優(yōu)化有機氮源提高小白鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸效率

劉宇翔，柳天一，鄧玥，王靚，張宏建，張建華，陳旭升*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine，ε-PL)，1977年由日本學(xué)者于鏈霉菌發(fā)酵液中首次分離到，是陽離子同型氨基酸聚合物[1]，一般由25～35個L-賴氨酸殘基通過ε-氨基和α-羧基間的酰胺鍵連接而成[2]。由于其多陽離子的性質(zhì)可通過離子吸附與攜帶負(fù)電荷的細(xì)胞表面相互作用，故對于包括革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌、酵母菌、霉菌甚至病毒在內(nèi)的多種微生物都表現(xiàn)出良好的抑菌活性[3]。目前，ε-PL及其鹽酸鹽已獲得日本、韓國、美國、中國等國家和地區(qū)批準(zhǔn)用作天然食品防腐劑[4]。此外，ε-PL還在藥物載體、納米粒、基因載體、脂質(zhì)體、干擾素誘導(dǎo)劑、脂肪酶抑制劑和水凝膠等多個領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景[5]。

如何提高ε-PL發(fā)酵產(chǎn)量并降低其生產(chǎn)成本一直是學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界關(guān)注的核心問題。發(fā)酵培養(yǎng)基組分是微生物菌體生長和產(chǎn)物合成的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是影響微生物目標(biāo)產(chǎn)物積累量的關(guān)鍵。同時，相比于通過育種手段提高目標(biāo)產(chǎn)物發(fā)酵產(chǎn)量，培養(yǎng)基組分和比例優(yōu)化是一種簡單、有效提高目標(biāo)產(chǎn)物濃度、降低生產(chǎn)成本的方式之一。為此，GUO等[6]對ε-PL發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源和有機氮源進(jìn)行了優(yōu)化，ε-PL搖瓶產(chǎn)量達(dá)到0.95 g/L，較優(yōu)化前提高了43.1%；5 L罐ε-PL產(chǎn)量提高至25.5 g/L，較優(yōu)化前增加了56.4%。發(fā)酵時間由174 h縮短到120 h，顯著提高了ε-PL生產(chǎn)強度。CHHEDA等[7]則對StreptomycesnourseiNRRL 5126發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL的碳源、有機氮源和無機氮源進(jìn)行了優(yōu)化，使得ε-PL發(fā)酵產(chǎn)量提高了1倍。BHATTACHARYA等[8]開發(fā)了一種人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)-粒子群算法(artificial neural network particle swarm optimization，ANN-PSO)對ε-PL發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行改良，通過模型推演，確定了最佳的培養(yǎng)基組合，ε-PL產(chǎn)量提高了1倍，達(dá)到74 mg/L。本團隊對Streptomycessp.M-Z18發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL的碳源種類和用量進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)以甘油作為碳源時，搖瓶ε-PL產(chǎn)量是以葡萄糖為碳源的近3倍，達(dá)到了2.27 g/L[9]；而將甘油與葡萄糖按照質(zhì)量比1∶1進(jìn)行混合發(fā)酵時，最高ε-PL產(chǎn)量可達(dá)到35.14 g/L，分別是單獨使用葡萄糖和甘油作為碳源的1.43和1.17倍[10]。PEN等[11]開發(fā)出一種基于魚粉和玉米漿作為有機氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基富含谷氨酸、精氨酸、賴氨酸和天冬氨酸，不僅提高了菌絲體的耐酸能力，而且促進(jìn)了菌體的生長和ε-PL的合成，使得Streptomycessp.M-Z18的ε-PL產(chǎn)量達(dá)到了35.24 g/L，并顯著降低了培養(yǎng)基成本。因此，通過培養(yǎng)基優(yōu)化來提高ε-PL發(fā)酵產(chǎn)量是一種有效手段。

前期，本團隊通過傳統(tǒng)誘變和抗性篩選手段，獲得1株ε-PL高產(chǎn)突變株S.albulusGS114，其搖瓶ε-PL產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了70%左右。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基營養(yǎng)組分比例和發(fā)酵工藝條件，實現(xiàn)5 L發(fā)酵罐ε-PL發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到60.2 g/L，為國內(nèi)外報道的最高發(fā)酵水平[12-14]。然而，ε-PL發(fā)酵過程中最大菌體量卻達(dá)到62 g/L(菌體干重)，造成了發(fā)酵過程需氧量增大，葡萄糖轉(zhuǎn)化率下降等不良后果，損壞了發(fā)酵過程的經(jīng)濟性。本文以期通過改變有機氮源種類，達(dá)到降低菌體量并維持ε-PL發(fā)酵水平，從而實現(xiàn)S.albulusGS114發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL過程的高產(chǎn)量和經(jīng)濟性相統(tǒng)一。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種

StreptomycesalbulusGS114，由本實驗室選育和保藏。

1.1.2 主要試劑與儀器

葡萄糖，山東西王藥業(yè)有限公司，優(yōu)級純；酵母粉，Oxoid 公司、Biospringer公司、圣琪公司和安琪酵母公司；其他試劑，國藥化學(xué)試劑有限公司，分析純。

5 L發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備有限公司；T&J-Miniskid 1 L×4迷你平行生物反應(yīng)器，迪必爾生物工程(上海)有限公司；UV-2100分光光度計，優(yōu)尼科儀器有限公司；AB204-N 分析天平，瑞士梅特勒公司；GNP-9160恒溫培養(yǎng)箱，上海光都儀器設(shè)備有限公司；高速冷凍離心機3K15，德國西格瑪公司；HYL-C組合式搖床，太倉市強樂設(shè)備有限公司；Kjeltec 8400 Analyzer Unit凱氏定氮儀，丹麥福斯分析儀器公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基(BTN)(g/L)：葡萄糖10，魚粉蛋白胨2，酵母粉Oxoid 1，瓊脂 20，pH 7.5。

種子培養(yǎng)基(M3G)(g/L)：葡萄糖50，酵母粉Oxoid 5，(NH4)2SO410，K2HPO40.8，KH2PO41.36，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03，ZnSO4·7H2O 0.04，pH 6.8。

發(fā)酵培養(yǎng)基(YP)(g/L)：葡萄糖 60，酵母粉FM902 14.48，(NH4)2SO410，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03，KH2PO44，ZnSO4·7H2O 0.04，消泡劑 0.2，pH 6.8。

流加培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖750，氨水 6.25%或12.5%(體積分?jǐn)?shù))，(NH4)2SO4375，消泡劑100。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：挑取3環(huán)孢子接種至種子培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min，培養(yǎng)24 h。

搖瓶水平不同有機氮源的ε-PL發(fā)酵：將培養(yǎng)好的種子液以體積分?jǐn)?shù)8%接種量接入裝有40 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，30 ℃、200 r/min，培養(yǎng)72 h。

搖瓶水平差異氨基酸添加的ε-PL發(fā)酵：根據(jù)相同質(zhì)量濃度的FM902與FM760游離氨基酸差異，將質(zhì)量濃度差異大于15%的氨基酸在濃度相對較小的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加至相應(yīng)濃度，具體發(fā)酵方式同搖瓶水平不同有機氮源的ε-PL發(fā)酵。

1 L發(fā)酵罐水平不同有機氮源的ε-PL分批發(fā)酵：將培養(yǎng)好的種子液以體積分?jǐn)?shù)8%接種量接入，裝液量700 mL，溫度30 ℃，初始轉(zhuǎn)速200 r/min，通氣量1 vvm，溶氧設(shè)置為30%，轉(zhuǎn)速溶氧聯(lián)動控制。待pH自然下降至4.0時，用體積分?jǐn)?shù)6.25%的氨水維持pH恒定4.0直至發(fā)酵結(jié)束。

5 L發(fā)酵罐ε-PL的補料分批發(fā)酵：在5 L發(fā)酵罐中裝入3 200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵開始前將初始pH調(diào)至6.8，溫度30 ℃，初始轉(zhuǎn)速200 r/min，通氣量1 vvm，共發(fā)酵192 h。按照8%的接種量將280 mL種子液接入。接種后pH自然下降至6.0時，通過流加體積分?jǐn)?shù)12.5%氨水維持pH預(yù)培養(yǎng)7.5 h。預(yù)培養(yǎng)結(jié)束后進(jìn)行pH沖擊，沖擊階段恒定轉(zhuǎn)速不變，沖擊至溶氧達(dá)60%時迅速調(diào)至pH 4.0，之后根據(jù)溶氧變化調(diào)節(jié)pH，使其盡量維持在10%～30%。當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度低于10 g/L時，根據(jù)葡萄糖的消耗速率設(shè)定補料速率，補加質(zhì)量濃度為750 g/L葡萄糖溶液，維持發(fā)酵液中葡萄糖質(zhì)量濃度在10 g/L左右直至發(fā)酵結(jié)束。與此同時，當(dāng)NH4+-N質(zhì)量濃度低于0.2 g/L時脈沖補加375 g/L (NH4)2SO4溶液，使NH4+-N質(zhì)量濃度維持在0.2～0.5 g/L，如此重復(fù)直至發(fā)酵結(jié)束。

1.2.2 分析方法

發(fā)酵過程參數(shù)測定：ε-PL濃度測定采用甲基橙比色法[15]。NH4+-N 濃度測定采用靛酚藍(lán)反應(yīng)法[16]。葡萄糖濃度使用生物傳感分析儀(SBA-40C)進(jìn)行測定[17]。總氮含量測定采用凱氏定氮法[18]。菌體干重的測定參照刁文嬌[19]的方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 搖瓶水平不同有機氮源對ε-PL發(fā)酵的影響

選取魚粉蛋白胨、羽毛粉、FP103、FP320、FM760、FM408、FM502、FM803、YP600、YP601、Oxoid等11種有機氮源，并以原先使用的酵母粉FM902作為對照，控制其他有機氮源總氮含量與FM902相同，對12種有機氮源的ε-PL發(fā)酵水平進(jìn)行評估，搖瓶發(fā)酵結(jié)果如表1所示。以魚粉蛋白胨、羽毛粉、FM803、FP320、YP600和YP601作為有機氮源，ε-PL產(chǎn)量均在2 g/L以下，顯著低于對照(FM902)?？赡艿脑蚴巧鲜?種有機氮源均為遲效有機氮源，它們的有機氮主要以大分子蛋白形式存在，不利于ε-PL的合成。有機氮源FM760和FM408的ε-PL產(chǎn)量分別達(dá)到(2.60±0.02)和(2.58±0.08) g/L，較對照FM902提高了22.07%和21.13%。從單位菌體合成能力上看，除FM803、YP601和YP600外，其他8種有機氮源的單位菌體合成能力均顯著高于對照FM902。綜合考慮ε-PL產(chǎn)量和單位菌體ε-PL合成能力，有機氮源FP103、FM760和FM408均優(yōu)于對照FM902。上述3種有機氮源均為酵母浸粉，其加工工藝是以酵母為原料，經(jīng)自溶、酶解、濃縮、干燥等工藝制成，富含蛋白質(zhì)、氨基酸、肽、多肽、核酸、維生素及微量元素等營養(yǎng)成分，屬于速效有機氮源，更加適合S.albulusGS114的ε-PL合成。

表1 不同有機氮源含氮量、添加量及發(fā)酵結(jié)果Table 1 Contents, concerntration, and fermentation results of different organic nitrogen sources

2.2 1 L發(fā)酵罐水平不同有機氮源對ε-PL分批發(fā)酵的影響

為進(jìn)一步確定有機氮源種類，并考慮到pH值是影響ε-PL生物合成的最關(guān)鍵因素，故利用1 L發(fā)酵罐在pH 4.0條件下，評估了12種有機氮源分批發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL的情況。由圖1-a可知，利用FM760、FM408、羽毛粉、FM502、Oxoid和FP320作為有機氮源發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL，分批發(fā)酵ε-PL產(chǎn)量較對照FM902分別提高了42.62%、28.37%、19.37%、16.57%、19.88%和20.22%。有機氮源FM502和YP601實現(xiàn)最大菌體干重達(dá)到29.45和29.50 g/L，較對照FM902分別提高了28.32%和28.54%。從圖1-b可知，以FM760、FM408、FM502、YP601和Oxoid為有機氮源的分批發(fā)酵，ε-PL產(chǎn)率較對照FM902分別提高了28.57%、14.29%、21.43%、7.14%和2.35%，達(dá)到了0.18、0.16、0.17、0.15和0.14 g/(L·h)。然而，從圖1-c可知，僅有以FM760、FM408、Oxide和FP302為有機氮源的發(fā)酵，葡萄糖轉(zhuǎn)化率較對照FM902有所提高，其中FM760的葡萄糖轉(zhuǎn)化率最高(11.93%)，提高了39.53%。從圖1-d可知，除FM502、YP601和YP600外，其他有機氮源的分批發(fā)酵，單位菌體合成能力均較對照FM902(0.20 g/g)有所提高。綜合搖瓶和1 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵的結(jié)果，可以確定有機氮源FM760是S.albulusGS114發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL的最佳選擇。

a-ε-聚賴氨酸與菌體干重；b-產(chǎn)率；c-葡萄糖轉(zhuǎn)化率；d-單位菌體合成能力圖1 不同有機氮源對ε-PL分批發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of different types of organic nitrogen sources in the batch fermentation of ε-PL

2.3 最佳有機氮源FM760促進(jìn)ε-PL發(fā)酵效率提升的關(guān)鍵氨基酸分析

為從氨基酸角度解釋有機氮源FM760較對照FM902提升ε-PL發(fā)酵效率的原因，本研究將相同質(zhì)量濃度的有機氮源FM760和FM902分別進(jìn)行了游離氨基酸和水解氨基酸種類及含量的測定，由于2種酵母粉溶于水中呈酸性，且大部分的發(fā)酵時間發(fā)酵環(huán)境處于酸性，天冬酰胺、谷氨酰胺以及色氨酸在酸性條件下被破壞，無法被檢測，故檢測了其余17種常見氨基酸。在游離氨基酸含量方面(圖2-a)，除了天冬氨酸、丙氨酸和半胱氨酸外，F(xiàn)M760其余的游離氨基酸含量均高于對照FM902，其中甘氨酸含量是對照組的4.8倍，但丙氨酸只有FM902的84.51%；在水解氨基酸方面(圖2-b)，2種有機氮源的大部分氨基酸含量均無顯著差異，只有FM760的甘氨酸含量較FM902高出82%，丙氨酸與半胱氨酸分別低了20.02%與81.81%。2種有機氮源的水解氨基酸總量基本一致(圖2-c)，而FM760的游離氨基酸總量較FM902高出33.08%。因此，F(xiàn)M760擁有更加豐富的游離氨基酸，有助于菌體生長和代謝，進(jìn)而有利于ε-PL合成。

a-游離氨基酸；b-水解氨基酸；c-氨基酸總量；d-搖瓶發(fā)酵結(jié)果圖2 FM760與FM902氨基酸比較以及搖瓶發(fā)酵結(jié)果Fig.2 Comparison of amino acids between FM760 and FM902 and shake flask fermentation results

綜上，有機氮源FM760促進(jìn)ε-PL合成的原因很可能與這些差異氨基酸的含量有關(guān)。為進(jìn)一步確認(rèn)造成2種有機氮源的ε-PL發(fā)酵效率差異，本研究將上述分析中差異較大的氨基酸(質(zhì)量濃度差異大于15%)，在質(zhì)量濃度較少的有機氮源中進(jìn)行外源添加發(fā)酵，結(jié)果如圖2-d所示。當(dāng)FM902中添加甘氨酸，ε-PL產(chǎn)量無明顯變化；當(dāng)FM760中添加天冬氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和精氨酸，ε-PL產(chǎn)量均有所上升，其中添加了天冬氨酸的ε-PL產(chǎn)量提高幅度最大(7.2%)；而當(dāng)FM760中添加丙氨酸、亮氨酸和異亮氨酸，ε-PL產(chǎn)量均表現(xiàn)出下降，其中添加了異亮氨酸的ε-PL產(chǎn)量下降幅度最大(10.9%)，接近FM902的ε-PL產(chǎn)量。因此，有機氮源FM760提升ε-PL發(fā)酵效率很可能與異亮氨酸有關(guān)，其次與丙氨酸和亮氨酸有關(guān)。

2.4 不同含量FM760對ε-PL補料分批發(fā)酵的影響

由2.1可知，按照總氮相同的原則，F(xiàn)M760的質(zhì)量濃度為9.27 g/L，為確定此濃度是否為最佳濃度，分別考察了3個質(zhì)量濃度梯度(4.27、9.27和14.27 g/L)對補料分批發(fā)酵條件下菌體生長和ε-PL產(chǎn)量影響。當(dāng)FM760質(zhì)量濃度為9.27 g/L時，ε-PL產(chǎn)量達(dá)到了62.38 g/L，較FM902(52.51 g/L)提高了18.80%(圖3-a)；最大菌體干重達(dá)到了55.52 g/L，較對照(48.31 g/L)提高了20%(圖3-b)；單位菌體ε-PL合成能力達(dá)到了1.12 g/g，較對照提高了2.75%(圖3-c)；葡萄糖轉(zhuǎn)化率達(dá)到了9.76%，較對照提高了25.77%(圖3-d)，顯示出選擇9.27 g/L FM760作為有機氮源不僅能夠獲得超過60 g/L的ε-PL產(chǎn)量，還可以顯著提高底物轉(zhuǎn)化率，實現(xiàn)了發(fā)酵產(chǎn)量和發(fā)酵經(jīng)濟性統(tǒng)一。當(dāng)FM760質(zhì)量濃度下降至4.27 g/L時，ε-PL產(chǎn)量大幅下降，只有46.24 g/L，原因可能是有機氮源不足導(dǎo)致了菌體未能正常生長，限制了ε-PL的產(chǎn)生。而當(dāng)FM760質(zhì)量濃度提高至14.27 g/L時，ε-PL產(chǎn)量達(dá)到了67.02 g/L，但是菌體量達(dá)到了73.24 g/L，且在發(fā)酵中出現(xiàn)了供氧不足現(xiàn)象。因此，有機氮源FM760的最佳使用質(zhì)量濃度為9.27 g/L。

a-ε-聚賴氨酸;b-菌體干重;c-單位菌體合成能力;d-葡萄糖轉(zhuǎn)化率圖3 不同含量FM760對ε-PL補料分批發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of different concentrations of FM760 in the fed-batch fermentation of ε-PL

在發(fā)酵過程中監(jiān)控了不同濃度FM760發(fā)酵過程中發(fā)酵液中17種游離氨基酸的變化情況，結(jié)果如圖4所示。在發(fā)酵前24 h，菌體處于對數(shù)生長期，17種氨基酸均迅速被消耗至較低水平。在剩余發(fā)酵時間內(nèi)，谷氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和L-賴氨酸含量均處于較低水平，但會有一定上升趨勢，這可能和有機氮源中的大分子蛋白或多肽水解有關(guān)。值得注意的是，異亮氨酸濃度在發(fā)酵的大部分時間幾乎為零且未有上升趨勢，可能意味著異亮氨酸是限制發(fā)酵過程中菌體生長或ε-PL合成的因素。丙氨酸與亮氨酸在發(fā)酵中期的含量有上升趨勢，并在發(fā)酵后期降至低水平。ZHEN等[20]發(fā)現(xiàn)丙氨酸的添加會增加細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，而本團隊前期研究表明高水平活性氧會導(dǎo)致生產(chǎn)菌氧化損傷，進(jìn)而影響ε-PL的合成[12]；支鏈氨基酸亮氨酸會產(chǎn)生代謝反饋抑制[21]，一定程度上抑制了中間體丙酮酸的產(chǎn)生，影響ε-PL的產(chǎn)生。結(jié)合2.3中的差異氨基酸添加的實驗結(jié)果，較低含量的亮氨酸與丙氨酸可能更有利于ε-PL合成，但需要進(jìn)一步實驗驗證。

圖4 不同含量FM760對ε-PL發(fā)酵過程中胞外游離氨基酸的影響Fig.4 Effect of different concentrations of FM760 on the extracellular free amino acids during ε-PL fermentation

3 結(jié)論

本研究通過對有機氮源種類及含量進(jìn)行系統(tǒng)的優(yōu)化，最終從11種常見有機氮源中篩選出了一種最佳有機氮源——酵母浸粉FM760，最佳添加質(zhì)量濃度為9.27 g/L。利用此有機氮源，在搖瓶自然發(fā)酵中，ε-PL產(chǎn)量達(dá)到(2.60±0.02) g/L，較對照提高22.07%；在分批發(fā)酵中，ε-PL產(chǎn)量達(dá)到(6.41±0.23) g/L，較對照提高42.64%；在補料分批發(fā)酵中，ε-PL產(chǎn)量達(dá)到了62.38 g/L，相比于對照提高了18.80%，葡萄糖轉(zhuǎn)化率也提高了25.77%。通過分析FM760中氨基酸組成并結(jié)合氨基酸添加實驗，初步確定了FM760提高ε-PL產(chǎn)量可能與異亮氨酸、亮氨酸與丙氨酸含量有關(guān)，結(jié)果與廖麗娟等[22]研究相似。下一步，將圍繞3種氨基酸單獨或協(xié)同對ε-PL合成的影響，進(jìn)一步揭示其促進(jìn)ε-PL產(chǎn)量提高的原因。該研究結(jié)果對工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)ε-PL的有機氮源選擇具有重要指導(dǎo)意義。