p38MAPK信號(hào)通路誘發(fā)糖尿病腎病的研究進(jìn)展

盧奇奇 余超 汪志平

(浙江大學(xué)原子核農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部核農(nóng)學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310058)

據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)，2025年全球糖尿病患者將增至3億人，其中75%將分布在中國(guó)、印度等發(fā)展中國(guó)家。糖尿病腎病(DN)作為糖尿病的最常見(jiàn)并發(fā)癥，已成為引起老年人慢性腎衰竭的重要病因之一〔1，2〕。DN占終末期腎衰竭患者的比例在美國(guó)居第一位、在歐洲居第二位，在我國(guó)也已上升至15%〔1～3〕。DN病理上表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)積聚、基底膜增厚、腎小球肥大和硬化、腎間質(zhì)纖維化等。DN的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，至今尚未能全面解析，但眾多研究與臨床實(shí)踐已表明，持續(xù)高血糖狀態(tài)引起的代謝紊亂是DN發(fā)生的最主要誘因〔1，3〕。DN的發(fā)生涉及多樣而復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)通路系統(tǒng)，如p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、Wnt/β-連環(huán)蛋白、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β/Smad蛋白(TGF-β/Smad)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶β(PI3K/Akt)信號(hào)通路等?？刂蒲鞘穷A(yù)防與治療DN的基礎(chǔ)〔1，2〕。桑葉、絞股藍(lán)、黃芪、人參、地骨皮、黃連等中草藥具有良好的降血糖功效〔4〕，且在控制血糖方面表現(xiàn)出多功能、多靶點(diǎn)、低毒副作用、安全可靠、作用溫和持久等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，能有效減緩DN的發(fā)生〔5〕。本文綜述了基于p38MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)DN發(fā)生的細(xì)胞分子生物學(xué)機(jī)制，并概述了20余味中草藥通過(guò)干預(yù)p38MAPK信號(hào)通路減緩DN發(fā)生的研究進(jìn)展。

1 p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

1.1p38MAPK信號(hào)通路 MAPK是一系列絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶家族，主要包括p38MAPK、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、應(yīng)激活化蛋白激酶(SAPK)。MAPK信號(hào)通路的基本組成是經(jīng)典的三級(jí)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAPKKK)、促分裂原活化蛋白激酶(MAPKK)和MAPK，這3種激酶能依次激活，使靶蛋白磷酸化并活化，激活下游信號(hào)通路，共同調(diào)節(jié)著細(xì)胞增殖、分化、凋亡、炎癥反應(yīng)等多種重要的生理病理過(guò)程〔6〕。

p38MAPK是MAPKs家族的重要成員，由Brewster等〔7〕于1993年首次發(fā)現(xiàn)。p38由360個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為38 kD〔8〕。p38有α、β、γ、δ 4種亞型，其中p38α和p38β又各含2種異構(gòu)體。Goedert等〔9〕發(fā)現(xiàn)p38α幾乎分布于所有的細(xì)胞和組織；p38β主要分布于大腦；p38γ主要分布于骨骼?。籶38δ主要分布于內(nèi)分泌腺；組織表達(dá)特異性及其結(jié)構(gòu)的差異性決定了不同亞型的p38擁有不同的結(jié)合底物。p38MAPK在腎臟細(xì)胞的分布情況研究中，Sakai等〔10〕發(fā)現(xiàn)其分布在腎小管的上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和足細(xì)胞中。Omori等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)p38MAPK在腎臟發(fā)育早期呈高表達(dá)，而在腎臟發(fā)育成熟期表達(dá)顯著減少，早期時(shí)p38MAPK主要在輸尿管芽細(xì)胞與腎臟芽細(xì)胞中豐富表達(dá)，腎小球中表達(dá)微弱。成熟期時(shí)其僅在腎小球臟層上皮、集合管和遠(yuǎn)端腎小管表達(dá)。

1.2p38MAPK信號(hào)通路的活化 高血糖、晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)、活性氧(ROS)、炎癥因子、細(xì)胞張力、TGF-β1、血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮素-1等多種外界刺激因子可以刺激p38MAPK的活化。p38MAPK的激活也是經(jīng)典的三級(jí)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng)，MAPK活化后，催化MAPK活化環(huán)內(nèi)的兩個(gè)蘇氨酸或絲氨酸磷酸化，隨即MAPK催化靶向MAPK保守區(qū)T-X-Y模塊內(nèi)的酪氨酸和蘇氨酸殘基同時(shí)磷酸化，最后MAPK將下游底物如磷脂酶A2、細(xì)胞周期素D1、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制物、轉(zhuǎn)錄因子、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白，p53和肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A等磷酸化〔12，13〕，激活相關(guān)信號(hào)通路，將細(xì)胞外刺激信號(hào)傳遞至細(xì)胞核，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡等〔14〕。

2 p38MAPK信號(hào)通路與DN

p38MAPK在DN發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，通過(guò)激活不同下游因子影響著腎細(xì)胞的功能，主要有促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，引起腎組織炎癥損傷；調(diào)節(jié)基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)CECM合成或者抑制ECM降解，導(dǎo)致腎系基底膜增厚，腎間質(zhì)纖維化；調(diào)控細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)以促進(jìn)細(xì)胞增殖，引起腎體積肥大，腎小球硬化等〔6〕。

2.1p38MAPK影響核因子(NF)-κB 炎癥是導(dǎo)致DN的重要機(jī)制，p38MAPK信號(hào)通路是DN發(fā)病機(jī)制中參與并激活巨噬細(xì)胞，發(fā)動(dòng)組織炎癥反應(yīng)的重要途徑〔15〕。DN發(fā)生時(shí)有大量的炎性細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞等和促炎細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ等產(chǎn)生，Eizirik等〔16〕認(rèn)為這些炎性細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子在p38MAPK-NF-κB介導(dǎo)的促炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡途徑中作用顯著。

NF-κB是許多信號(hào)通路和基因表達(dá)途徑的轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB家族蛋白可分為RelA、RelB、C-Rel、P52和P50五種，主要以二聚體形式存在，其中P52和P50各自的二聚體作為一種抑制分子，在細(xì)胞內(nèi)一般各自以P100、P105的前體形式存在〔15〕。NF-κB發(fā)揮生物學(xué)活性的主要種類是RelA、P50。一般情況下，NF-κB存在于細(xì)胞質(zhì)中，與其抑制蛋白(I-κB)結(jié)合并以三聚體形式存在，呈現(xiàn)不活躍狀態(tài)。NF-κB家族主要參與促使炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生、激活細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而引起腎小球損傷并硬化等〔17〕。

如圖1通路1所示，高血糖、AGEs、ROS、細(xì)胞因子等外界因素可以刺激p38MAPK的活化?；罨膒38MAPK激活NF-κB二聚體，然后NF-κB易位進(jìn)入細(xì)胞核，與DNA上的κB位點(diǎn)結(jié)合，轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)基因表達(dá)程序，調(diào)節(jié)炎性因子的表達(dá)〔18〕。NF-κB會(huì)上調(diào)炎癥因子如IFN-γ誘導(dǎo)蛋白(IP)-10和IL-15等的表達(dá)，并將單核-巨噬細(xì)胞等吸引到炎癥部位誘發(fā)組織炎癥。張曉雪等〔19〕研究發(fā)現(xiàn)高血糖可以促進(jìn)p38MAPK磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)腎小球內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)并分泌 IL-6 、TNF-α，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)顯示，與對(duì)照組相比，20.0 mmol/L及40.0 mmol/L高糖組的腎小球內(nèi)皮細(xì)胞分泌的炎性因子 IL-6 及TNF-α顯著增加(均P<0.05)，且40.0 mmol/L 高糖組效果更顯著。余學(xué)清等〔20〕發(fā)現(xiàn)采用脂多糖(LPS) 可以刺激腎系膜細(xì)胞 p38MAPK的磷酸化，p38MAPK 在被LPS刺激 5 min 后活性逐漸升高，30 min達(dá)到活性高峰，且炎癥因子IL-1β 在 3 h 后 的mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高。p38MAPK-NF-κB途徑會(huì)產(chǎn)生大量炎癥因子損壞腎組織，同時(shí)這些炎癥因子又反激活p38MAPK，再一次促進(jìn)炎癥途徑的發(fā)生以產(chǎn)生大量炎癥因子，使炎癥信號(hào)不斷被放大、積累，惡性循環(huán)地加重腎組織炎癥損傷〔21〕。

炎癥引起DN的過(guò)程中，除了炎性因子IL-6 及TNF-α等作用外，單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1和骨橋蛋白(OPN)也起到了不可忽視的作用，這兩種介質(zhì)主要通過(guò)誘導(dǎo)單核-巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)腎組織，促進(jìn)炎癥的發(fā)生。張寧〔22〕研究發(fā)現(xiàn)，p38MAPK-NF-κB通路可以直接上調(diào)OPN mRNA 、MCP-1 mRNA 的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)擴(kuò)散。此外，p38MAPK誘導(dǎo)NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核后，還可以促使誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)基因的表達(dá)，促進(jìn)一氧化氮(NO)的生成，導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至凋亡〔23〕。

2.2p38MAPK與TGF-β1 DN發(fā)生過(guò)程中的另一個(gè)顯著特征是ECM蛋白如膠原蛋白和纖維連接蛋白(FN)等的形成。高血糖等因素可以刺激腎小球系膜基質(zhì)中FN和膠原蛋白在系膜和腎小管間質(zhì)中的過(guò)度生成與積累，這會(huì)導(dǎo)致上皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變，最終細(xì)胞纖維化〔24〕。TGF-β1參與調(diào)控ECM合成〔25，26〕，促進(jìn)腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，從而加速糖尿病進(jìn)程，大量的體外研究表明TGF-β1是最強(qiáng)的促纖維化關(guān)鍵細(xì)胞因子。哺乳動(dòng)物中TGF-β有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三種亞型，其中TGF-β1最為常見(jiàn)，且在腎間質(zhì)纖維化中具有重要作用。TGF-β1誘導(dǎo)FN、Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原等ECM的合成，同時(shí)抑制其降解，是誘導(dǎo)腎間質(zhì)纖維化發(fā)生的重要原因之一。

Jiang等〔27〕已證實(shí)TGF-β1是p38MAPK的上游調(diào)節(jié)因子。一般情況下，TGF-β1 蛋白N端的二聚體潛在相關(guān)肽(LAP)以非共價(jià)形式與C端的二聚體成熟型TGF-β1相連，再與TGF-β1 結(jié)合蛋白(LTBP)相結(jié)合并以非活性狀態(tài)存在。當(dāng)受到高糖、氧化應(yīng)激等刺激時(shí)，TGF-β1經(jīng)蛋白酶切去N-末端的相關(guān)肽，復(fù)合物瓦解并釋放具有生物活性的TGF-β1〔28〕，活化的TGF-β1與受體TβRⅠ、TβRⅡ型結(jié)合形成TβRⅡ-TGF-β1-TβRⅠ三聚體復(fù)合物，進(jìn)而發(fā)揮生物活性。在建立的DN小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)血糖值與TGF-β1呈正相關(guān)關(guān)系〔29〕。一方面，如圖1通路2所示，由高血糖、氧化應(yīng)激激活的TGF-β1-p38MAPK信號(hào)通路可進(jìn)一步上調(diào)FN的表達(dá)〔30，31〕。在FN基因啟動(dòng)子的核苷酸位置-170處有一個(gè)磷酸化環(huán)腺苷單磷酸反應(yīng)元件(CRE)調(diào)控元件，被TGF-β1激活的p38MAPK CRE結(jié)合蛋白(CREB)〔32，33〕，磷酸化的CREB再進(jìn)入細(xì)胞核與CRE相互作用，增強(qiáng)FN mRNA的表達(dá)，最終導(dǎo)致系膜細(xì)胞產(chǎn)生大量FN，F(xiàn)N是ECM的重要組成部分，主要位于腎小球系膜基質(zhì)、腎小球基底膜及其與腎小球細(xì)胞的連接處，F(xiàn)N的增加會(huì)引起腎系基底膜的增厚，使腎小球硬化，嚴(yán)重則會(huì)導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化，加速DN發(fā)展。p38MAPK 與TGF-β1的作用是相互的，TGF-β1可以激活p38MAPK發(fā)揮其作用，p38MAPK也可以影響TGF-β1的生成，進(jìn)一步影響DN的進(jìn)程〔34〕。另一方面，活化的TGF-β1通過(guò)激活p38MAPK信號(hào)通路〔28〕，還能引起下游NF-κB活化，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，促使大量炎癥因子的生成，如IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α等，造成腎臟足細(xì)胞損傷與凋亡。

2.3p38MAPK影響早期生長(zhǎng)反應(yīng)蛋白(Egr)1 腎小球系膜細(xì)胞是腎臟細(xì)胞中的主要類型之一，高糖、血管緊張素Ⅱ和細(xì)胞因子等因素可以刺激系膜細(xì)胞的增殖。系膜細(xì)胞增殖是DN發(fā)生早期病理生理機(jī)制的重要誘因，最終會(huì)導(dǎo)致患者機(jī)體慢性腎衰竭〔35〕。因此，抑制系膜細(xì)胞增殖被認(rèn)為是預(yù)防和改善DN的途徑之一。

Egr1是屬于鋅指家族的轉(zhuǎn)錄因子，參與了多種重要的病理生理基因的激活〔36〕。Egr1在高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞增殖、腎纖維化及腎小球硬化中起關(guān)鍵作用〔37，38〕。Egr1表達(dá)受p38MAPK的激活調(diào)控〔36，39〕。

如圖1通路3所示，溶血磷脂酸(LPA)可通過(guò)激活p38MAPK增加系膜細(xì)胞中Egr1的表達(dá)，活化的Egr1隨即進(jìn)入細(xì)胞核與細(xì)胞增殖相關(guān)的啟動(dòng)子Kruppel樣因子(KLF)5上的專一位點(diǎn)結(jié)合〔36，40〕。KLF5可以直接調(diào)控p27Kip1 mRNA水平〔41，42〕，p27Kip1為細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子，在調(diào)控細(xì)胞周期中具有重要作用。Liu等〔43〕發(fā)現(xiàn)在高糖刺激的DN大鼠模型的系膜細(xì)胞中檢測(cè)到p27Kip1表達(dá)下調(diào)。此外經(jīng)過(guò)增強(qiáng)p27Kip1表達(dá)的藥物處理的系膜細(xì)胞中表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗增殖活性〔44，45〕。正常生理狀態(tài)下，周期蛋白(Cyclin)D1-細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)4復(fù)合物往往與p27Kip1緊密結(jié)合，處于非活性狀態(tài)，抑制細(xì)胞的分裂與增殖〔46，47〕。CyclinD1與CDK4參與了G1/S期細(xì)胞增殖的調(diào)控機(jī)制，它們的過(guò)度表達(dá)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的分裂與增殖〔48〕。Kim等〔40〕研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPA處理的DN小鼠系膜細(xì)胞和腎臟皮質(zhì)中KLF5 mRNA及其蛋白表達(dá)水平均升高；KLF5表達(dá)下調(diào)可增加p27Kip1的表達(dá)，進(jìn)而抑制LPA引起的系膜細(xì)胞增殖作用；KLF5可直接降低p27Kip1的表達(dá)，上調(diào)CyclinD1與CDK4的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致系膜細(xì)胞過(guò)度增殖，腎小球硬化，加速DN病理進(jìn)程。

MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶；TIMP：MMP組織抑制劑圖1 p38MAPK介導(dǎo)的DN發(fā)生的信號(hào)通路及相關(guān)中草藥活性成分的作用位點(diǎn)

2.4p38MAPK影響MMPs MMPs是一類Mg2+、Zn2+依賴蛋白，屬于肽鏈內(nèi)切酶家族。MMPs往往由5個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成，即疏水信號(hào)肽序列、前肽區(qū)、催化活性區(qū)、富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)與羧基末端區(qū)〔49〕。目前已鑒別出的MMPs有20余種，并根據(jù)其底物特異性分為六類，即膠原酶、明膠酶、基質(zhì)降解素、間質(zhì)降解素、膜型基質(zhì)、其他MMPs。MMPs主要參與腎細(xì)胞ECM降解、轉(zhuǎn)運(yùn)，在正常生理狀態(tài)下，它能與其內(nèi)源性TIMPs調(diào)節(jié)腎細(xì)胞ECM合成與降解的動(dòng)態(tài)平衡，從而保護(hù)腎細(xì)胞并維持其正常功能〔50〕。

研究表明，某些類型MMPs的活性受p38MAPK調(diào)節(jié)。聶春巖〔51〕發(fā)現(xiàn)在高糖誘導(dǎo)的DN小鼠模型中，其系膜細(xì)胞p38MAPK與TIMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)水平升高，而MMP-2 mRNA及其蛋白表達(dá)水平降低，且MMP-2/TIMP-2比值減小，與高糖濃度變化呈一定的依賴性，通過(guò)添加p38MAPK抑制劑SB203580可以逆轉(zhuǎn)MMP-2、TIMP-2 mRNA及其蛋白表達(dá)水平；郭娟娟〔52〕發(fā)現(xiàn)高糖可以誘導(dǎo)DN小鼠p38MAPK信號(hào)通路活化，從而使系膜細(xì)胞表達(dá)MMP-9與TIMP-1 mRNA平衡改變，MMP-9/TIMP-1比值減小，減少腎細(xì)胞ECM的降解，引起ECM大量聚集，加速DN進(jìn)程。

3 基于p38MAPK活性調(diào)控減緩DN發(fā)生的主要中草藥

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，一些中草藥對(duì)p38MAPK活性具有顯著的抑制作用，并可有效降低甚至阻止DN的發(fā)生。見(jiàn)圖1。

黃酮類物質(zhì)中，金銀花提取物的綠原酸及金柚提取物的黃酮類化合物能通過(guò)抑制p38MAPK介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)途徑，減少腎組織中巨噬細(xì)胞表達(dá)，降低炎癥因子表達(dá)，從而阻止DN發(fā)展〔53，54〕；洋蔥、橙子、歐芹等中的芹黃素，可通過(guò)抑制p38MAPK-NF-κB-TNF-α和TGF-β1-p38MAPK-CREB通路，減少細(xì)胞凋亡、腎組織炎癥和纖維化，從而減輕DN癥狀〔55〕；黃芩中的黃芩素可通過(guò)抑制p38MAPK 磷酸化、氧化-硝化應(yīng)激等途徑，抑制DN發(fā)生及惡化〔56〕；葛根中的葛根素可通過(guò)降低 TGF-β1的表達(dá)抑制p38MAPK活性，進(jìn)而抑制DN〔57〕。

生物堿類物質(zhì)中，蛹蟲(chóng)草、冬蟲(chóng)夏草中的蟲(chóng)草素，能抑制高糖介導(dǎo)的 p38MAPK 的磷酸化及 TGF-β1 的表達(dá)，減輕腎組織纖維化癥狀〔58〕；川芎、溫莪術(shù)等中的川芎嗪，可抑制p38MAPK、ERK1/2磷酸化，減少炎癥因子，減輕DN癥狀〔59〕。

多糖類物質(zhì)中，黃芪多糖可通過(guò)抑制p38MAPK-NF-κB通路，減少細(xì)胞凋亡、腎組織炎癥和纖維化，從而減輕DN癥狀〔60〕；枸杞多糖可抑制p38MAPK信號(hào)通路，減輕DN癥狀〔61〕；山藥多糖可下調(diào)高糖激活的p38MAPK-CREB信號(hào)通路，減少腎ECM積聚，減輕腎臟纖維化程度，保護(hù)腎功能〔62〕。

酚酸類物質(zhì)中，雷公藤和南蛇藤中的雷公藤紅素，可通過(guò)抑制p38MAPK-NF-κB通路，減少炎癥因子的產(chǎn)生，減輕DN癥狀〔63〕；五倍子、漆樹(shù)、茶等中的沒(méi)食子酸，可抑制p38MAPK磷酸化，降低DN的發(fā)生進(jìn)程〔64〕。多酚類物質(zhì)中，花生、葡萄、虎杖、桑椹中的白藜蘆醇，可通過(guò)抑制p38MAPK磷酸化，減少 TGF-β1的表達(dá)來(lái)減少腎纖維化〔65〕。

此外，蒽醌類物質(zhì)中，虎杖中的大黃素，可通過(guò)與p38MAPK結(jié)合抑制其活性，減緩DN進(jìn)程〔66〕。核桃中所含的蒽醌類等物質(zhì)，具有顯著的降血糖作用，能有效防止DN發(fā)生或減緩病變進(jìn)程〔67，68〕。