yīng)面分析確定最優(yōu)水平

根據(jù)最陡爬坡試驗結(jié)果，選取葡萄糖40 g/L、尿素5 g/L、微量元素母液2 mL為中心點。參照Box-Behnken中心法則設(shè)計原理，通過Design-Expert 8.05軟件設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面試驗，以生物量為響應(yīng)值，設(shè)計和數(shù)據(jù)分析見表3、表4和表5。

表3 響應(yīng)面設(shè)計因素及水平Table 3 Factors and levels of Box-Behnken design

表4 響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果Table 4 Results of response surface Box-Behnken design

用Design-Expert 8.05b 軟件對試驗進行回歸擬合分析，得到響應(yīng)值小球藻細胞干重與各自變量因素的二次回歸方程如下：

Y=15.48+0.74X1-0.44X2-0.30X3-0.16X1X2-0.23X1X3+0.46X2X3-0.87X12-0.80X22-0.70X32

為檢驗方程的有效性，對回歸方程進行方差分析，結(jié)果見表5?；貧w方程響應(yīng)值和自變量因素之間的線性關(guān)系顯著(R2=0.989 9)，方程P=0.009 1，說明此回歸方程極顯著；失擬項P=0.380 3>0.1，說明方程對實驗的擬合度較好，此實驗方法是合適的[12]。為求得最佳配方，通過對模型方程各變量求一階偏導(dǎo)數(shù)，解得X1=41.53、X2=4.14、X3=1.84。即小球藻細胞生長干重的最佳葡萄糖濃度為41.53 g/L、尿素質(zhì)量濃度為4.14 g/L、微量元素母液用量為1.84 mL，在此條件下的小球藻細胞干重為15.79 g/L。

表5 回歸方程的系數(shù)估計值Table 5 The regression equation of coefficient estimates

2.3.4 響應(yīng)面結(jié)果驗證

將經(jīng)過優(yōu)化后的培養(yǎng)基以相同接種量、培養(yǎng)條件進行3次重復(fù)試驗，以驗證此模型精準(zhǔn)性。如圖3-a所示，在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中培養(yǎng)120 h，小球藻MBFJNU-17最終生物量為15.53 g/L，與預(yù)測值15.79 g/L接近，比優(yōu)化前提高了43.1%，說明此優(yōu)化模型可取。

a-細胞生長變化；b-生化組成分析圖3 優(yōu)化后培養(yǎng)基培養(yǎng)小球藻MBFJNU-17的細胞生長變化和生化組成分析Fig.3 Changes of cell growth and biochemical composition of Chlorella sp.MBFJNU-17 treated by optimized medium

優(yōu)化后培養(yǎng)基培養(yǎng)的小球藻生化組分分析見圖3-b。優(yōu)化后的小球藻蛋白質(zhì)含量達52.4%，淀粉含量22.7%以及油脂含量為7.8%。利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基培養(yǎng)小球藻MBFJNU-17，蛋白質(zhì)含量從44.5%提高到了52.4%。說明優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方在保證了小球藻MBFJNU-17生物量提高的同時，也促進了細胞蛋白質(zhì)合成。說明培養(yǎng)基優(yōu)化后，小球藻MBFJNU-17成為生產(chǎn)高密度生物量且富含蛋白質(zhì)的理想菌株。

2.4 小球藻蛋白質(zhì)的評價

蛋白質(zhì)的營養(yǎng)品質(zhì)與氨基酸的含量、比例相關(guān)，特別是由各類必需氨基酸的濃度決定[27]。本文采用EAAI對小球藻MBFJNU-17在自養(yǎng)(BG11培養(yǎng)基培養(yǎng))和異養(yǎng)2種培養(yǎng)模式下的氨基酸組成進行比較分析和評價。高EAAI值表明樣品存在高含量的必需氨基酸[28]。如表6所示，異養(yǎng)小球藻MBFJNU-17蛋白質(zhì)在FAO/WHO/UNU模式下的EAAI為0.724，高于自養(yǎng)模式培養(yǎng)的藻蛋白質(zhì)(0.572)。可能原因是，異養(yǎng)培養(yǎng)基中豐富的營養(yǎng)元素使得小球藻MBFJNU-17更容易合成必需氨基酸。同時，異養(yǎng)小球藻MBFJNU-17蛋白質(zhì)的EAAI值也高于大豆蛋白(0.657)。說明異養(yǎng)小球藻MBFJNU-17蛋白比大豆蛋白具有更高的營養(yǎng)價值，有可能成為優(yōu)質(zhì)的動物飼料或人類食品蛋白質(zhì)來源。

表6 異養(yǎng)/自養(yǎng)小球藻蛋白與大豆蛋白在FAO/WHO/UNU模式下EAAI 單位：mg/g蛋白Table 6 Compared heterotrophic/phototrophic Chlorella sp. MBFJNU-17 protein with soya protein in essential amino acid index (EAAI) in FAO/WHO/UNU standard

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗選取了尿素作為小球藻MBFJNU-17異養(yǎng)培養(yǎng)的氮源。相比于其他氮源，用尿素作為氮源異養(yǎng)培養(yǎng)小球藻能具有最高生物量，且培養(yǎng)過程pH穩(wěn)定，更具應(yīng)用前景。小球藻MBFJNU-17異養(yǎng)培養(yǎng)的培養(yǎng)基經(jīng)優(yōu)化后，其生物量為15.53 g/L，比優(yōu)化前提升了43.1%，同時藻細胞的蛋白質(zhì)含量為52.4%。氨基酸評價分析表明，小球藻MBFJNU-17蛋白質(zhì)氨基酸組成平衡，比大豆蛋白具有更高的營養(yǎng)價值，小球藻MBFJNU-17有成為優(yōu)質(zhì)的動物飼料或人類食品蛋白質(zhì)原料來源的潛能。