甲狀旁腺激素對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠骨密度和骨生物力學(xué)的影響

葉維建 李國山 黃建芳

(1莆田學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建 莆田 351100；2國控醫(yī)療涵江醫(yī)院骨科；3莆田市第一醫(yī)院影像科)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(PMOP)是指絕經(jīng)后中老年婦女卵巢功能衰退，雌激素分泌下降，骨形成減少，骨吸收增強(qiáng)，骨代謝失衡，出現(xiàn)的以骨量減少、骨強(qiáng)度降低、骨微結(jié)構(gòu)退行性改變、骨脆性增加、易于骨折為特征的一種代謝性骨疾病，又稱高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松〔1，2〕。雌激素缺乏是PMOP的主要原因，雌激素替代療法(ERT)已被證實(shí)能有效預(yù)防PMOP的發(fā)生，但長期應(yīng)用ERT也引發(fā)了一些不良反應(yīng)〔3〕。甲狀旁腺激素(PTH)作為調(diào)節(jié)鈣、磷代謝水平的生物活性物質(zhì)，可調(diào)節(jié)骨的合成和分解代謝，對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化、成熟、凋亡發(fā)揮重要作用〔4〕。而PTH防治PMOP以其安全、毒副作用小、全身整體調(diào)節(jié)等特點(diǎn)，在治療上有較大優(yōu)勢(shì)。本研究探討PTH對(duì)PMOP大鼠骨密度(BMD)及骨生物力學(xué)的影響及其潛在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)雌性Wistar大鼠58只，16周齡，未孕，體重(250±20)g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(許可證號(hào)：SCXK(京)2014-0004)，所有大鼠飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學(xué)通風(fēng)良好的SPF級(jí)動(dòng)物房，同等條件常規(guī)喂養(yǎng)：1～2只/籠，溫度(22±2)℃，濕度(55±5)%，光照明暗各12 h/d，自由取食和飲水。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 重組人PTH1-34(100 μg/支，批號(hào)：J201708072，美國Sigma公司)，骨化三醇軟膠囊(蓋三淳，0.25 μg×10粒，生產(chǎn)批號(hào)：1800621，正大制藥青島有限公司)。Lunari DXA型雙能X射線BMD檢測(cè)儀(美國GE公司)，多功能自動(dòng)染色機(jī)和全自動(dòng)組織脫水機(jī)(德國Leica公司)，便攜式電子天平NVC4201E〔奧豪斯儀器(上海)有限公司〕，微機(jī)控制電子萬能試驗(yàn)機(jī)(中國瑞格爾公司)。

1.3制備PMOP大鼠模型 大鼠適應(yīng)性飼喂1 w后，禁食12 h，造模組、骨化三醇組和PTH組均參考“雙側(cè)卵巢摘除術(shù)”構(gòu)造PMOP大鼠模型〔5〕。術(shù)后青霉素5萬U/d預(yù)防感染，持續(xù)治療3 d，1 w后拆線。對(duì)照組不切除卵巢，而是在卵巢周圍切除等量脂肪組織，其他操作步驟相同。

1.4分組及藥物處理 術(shù)后8 w評(píng)價(jià)造模成功率，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：BMD峰值減少≥2.5標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。3只大鼠因手術(shù)感染先后死亡，大鼠造模成功48只(83%)。確認(rèn)骨質(zhì)疏松造模成功后按體重隨機(jī)分為對(duì)照組、造模組、骨化三醇組和PTH組各12只。于第2天給予不同藥物干預(yù)處理，對(duì)照組和造模組：皮下注射生理鹽水5 ml/kg，1次/d；骨化三醇組：骨化三醇0.25 μg，口服，1次/d；PTH組：皮下注射PTH1-34 50 μg/kg，連續(xù)給藥6 w。

1.5標(biāo)本取材 藥物干預(yù)結(jié)束后，測(cè)量體重后所有大鼠統(tǒng)一處死，根據(jù)大鼠解剖位置準(zhǔn)確解剖迅速分離腰椎(L1～6)及雙側(cè)股骨，剔除剝離干凈附著結(jié)締組織，將兩側(cè)股骨和腰椎骨摘出，生理鹽水沖洗，稱重后用生理鹽水浸濕的紗布包裹并標(biāo)號(hào)，裝入密閉試劑盒中，放置于-20℃保存，待用于測(cè)量BMD、骨礦物質(zhì)含量(BMC)及骨生物力學(xué)指標(biāo)。另取部分腰椎體(L4)4%多聚甲醛固定24 h，15%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣14 d，采用全自動(dòng)組織脫水機(jī)脫水，透明浸蠟，石蠟包埋，制備石蠟切片(5 μm)，60℃烤箱4 h，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6測(cè)量各組體重和股骨重量 實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)結(jié)束分別測(cè)量各組體重變化，取各組剔除剝離干凈大鼠左側(cè)股骨和腰椎骨(L3)，采用NVC4201E型電子天平稱重(1/10萬)。

1.7檢測(cè)各組股骨和腰椎BMD和BMC 取出右側(cè)股骨和腰椎骨(L4)，將其于室溫下自然解凍，將右側(cè)股骨腰椎骨(L4)分別做好標(biāo)記并整齊排列在有機(jī)玻璃板上，開啟BMD儀器，選定掃描區(qū)域，小物體Discovery Wi掃描模式，設(shè)置掃描參數(shù)：掃描速度60 mm/s，掃描間距1.0 mm×1.0 mm，精密度為1.5%。測(cè)定完畢后，將上述骨組織置于搪瓷盤中，放入60℃烤箱24 h，烘烤至恒質(zhì)量后稱量，放置灰化爐中，650℃下灰化36 h，取出灰分稱量，應(yīng)用軟件及公式進(jìn)行分析計(jì)算，獲取BMD(g/cm2)和BMC值(g)。

1.8檢測(cè)各組骨生物力學(xué)指標(biāo) 取出右側(cè)股骨和腰椎骨，將其室溫自然解凍，檢測(cè)前顯微鏡觀察骨標(biāo)本，以確保所有測(cè)試標(biāo)本骨皮質(zhì)完好沒有微小的裂痕、裂縫，完好無損，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。分別采用三點(diǎn)彎曲法和腰椎壓縮試驗(yàn)測(cè)定大鼠右側(cè)股骨腰椎(L1)骨生物力學(xué)指標(biāo)，計(jì)算機(jī)軟件根據(jù)有壓力傳感器，探頭下降距離與載荷數(shù)據(jù)計(jì)算出記錄載荷-位移曲線，依據(jù)載荷-位移曲線計(jì)算最大載荷(N)、最大應(yīng)力(Mpa)、抗彎剛度(N·m2)。

1.9觀察各組骨組織形態(tài)學(xué) 取出石蠟切片，參照HE染色法操作步驟進(jìn)行操作，采用多功能自動(dòng)染色機(jī)進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腰椎骨組織形態(tài)學(xué)改變。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q法。

2 結(jié) 果

2.1各組體重和骨重量比較 造模組體重較對(duì)照組顯著增加，而股骨和腰椎骨重量較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)；骨化三醇組和PTH組體重較造模組下降，股骨和腰椎骨重量較造模組均增加，但僅PTH組與造模組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2各組骨組織BMD和BMC比較 造模組股骨和腰椎骨BMD和BMC較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，骨化三醇組和PTH組股骨和腰椎骨BMD和BMC較造模組均增加，但僅PTH組與造模組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.3各組骨組織生物力學(xué)性能比較 造模組股骨和腰椎骨最大載荷、最大應(yīng)力、抗彎剛度較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，骨化三醇組、PTH組股骨和腰椎骨最大載荷、最大應(yīng)力、抗彎剛度較造模組均增加，但僅PTH組與造模組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.4各組骨形態(tài)學(xué)變化 對(duì)照組骨皮質(zhì)結(jié)構(gòu)致密，骨小梁飽滿粗大，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，排列密集有序，未見吸收或斷裂現(xiàn)象。造模組骨皮質(zhì)明顯變薄，骨小梁稀疏變薄，部分?jǐn)嗔?，結(jié)構(gòu)排列紊亂，髓腔擴(kuò)大，可見部分空缺骨陷窩。骨化三醇組骨皮質(zhì)變厚，骨小梁較前稍增多增厚，少量骨小梁斷裂，排列尚規(guī)則，少量空缺骨陷窩。PTH組骨皮質(zhì)結(jié)構(gòu)較完整，骨小梁明顯增多，致密均勻粗壯，緊密連接成網(wǎng)狀，間隙小，骨髓腔變小。見圖1。

表1 各組體重和骨重量及骨組織BMD和BMC比較

表2 各組股骨及腰椎骨生物力學(xué)指標(biāo)

圖1 各組腰椎骨組織形態(tài)學(xué)(HE染色，×40)

3 討 論

PMOP的發(fā)病與內(nèi)分泌、體質(zhì)、遺傳、生活方式等多種因素有關(guān)，卵巢衰竭所致雌激素分泌不足是其公認(rèn)的主要發(fā)病原因〔1〕。ERT曾被認(rèn)為是治療PMOP的首選方案，但其不良反應(yīng)突出，長期應(yīng)用可增加乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、血栓栓塞性等疾病的危險(xiǎn)性，限制了ERT臨床上治療PMOP〔6〕。PTH可調(diào)節(jié)骨的合成和分解代謝，在維持骨穩(wěn)態(tài)的過程中發(fā)揮著雙重調(diào)節(jié)作用，不僅可增加成骨細(xì)胞數(shù)量，促進(jìn)骨生長因子釋放，增加骨量及BMD，促進(jìn)骨形成，而且可增強(qiáng)破骨細(xì)胞活性，促進(jìn)骨吸收，同時(shí)還可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)膠原合成和骨組織礦化，且可抑制成骨細(xì)胞的凋亡〔7，8〕。BMD指單位骨組織單位面積或體積內(nèi)礦物質(zhì)的含量〔9〕。BMC指單位骨組織內(nèi)骨礦鹽的含量〔10〕。BMD和BMC是目前臨床診斷骨質(zhì)疏松一項(xiàng)主要“金標(biāo)準(zhǔn)”。骨強(qiáng)度是指骨骼對(duì)抗外力作用的能力，主要通過BMD和骨質(zhì)量兩個(gè)重要因素所決定，而骨質(zhì)量又與骨微結(jié)構(gòu)、骨礦含量、骨膠原成分、骨組織形態(tài)學(xué)、基質(zhì)的礦化、骨轉(zhuǎn)換、骨生物力學(xué)性能及其他等方面因素密切相關(guān)〔11〕。大量研究結(jié)果表明，單純BMD和BMC增加，并不一定會(huì)增加骨質(zhì)量，有時(shí)反而降低，還需要結(jié)合骨生物力學(xué)性能指標(biāo)的變化，其可更好地體現(xiàn)骨強(qiáng)度及抵抗外力的能力〔12〕。骨生物力學(xué)性能是研究骨骼在外力作用下的力學(xué)特性及受力后的生物效應(yīng)，是全面評(píng)價(jià)骨質(zhì)量的最可靠指標(biāo)〔13〕。最大載荷、最大應(yīng)力和結(jié)構(gòu)剛度等指標(biāo)常用于反映骨的生物力學(xué)特性。同時(shí)骨組織形態(tài)學(xué)的變化，也能直觀反映骨小梁、骨細(xì)胞和骨髓腔的情況，而且能從病理學(xué)詮釋PMOP骨改變。本研究研究結(jié)果表明大鼠PMOP造模后BMD、骨量、骨生物力學(xué)性能、骨組織形態(tài)和微細(xì)結(jié)構(gòu)均發(fā)生不同程度的損害，證實(shí)了該模型的成功。PTH處理后大鼠體重和骨重量、骨組織BMD和BMC、骨生物力學(xué)指標(biāo)和骨組織形態(tài)均得到顯著改善，證實(shí)了PTH防治PMOP效果。說明PTH能增強(qiáng)骨的生物力學(xué)性能，提高BMD和BMC，從而能減少PMOP并發(fā)癥的發(fā)生，其提高骨質(zhì)量的機(jī)制在于改變了骨的顯微結(jié)構(gòu)，提高骨膠原纖維及膠原的礦化程度，同時(shí)也增加了大鼠體重和骨量，能有效防治PMOP和起到骨保護(hù)作用。同時(shí)，矯杰等〔14〕研究人PTH片段1～34能增加去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠生化指標(biāo)、BMD和骨生物力學(xué)特性。徐進(jìn)等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)人PTH相關(guān)蛋白氨基端肽能改善去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠骨代謝，提高BMD和骨生物力學(xué)性能。Meta分析結(jié)果顯示PTH能提高PMOP BMD，降低骨折的風(fēng)險(xiǎn)，且療效優(yōu)于阿倫磷酸鹽，尤其適用于骨量嚴(yán)重低下和有骨質(zhì)疏松性骨折的絕經(jīng)后女性〔16〕。