低水平縮合單寧對(duì)以豆粕和苜蓿為底物的體外發(fā)酵特性的影響

■黃小乘 劉思揚(yáng) 田怡豪 王宣力 李成云，2，3*

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉133002；2.中國(guó)延邊黃牛種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)利用學(xué)科創(chuàng)新引智基地，吉林 延吉133002；3.東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心，吉林 延吉133002）

縮合單寧（condensed tannins，CT）又稱(chēng)作原花色素，是羥基黃烷-3-醇和羥基黃烷-3，4-醇，通過(guò)C4-C8或C4-C6的C-C鍵縮合而成的縮合物[1]。當(dāng)瘤胃內(nèi)的酸堿度為5～7時(shí)，縮合單寧能夠與蛋白質(zhì)穩(wěn)定結(jié)合，形成不能被瘤胃微生物分解利用的縮合單寧-蛋白質(zhì)結(jié)合物，當(dāng)此結(jié)合物到達(dá)真胃（酸堿度為2.5）和小腸（酸堿度為8～9）時(shí)，會(huì)被真胃蛋白酶和胰蛋白酶快速分解，形成容易被機(jī)體吸收的小分子物質(zhì)，從而達(dá)到保護(hù)過(guò)瘤胃蛋白的作用[2]。添加低水平的縮合單寧有助于菌體蛋白的合成，提升進(jìn)入小腸中的非氨態(tài)氮物質(zhì)的含量，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能[3]。并且減少了瘤胃內(nèi)泡沫與氣體的生成，可以預(yù)防反芻動(dòng)物患瘤胃臌脹癥[4]。同時(shí)，縮合單寧能夠有效降低甚至抑制瘤胃內(nèi)蛋白質(zhì)分解菌群的生長(zhǎng)，降低蛋白質(zhì)分解菌的數(shù)量，達(dá)到保護(hù)過(guò)瘤胃蛋白的目的[5]。但這種效果和單寧濃度有關(guān)，單寧濃度過(guò)高可能影響到瘤胃降解率[6]。研究表明，當(dāng)飼喂的縮合單寧含量超過(guò)3%就可能降低山羊的采食量，影響飼料在瘤胃內(nèi)的降解和飼料的整體消化率，降低飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[7]。

現(xiàn)在的反芻動(dòng)物飼料中，豆粕是主要的氮源精飼料，苜蓿干草是主要的氮源粗飼料，在飼糧中添加縮合單寧可以達(dá)到改善發(fā)酵特性的目的[8]?？s合單寧對(duì)不同氮源飼料的作用效果有所差異，本研究分別以豆粕和苜蓿干草為底物，旨在探索在精飼料和粗飼料這兩種類(lèi)型的底物中，添加不同水平縮合單寧（0、0.3%、0.6%、0.9%）對(duì)延邊黃牛體外發(fā)酵特性的影響，以期篩選出豆粕和苜蓿干草的縮合單寧最佳添加比例，為在精飼料和粗飼料中添加縮合單寧調(diào)控反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

縮合單寧：純度為98%以上的分析純?cè)噭蓢?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

豆粕（soybean meal）：由延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供，經(jīng)過(guò)微型植物粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40 目篩，4 ℃避光保存，做好標(biāo)記備用。

苜蓿（Medicago sativa）：于2020 年9 月初在吉林省延邊朝鮮族自治州草原管理站采集樣品，用齊地面刈割法取樣，用保鮮盒帶回實(shí)驗(yàn)室冷凍干燥，粉碎后過(guò)40目篩，4 ℃避光保存，做好標(biāo)記備用。

消化袋：選用60 mm×90 mm，孔徑50 μm的尼龍袋。

體外培養(yǎng)瓶：500 mL的錐形瓶，開(kāi)口用橡膠塞密封并連接250 mL的玻璃注射器。

人工唾液組分：每10 L 純化水中添加NaHCO398 g、Na2HPO4·12H2O 93 g、NaCl 4.7 g、KCl 5.7 g、MgSO4·7H2O 1.2 g、無(wú)水CaCl20.4 g。先將除了無(wú)水CaCl2以外的其他溶劑溶于純化水中并稀釋至刻度，最后加入0.4 g無(wú)水CaCl2。人工唾液用來(lái)模擬牛口腔環(huán)境，主要模擬唾液中的無(wú)機(jī)成分，用于后續(xù)人工瘤胃營(yíng)養(yǎng)液的配制。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

在延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院牧場(chǎng)選用4 頭健康無(wú)病的延邊黃牛公牛，體重（405.1±22.9）kg，均安裝永久瘤胃瘺管。每日08：00、18：00進(jìn)行飼喂。常規(guī)光照，自由采食、飲水和活動(dòng)?；A(chǔ)飼糧按照美國(guó)NRC（2000）配制。試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)分別以豆粕和苜蓿干草為底物，分別添加不同水平（0、0.3%、0.6%、0.9%）縮合單寧，將0 添加（不添加縮合單寧）的設(shè)為對(duì)照組，0.3%、0.6%、0.9%添加水平的設(shè)為處理組，即：豆粕0.3%縮合單寧組，簡(jiǎn)稱(chēng)豆粕0.3%組；豆粕0.6%縮合單寧組，簡(jiǎn)稱(chēng)豆粕0.6%組；豆粕0.9%縮合單寧組，簡(jiǎn)稱(chēng)豆粕0.9%組；苜蓿0.3%縮合單寧組，簡(jiǎn)稱(chēng)苜蓿0.3%組；苜蓿0.6%縮合單寧組，簡(jiǎn)稱(chēng)苜蓿0.6%組；苜蓿0.9%縮合單寧組，簡(jiǎn)稱(chēng)苜蓿0.9%組。共8組，每組3個(gè)重復(fù)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 底物稱(chēng)量

準(zhǔn)確稱(chēng)取豆粕和苜蓿干草各2 g，分別加入不同水平的縮合單寧，以及0.10 g 玉米粉末（提供能量），混勻后放入帶有編號(hào)的消化袋里。再將消化袋分別置于有相應(yīng)編號(hào)的體外培養(yǎng)瓶中。

1.4.2 瘤胃液采集

在晨飼前用瘤胃抽取器經(jīng)瘤胃瘺管采集4 頭供試牛的瘤胃液各200 mL，用12層紗布過(guò)濾后，置于滅菌器皿中充分混合（整個(gè)過(guò)濾過(guò)程皆在39 ℃水浴鍋中進(jìn)行），并迅速放入39 ℃的保溫箱中帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.4.3 體外培養(yǎng)

體外培養(yǎng)參照Menke 等[9]的方法，并結(jié)合體外消化袋技術(shù)進(jìn)行體外發(fā)酵試驗(yàn)。瘤胃液與人工唾液按照1∶2 的比例（瘤胃液40 mL，人工唾液80 mL）混合，同時(shí)通入CO2并用磁力攪拌器攪拌，制成培養(yǎng)液。迅速將培養(yǎng)液置于按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)編號(hào)的體外培養(yǎng)瓶中（內(nèi)含相應(yīng)試驗(yàn)樣品底物），用橡膠塞密封，在39 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.5 發(fā)酵特性的測(cè)定

在發(fā)酵24 h 后，讀取玻璃注射器活塞處刻度值，記錄發(fā)酵產(chǎn)氣量；將瘤胃發(fā)酵液倒入100 mL的離心管中，立即用PHS-3C 型酸度計(jì)對(duì)發(fā)酵液pH 進(jìn)行測(cè)定；利用靛酚比色法測(cè)定氨態(tài)氮（NH3-N）的含量[10]；用氣相色譜外標(biāo)法測(cè)定揮發(fā)性脂肪酸（VFA）含量；利用三氯醋酸（TCA）沉淀蛋白法[11]測(cè)定微生物蛋白（MCP）的含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄和預(yù)處理，再用SPSS 19.0 進(jìn)行單因素分析，均值的多重比較采用LSD 和Duncan’s 法進(jìn)行分析，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 低水平縮合單寧對(duì)延邊黃牛體外發(fā)酵pH 的影響（見(jiàn)表2）

表2 低水平縮合單寧對(duì)延邊黃牛體外發(fā)酵pH的影響

從表2 可知，豆粕0.9%組pH 顯著低于豆粕對(duì)照組（P＜0.05）。豆粕0.3%組和豆粕0.6%組pH 與對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05）。苜蓿0.6%組與苜蓿0.9%組之間pH 差異不顯著（P＞0.05），但均顯著低于對(duì)照組和苜蓿0.3%組（P＜0.05）。隨著縮合單寧添加量的升高，pH 整體呈下降的趨勢(shì)，各處理組的pH 在正常范圍內(nèi)變化并且可以滿(mǎn)足瘤胃微生物正常代謝的需要。

2.2 低水平縮合單寧對(duì)延邊黃牛體外發(fā)酵總產(chǎn)氣量、NH3-N含量以及MCP含量的影響（見(jiàn)表3）

表3 低水平縮合單寧對(duì)延邊黃牛體外發(fā)酵總產(chǎn)氣量、NH3-N含量以及MCP含量的影響

由表3 可知，豆粕0.6%組與豆粕0.9%組之間總產(chǎn)氣量差異不顯著（P＞0.05），但均顯著低于豆粕對(duì)照組和豆粕0.3%組（P＜0.05）。苜蓿0.6%組與苜蓿0.9%組之間總產(chǎn)氣量差異不顯著（P＞0.05），但均顯著低于苜蓿對(duì)照組（P＜0.05）。各組發(fā)酵產(chǎn)氣量整體隨著縮合單寧添加水平的上升呈下降的趨勢(shì)。

豆粕0.3%組NH3-N含量與豆粕對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），豆粕其他各組NH3-N含量均與豆粕對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。苜蓿0.6%組相較于苜蓿對(duì)照組有所升高（P＞0.05）。不同氮源中添加低水平縮合單寧對(duì)延邊黃牛體外發(fā)酵NH3-N 含量的影響均在合理范圍內(nèi)，可以滿(mǎn)足瘤胃微生物正常生長(zhǎng)的需要。

豆粕各組之間體外發(fā)酵MCP 含量差異不顯著（P＞0.05）。苜?？s合單寧添加組體外發(fā)酵MCP 含量均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），且各縮合單寧添加組之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 低水平縮合單寧對(duì)延邊黃牛體外發(fā)酵VFA含量的影響（見(jiàn)表4）

表4 低水平縮合單寧對(duì)延邊黃牛體外發(fā)酵VFA含量的影響

由表4 可知，豆粕0.9%組TVFA 含量顯著低于豆粕對(duì)照組（P＜0.05）。豆粕縮合單寧添加組乙酸含量顯著低于豆粕對(duì)照組（P＜0.05），各添加組之間差異不顯著（P＞0.05）。TVFA和乙酸含量隨著縮合單寧添加量的增多，整體呈下降的趨勢(shì)。豆粕縮合單寧添加組丙酸含量與豆粕對(duì)照組相比差異不顯著（P＞0.05），且隨著縮合單寧添加量的增多，整體呈上升的趨勢(shì)。豆粕0.9%組丁酸含量顯著低于豆粕對(duì)照組（P＜0.05）。豆粕縮合單寧添加組乙酸/丙酸值隨著縮合單寧添加量的增多呈下降的趨勢(shì)。

苜蓿0.9%組TVFA含量和乙酸含量均顯著低于苜蓿對(duì)照組（P＜0.05）。從整體上來(lái)看，隨著縮合單寧添加量的增加，苜蓿各組TVFA 和乙酸含量呈下降的趨勢(shì)，丙酸的含量隨縮合單寧添加量的增多而增加，苜蓿0.9%組與苜蓿對(duì)照組之間差異顯著（P＜0.05）?？s合單寧量的添加對(duì)丁酸含量的影響較小，苜蓿各組之間均與苜蓿對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。乙酸/丙酸值隨著縮合單寧量的添加整體呈下降趨勢(shì)。

3 討論

3.1 低水平縮合單寧對(duì)延邊黃牛體外發(fā)酵pH的影響

pH 是反映瘤胃發(fā)酵水平的一項(xiàng)重要指標(biāo)，它能綜合反映出瘤胃微生物的代謝產(chǎn)物中產(chǎn)生、吸收、排除及中和有機(jī)酸的狀況[12]。據(jù)研究表明，瘤胃pH 正常范圍在5.00～7.50[13]，在本試驗(yàn)中，各處理組的瘤胃液pH 均為弱酸性，保持在有利于瘤胃微生物正?；顒?dòng)的范圍內(nèi)。含氮量高的豆粕組pH 相對(duì)較低，相比之下，苜蓿組在縮合單寧添加水平相同時(shí)pH 高于豆粕組，這可能與二者含氮量或者含有的蛋白質(zhì)種類(lèi)不同有關(guān)[14]。0.9%縮合單寧添加組的pH均顯著低于各自對(duì)照組，可能因?yàn)楸驹囼?yàn)中0.9%縮合單寧添加水平對(duì)瘤胃微生物菌群起到了調(diào)控作用，抑制了瘤胃微生物的生長(zhǎng)及微生物酶的活性，從而影響瘤胃正常發(fā)酵[5]。王衛(wèi)云[15]也曾得出相似結(jié)論，即不同濃度的單寧對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用，且抑制效果與縮合單寧濃度成正比。

3.2 低水平縮合單寧對(duì)延邊黃牛體外發(fā)酵總產(chǎn)氣量、NH3-N含量以及MCP的影響

產(chǎn)氣量是研究反芻動(dòng)物的瘤胃發(fā)酵試驗(yàn)中重要的指標(biāo)之一，產(chǎn)氣量的多少在一定程度上可以反映出瘤胃微生物活性的高低和飼料中有機(jī)物的發(fā)酵程度[16]。當(dāng)反芻動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)氣量過(guò)高時(shí)，會(huì)對(duì)動(dòng)物的健康有不利影響，增加瘤胃膨脹病的患病概率。在本試驗(yàn)中，隨著縮合單寧水平的增加，微生物活性被抑制的程度也不斷增強(qiáng)，縮合單寧添加量越大，產(chǎn)氣量越低。說(shuō)明縮合單寧可降低發(fā)酵底物的降解率，從而控制瘤胃發(fā)酵氣體的產(chǎn)生[17]。在同一縮合單寧添加水平下苜蓿組的產(chǎn)氣量均低于豆粕組，其主要原因可能是兩種飼糧中含氮量的不同，縮合單寧與氮的結(jié)合影響了總產(chǎn)氣量[18]。

NH3-N 的含量在一定的程度上反映出了瘤胃微生物對(duì)含氮物質(zhì)進(jìn)行分解后產(chǎn)生氨的速度，以及瘤胃微生物對(duì)含氮物質(zhì)的攝取和利用情況。NH3-N 含量過(guò)高可以在一定程度上說(shuō)明瘤胃中有較多的粗蛋白被降解，如果微生物不能夠完全利用，過(guò)量的NH3-N就會(huì)被浪費(fèi)，使得飼料利用率降低。如果NH3-N含量過(guò)低可能說(shuō)明過(guò)瘤胃蛋白在一定程度上有所增加，但可能造成氮的供應(yīng)無(wú)法滿(mǎn)足微生物對(duì)氮的需求，所以保持NH3-N 含量在一定范圍內(nèi)是維持瘤胃正常發(fā)酵的關(guān)鍵[19]。本試驗(yàn)中，苜蓿組隨著縮合單寧添加量的增多，NH3-N 含量變化不顯著。前人研究表明，將含有高濃度縮合單寧的紅豆草干草飼喂山羊，能使其瘤胃中NH3-N 的濃度顯著降低[20]。由此可知高濃度的縮合單寧對(duì)降低瘤胃NH3-N 含量具有顯著效果[21]。但在本試驗(yàn)中這種效果并不明顯，這可能是因?yàn)榭s合單寧的種類(lèi)和添加濃度不同。

反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)的MCP 含量是對(duì)評(píng)價(jià)反芻動(dòng)物機(jī)體營(yíng)養(yǎng)吸收水平以及動(dòng)物生產(chǎn)性能的重要指標(biāo)之一。反芻動(dòng)物瘤胃中的MCP 的合成量在一般情況下是相對(duì)穩(wěn)定的，它完全可以滿(mǎn)足育肥反芻動(dòng)物的中產(chǎn)產(chǎn)肉量和低產(chǎn)產(chǎn)肉量對(duì)蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的需要。但是對(duì)高產(chǎn)的反芻動(dòng)物來(lái)說(shuō)，如果只是依靠瘤胃菌體蛋白所提供的氨基酸并不能滿(mǎn)足高產(chǎn)反芻動(dòng)物在生產(chǎn)中對(duì)蛋白質(zhì)的需要量，必須要依靠增加過(guò)瘤胃蛋白的量才能夠保證其正常的生產(chǎn)[22]。本試驗(yàn)中，豆粕組和苜蓿組中MCP的含量隨著縮合單寧的添加量增多呈下降趨勢(shì)，且在苜蓿組中效果顯著，這說(shuō)明添加高水平縮合單寧對(duì)蛋白質(zhì)起到了保護(hù)作用，在一定的程度上降低了微生物氮合成，使得微生物蛋白合成量和生產(chǎn)效率降低[23]。

3.3 低水平縮合單寧對(duì)延邊黃牛體外發(fā)酵VFA含量的影響

飼料中的碳水化合物是動(dòng)物機(jī)體能量的主要來(lái)源，而在反芻動(dòng)物瘤胃中，有55%～95%的碳水化合物經(jīng)瘤胃微生物的降解，生成葡萄糖、果糖、木糖等，經(jīng)酵解轉(zhuǎn)化成丙酮酸后進(jìn)一步分解成VFA和ATP[24]。在瘤胃快速發(fā)酵時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的TVFA。如果瘤胃內(nèi)產(chǎn)生的TVFA過(guò)量，超過(guò)了瘤胃絨毛的吸收能力，TVFA會(huì)在瘤胃內(nèi)累積，降低瘤胃pH，引起奶牛亞急性酸中毒[25]。而縮合單寧有抑制瘤胃微生物生長(zhǎng)以及抵抗生物降解的能力，所以瘤胃細(xì)菌、原蟲(chóng)和真菌等微生物對(duì)粗纖維、淀粉等碳水化合物的降解也被抑制，TVFA的濃度降低，可以有效預(yù)防反芻動(dòng)物瘤胃酸中毒[26]。Slianikove等[27]的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，給反芻動(dòng)物飼喂棟樹(shù)、白堅(jiān)木等含有縮合單寧的植物，其瘤胃中TVFA的含量降低，可減少反芻動(dòng)物對(duì)VFA 快速升高而引起的不適。本次試驗(yàn)的結(jié)果顯示，豆粕和苜?？s合單寧添加組隨著縮合單寧添加量的增加，TVFA和乙酸的含量降低，丙酸的含量增加，在縮合單寧添加量為0.9%時(shí)達(dá)到最適要求。Ngamsaeng等[28]也得出相似的結(jié)果。

4 結(jié)論

綜上所述，各處理組的pH在正常范圍內(nèi)變化，均可以滿(mǎn)足瘤胃微生物正常代謝的需要。豆粕0.9%組、苜蓿0.9%組顯著降低了總產(chǎn)氣量，對(duì)瘤胃膨脹病的預(yù)防有一定的作用；顯著降低了TVFA的含量，可以有效預(yù)防瘤胃酸中毒；并且使MCP 降低，對(duì)于過(guò)瘤胃蛋白的保護(hù)具有一定效果。