過氧化氫酶對生長前期烏蘇里貉生長性能、消化代謝、血清生化和免疫指標的影響

■劉 欣 劉 云 李 虎 田建興 劉 日 魏夢凡 張海華*

(1.河北科技師范學院河北省特色動物種質資源挖掘與創(chuàng)新重點實驗室，河北 秦皇島 066600；2.遼寧威蘭生物技術有限責任公司，遼寧 沈陽110000)

烏蘇里貉作為我國三大主要毛皮動物之一，具有投資低、回本快的特點。據(jù)報道烏蘇里貉在生長期特別是生長前期有必要加強幼貉鈣、磷和蛋白質營養(yǎng)，以促進其骨骼和肌肉充分發(fā)育[1-2]。但是幼貉在快速發(fā)育的同時，體內產(chǎn)生很多的自由基，以及腸道系統(tǒng)的不完善，對飼糧中脂肪、蛋白質吸收不充分，易受到氧自由基的影響。氧自由基可對核酸、蛋白質等生物大分子進行攻擊破壞,致使機體受到損傷[3-5]。

過氧化氫酶（catalase，CAT）是一種酶類清除劑，普遍存在于能呼吸的生物體內，主要存在于植物的葉綠體、線粒體、內質網(wǎng)以及動物的肝和紅細胞中，其酶促活性為機體提供了抗氧化防御機理，與超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）共同組成了生物體內活性氧防御系統(tǒng)。前期研究表明，CAT 可以清除體內的自由基，對生長發(fā)育[6-8]、延緩衰老[9-10]、抗病[11-15]等均有很好的效果。目前，CAT 已作為飼料酶制劑應用于動物生產(chǎn)中，并對生長性能、營養(yǎng)物質消化率等方面有較好的促進作用[16-17]，但在烏蘇里貉上的應用報道較少。

本試驗以烏蘇里貉為研究對象，通過飼糧中添加不同水平的CAT，研究其對生長前期烏蘇里貉生長性能、營養(yǎng)物質消化率、血清生化指標、血清免疫指標的影響，確定CAT 的添加水平，為CAT 在貉生長養(yǎng)殖過程中提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試驗動物及分組

在河北華夏新農(nóng)科技股份公司昌黎莫各莊養(yǎng)殖場選取健康、體重相近的（60±5）d 的雄性烏蘇里貉60 只，將其分成4 組（1～4 組），每組15 只。各組間初重（IBW）差異不顯著（P＞0.05）。本試驗中使用的CAT由遼寧威蘭生物技術有限公司提供。

1.2 試驗設計及試驗飼糧

采用單因素隨機試驗設計，分為對照組和試驗組。對照組（1組）為基礎飼糧，試驗組是在基礎飼糧中分別添加CAT 0.10%（2組）、0.15%（3組）、0.20%（4組）。

參考NRC（1982）[18]以及生產(chǎn)試驗中飼喂效果較好的配方配制生長前期烏蘇里貉的基礎飼糧，其組成和營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平（風干基礎）

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗開始前對食盆和籠舍進行詳細消毒，按常規(guī)免疫程序對動物進行免疫。預試期7 d，正試期82 d，飼養(yǎng)試驗于2020年7月5日-2020年10月5日。采用單籠飼養(yǎng)，每天7：30 和15：30 定時定量飼喂，讓貉自由飲水，定期清潔籠舍。

1.4 消化代謝試驗和血清制備

代謝試驗于2020 年9 月3 日-2020 年9 月5 日進行，每組中分別選出采食與排便正常的貉各8 只，采用全收糞法收集糞尿。在每個收集桶內加入20 mL的10%的硫酸進行固氮，每天記錄貉的采食量。3 d之后將全部的糞樣和尿樣分別收集。將收集的尿樣混勻并過濾，放置在-20 ℃保存?zhèn)溆茫S樣稱重后按鮮重的5%噴灑10%的硫酸，65 ℃烘干至恒重，粉碎過40目篩，制成風干樣本，保存待測。

生長前期試驗結束后每組隨機選取8只貉，在空腹時后肢靜脈采血，用5 mL的促凝管收集血液，于離心機內4 000 r/min離心10 min，放置于-80 ℃保存，備用。

1.5 測定指標及方法

試驗開始和結束分別稱貉的空腹體重作為初重（IBW）和末重（FBW），計算平均日增重（ADG）、料重比（F/G）。統(tǒng)計試驗過程中的總采食量，并計算相應的平均日采食量（ADFI）。代謝試驗結束后，干物質（DM）、糞和尿中粗蛋白（CP）、粗脂肪（EE）均參照張麗英[19]方法測定，并計算營養(yǎng)物質消化率以及氮代謝相關指標。血清生化、免疫指標參照說明書通過VITAL-E全自動生化分析儀測定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用軟件SPSS 24 進行單因素方差分析（one-way ANOVA，Duncan’s 和Dunnett’s T3 多重比較檢驗），試驗結果差異顯著用P＜0.05來表示，差異極顯著用P＜0.01來表示，表中結果用“Mean±SD”的形式來表示。

2 結果與分析

2.1 CAT對生長前期烏蘇里貉生長性能的影響（見表2）

由表2 可知，在試驗結束時，2 組FBW 最大，2 組FBW、ADG 均顯著高于1 組（P＜0.05），F(xiàn)/G 顯著低于1組（P＜0.05）；2 組、3 組、4 組的FBW、ADG 呈現(xiàn)下降趨勢，F(xiàn)/G呈上升趨勢，但沒有顯著差異（P＞0.05）。

表2 CAT對生長前期烏蘇里貉生長性能的影響

2.2 CAT 對生長前期烏蘇里貉營養(yǎng)物質消化率的影響（見表3）

由表3 可知，各組間的ADFI、DM 消化率差異不顯著（P＞0.05）；2 組的CP 消化率極顯著高于1 組（P＜0.01）；EE 消化率方面，2 組與1 組、4 組之間差異極顯著（P＜0.01），3組和2組有顯著差異（P＜0.05）。

表3 CAT對生長前期烏蘇里貉營養(yǎng)物質消化率的影響

2.3 CAT對生長前期烏蘇里貉氮代謝的影響（見表4）

由表4可知，1組和2組在食入氮方面有顯著差異（P＜0.05）；各組間的糞氮、尿氮、氮沉積均沒有顯著差異（P＞0.05），但2、3、4組的尿氮含量均低于1組，氮沉積量均高于1組，其中2組氮沉積含量最高。

表4 CAT對生長前期烏蘇里貉氮代謝的影響(g/d)

2.4 CAT 對生長前期烏蘇里貉血清生化指標的影響（見表5）

由表5可知，1組的UREA顯著高于試驗2、3、4組（P＜0.05）；試驗1、4 組的ALP 與2、3 組有極顯著差異（P＜0.01）；1組的AST與其他幾組均有極顯著差異（P＜0.01），試驗3組與4組有極顯著差異（P＜0.01），與2組有顯著差異（P＜0.05）；3 組血清中ALT 含量與1 組差異顯著（P＜0.05），2 組與其他組之間均沒有顯著性差異（P＞0.05）；血清中CHO、GLU、TG、TP含量各組間均沒有顯著差異（P＞0.05）。

表5 CAT對生長前期烏蘇里貉血清生化指標的影響

2.5 CAT 對生長前期烏蘇里貉血清免疫指標的影響（見表6）

由表6 可知，3、4 組的IgA 含量與1 組相比差異極顯著（P＜0.01），3 組與2 組相比差異顯著（P＜5），1、2 組之間沒有顯著差異（P＞0.05）；2、4 組的含量極顯著高于其他各組（P＜0.01），且1 組與3組有極顯著性差異（P＜0.01）；1 組的LPS 含量極顯著高于2、3 組（P＜0.01），2、3、4 組之間差異不顯著（P＞0.05）；1 組的TNF-α含量與2、3、4 組之間均有極顯著性差異（P＜0.01），2 組和4 組之間有顯著性差異（P＜0.05）。

表6 CAT對生長前期烏蘇里貉血清免疫指標的影響

3 討論

3.1 CAT對生長前期烏蘇里貉生長性能的影響

作為第三代酶制劑代表之一的CAT 在細胞中促進H2O2分解，使其不會進一步產(chǎn)生毒性很大的氧自由基，從而保護抗氧化系統(tǒng)，因此具有抑制細胞凋亡、促進機體發(fā)育的作用[20]。研究表明，飼糧中添加CAT對動物的生長性能有很好的效果[6，21]。方銳[22]通過在飼料中添加外源性CAT，提高了斷奶仔豬的生長性能。研究發(fā)現(xiàn)CAT 的分布與動物的生長發(fā)育有關[7，23]，在幼體時期CAT的活性較高，且CAT在腸道中只能發(fā)揮作用，而不能被腸道所吸收。CAT符合誘導契合學說，當活性氧濃度一定時，CAT濃度過高會使與H2O2反應所形成的中間復合物增多，其活性降低[24-25]。本試驗結果顯示隨著CAT的濃度增加，貉體重呈現(xiàn)下降趨勢，是因為在CAT增加的同時，氧化還原體系中所形成的中間產(chǎn)物也隨之增多，導致CAT的活性降低，反而不利于機體的生長發(fā)育。本試驗結果表明，在本試驗條件下，添加0.1%的CAT提高了生長性能，降低料重比。

3.2 CAT對生長前期烏蘇里貉營養(yǎng)物質消化率的影響

營養(yǎng)物質的消化率體現(xiàn)了動物對飼料的利用效率，同時也是評價飼糧好壞的重要指標之一。營養(yǎng)物質的消化吸收是動物調節(jié)生理功能的基礎，營養(yǎng)物質消化率的提高對提高動物的生長性能有重要的意義。研究表明，添加一定劑量的CAT可以避免腸炎發(fā)生，提高了飼料的利用率，改善動物健康狀態(tài)[26]。

本試驗中試驗組的ADFI比對照組低、DM消化率比對照組高，但差異不顯著，說明在ADFI、DM消化率方面，飼糧中添加CAT 對生長前期烏蘇里貉影響較小。當機體受到應激時，腸黏膜屏障易受到氧活性物質的攻擊，導致腸黏膜屏障受損嚴重，而CAT 可以減少腸黏膜的活性氧，保護上皮細胞，減少細胞凋亡，抑制上皮細胞轉錄因子的活性[20，27]。本試驗中CAT提高了EE 的消化率，主要是因為CAT 可以有效消除腸道內多余的氧自由基，保護腸道，改善腸黏膜屏障，防止脂類物質過氧化，從而對脂類物質可以更好地吸收利用與轉化，這與方銳[22]的研究結果一致。隨著CAT增加，對EE的吸收呈下降趨勢。Lee等[12]發(fā)現(xiàn)通過增加CAT 活性可以減少蛋白羰基，從而減少對蛋白的氧化。本試驗中，飼糧中添加0.1%的CAT 提高了CP 消化率，可能通過減少蛋白質的氧化來提高蛋白質的消化率。試驗結果表明，在本試驗條件下，CAT 能夠顯著提高生長前期烏蘇里貉對EE 的消化吸收；添加0.1% CAT能極顯著提高CP消化率。

3.3 CAT對生長前期烏蘇里貉氮代謝的影響

氮代謝反映了貉對CP的利用率情況，機體對CP吸收的多少也影響著動物機體的健康狀況。食入氮的多少取決于動物的采食量。機體內自由基可以消耗體內的糖類物質，從而降低機體對氮的吸收[5]。研究發(fā)現(xiàn)，CAT可以激活斷奶仔豬消化道的消化酶活性，顯著提高淀粉酶的活性[16]。而淀粉酶的增加會顯著提高對氮的吸收利用，減少糞氮、尿氮的排放，從而減少氮對環(huán)境的污染[28]。而本試驗中，飼糧中添加CAT能夠減少生長前期貉對尿氮的排放，但是沒有統(tǒng)計意義。隨著CAT的水平上升，體內的氮沉積量呈先下降后上升的趨勢，表明一定濃度的CAT限制了對氮的沉積。本試驗結果顯示，飼糧中添加CAT可以減少對環(huán)境的氮污染。

3.4 CAT對生長前期烏蘇里貉血清生化指標的影響

UREA 通過動物機體中CP、氨基酸的代謝產(chǎn)生，主要經(jīng)尿道排出體外，血清中UREA的含量與動物體內的氮沉積和CP 利用率的關系呈負相關[29]。血清ALT 與AST 是反映動物肝臟功能是否正常的常用指標，肝細胞的細胞質含有大量的ALT 和AST，胞漿中其濃度是血清中濃度的1 000～3 000 倍，在肝細胞損傷后，ALT 與AST 通過細胞膜釋放進入血清，機體肝細胞受損程度越重，血清中ALT 與AST 含量越高[30]。研究發(fā)現(xiàn)自由基生成增多，導致肝組織脂質過氧化損傷[31-32]。本試驗中，2、3、4組的UREA較于對照組減少了18.74%、22.57%、19.01%。試驗1 組的AST 極顯著高于其他幾組，結果可能與CAT可以通過清除體內的氧自由基減輕氧自由基對肝細胞內細胞器結構的破壞有關。有研究表明ALP可以改變血管內穩(wěn)態(tài)，對腎功能有一定調節(jié)作用[33]。王切等[34]發(fā)現(xiàn)，CAT 對肝缺血再灌注中腎的功能受損發(fā)揮著一定的保護作用。本試驗中通過在飼糧中添加0.10%、0.15%的CAT 能極顯著降低血清中ALP的含量，因此對維持正常腎功能有一定保護作用。在本試驗條件下，飼糧中添加0.15%的CAT對肝功能、腎功能的保護作用最好。

3.5 CAT對生長前期烏蘇里貉血清免疫指標的影響

IgA、IgG 作用在多種免疫機制中，是體液免疫的主要效應因子[35]。王洪軍[36]研究表明，添加CAT 可以提高IgA、IgG含量，提高雞血清新城疫抗體水平，提高肉雞的免疫力。本試驗中并未發(fā)現(xiàn)疾病的感染，這表明在本試驗條件下，飼糧中添加0.15%和0.20% CAT可以極顯著提高血清中IgA 含量；飼糧中添加0.10%和0.20% CAT 可以極顯著增加血清中IgG 的含量。由于IgG在幼體抗感染免疫尤其是再次免疫應答中發(fā)揮重要作用，因此飼糧中添加0.1%和0.2% CAT 對促進生長前期的烏蘇里貉的免疫指標有重要作用。LPS脂多糖，又稱“內毒素”，是革蘭氏陰性細菌細胞壁外壁的組成成分。LPS是構建腸道炎癥較好的激活劑[37-39]。它很難從細胞壁脫落，當細菌死亡時它會通過溶解、破壞細胞來脫落，并通過作用于動物細胞等發(fā)揮其毒性。TNF-α是腫瘤壞死因子，可以促進T細胞產(chǎn)生各種炎癥因子，進而促進炎癥反應的發(fā)生。研究表明[40-43]，它可促進炎癥細胞因子的產(chǎn)生，引發(fā)炎癥反應。李威等[26]在CAT對斷奶仔豬的研究中發(fā)現(xiàn)，CAT可以顯著降低過敏指數(shù)，顯著提高抗過敏（炎癥）功能，與本試驗通過添加CAT可以減輕炎癥反應，提高機體的免疫力結果一致。王慧[27]研究表明，添加適量的CAT較高脂組可以顯著減少TNF-α含量，對降低LPS也有一定作用。本試驗生長前期烏蘇里貉的飼糧具有較高的脂肪含量，因此較對照組，其他幾組的TNF-α、LPS含量均表現(xiàn)為降低。并且在本試驗條件下，相較于濃度低的CAT 來說，CAT 濃度過高可能會導致炎癥的發(fā)生，影響機體健康。本試驗結果顯示，飼糧中添加CAT 能夠降低TNF-α、LPS 的含量，提高IgG，從而保護體內免疫系統(tǒng)。

4 結論

綜上所述，飼糧中添加適量的CAT能提高生長前期烏蘇里貉的生長性能、EE 消化率，改善血清指標，提高烏蘇里貉機體免疫力。本試驗條件下，在生長前期烏蘇里貉飼料中添加0.1% CAT，貉的生長性能顯著提高。