葒草苷調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路對小鼠七氟烷麻醉手術(shù)后認(rèn)知功能及大腦β淀粉樣蛋白、Tau蛋白水平的影響

楊乾舸 周雨樺 龍飛宇

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1麻醉科，四川 瀘州 646000；2心臟大血管外科；3西南醫(yī)科大學(xué)研究生院)

七氟烷是常用的吸入麻醉藥，麻醉手術(shù)后認(rèn)知功能障礙是臨床常見的并發(fā)癥，患者出現(xiàn)認(rèn)知功能損害〔1〕，認(rèn)知功能的障礙與Wnt/β-catenin信號通路被抑制有關(guān)〔2〕，葒草苷能夠改善轉(zhuǎn)基因小鼠認(rèn)知功能，減少海馬β淀粉樣蛋白(Aβ)表達(dá)，增加自噬溶酶體自我降解〔3〕。相關(guān)研究表明，AD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生于Wnt/β-catenin信號通路關(guān)系密切，激活該通路不僅可以保護(hù)神經(jīng)元，還可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化，改善AD〔4〕。阿爾茨海默病(AD)患者腦內(nèi)出現(xiàn)大量的老年斑(SP)和Aβ沉積，進(jìn)而出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞的突觸功能異常、神經(jīng)元數(shù)目減少。研究表明，Wnt/β-catenin信號通路與AD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生密切相關(guān)，阻斷該通路會引起Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性疾病及突觸功能障礙。Aβ、微管相關(guān)蛋白Tau蛋白在AD患者中表達(dá)異常，其與AD發(fā)病密切相關(guān)〔5〕。本文擬分析紅草苷調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路對小鼠七氟烷麻醉手術(shù)后認(rèn)知功能及大腦Aβ、Tau蛋白水平的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 50只成年SPF級雄性C57BL/6小鼠，體重20～25 g，由四川省疾病預(yù)防控制中心提供，許可證號：SYXK(川)2021-043。在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開展實(shí)驗(yàn)，所有動物在實(shí)驗(yàn)過程中自由飲食。

1.2藥物與主要試劑 葒草苷(純度>98%，曼思特，成都)；Aβ、磷酸化Tau(p-Tau)抗體(萬類生物，沈陽)；Morris水迷宮(正華生物，安徽)；電泳儀(Bio-Rad，美國)。

1.3動物分組及模型構(gòu)建 將60只成年雄性C57BL/6小鼠飼養(yǎng)于室溫條件下，不限制其水食，適應(yīng)性喂養(yǎng)2～3 d，將成年雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對照組、麻醉手術(shù)組、低劑量葒草苷組、中劑量葒草苷組、高劑量葒草苷組、高劑量葒草苷+Wnt/β-catenin信號通路抑制劑(IWR-1)組，對照組不做處理，其余各組在七氟烷麻醉后行腹腔探查術(shù)，低、中、高劑量葒草苷組分別于術(shù)前1 h經(jīng)腹腔注射5、10、20 mg/kg葒草苷，高劑量葒草苷+IWR-1組于術(shù)前1 h經(jīng)腹腔注射20 mg/kg葒草苷和5 mg/kg IWR-1。對照組、麻醉手術(shù)組腹腔注射同劑量的生理鹽水，其余6只用于補(bǔ)充各組死亡的小鼠〔6〕。

1.4Western印跡檢測各組小鼠海馬相關(guān)蛋白水平 將小鼠海馬組織放于冰水浴中進(jìn)行充分勻漿，采用RIPA裂解緩沖液分離總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。然后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)實(shí)驗(yàn)，并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PDVF)膜上。在室溫下用脫脂牛奶封閉1 h后，加入抗Wnt3a(1∶2 000)、抗β-catenin(1∶2 000)、Aβ抗體(1∶800)及p-Tau抗體(1∶500)一抗。在4℃下孵育過夜后，用1×TBST沖洗膜，然后與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的IgG(1∶3 000)二抗在室溫下孵育1 h。以GAPDH作為內(nèi)參(1∶3 000)。最后用ECL進(jìn)行曝光，掃膜儀進(jìn)行成像〔7〕。

1.5Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 用一個(gè)半徑為60 cm，水深30 cm的圓形水池和一個(gè)平臺作為迷宮人為分為4個(gè)象限，記為NE、SE、SW、NW，平臺直徑6 m，高14 cm，置于距SE象限正中距池壁約25 cm處，淹沒于水下1 cm。迷宮周圍一切標(biāo)志保持不變，水溫保持在(23±1)℃。正式試驗(yàn)前先讓小鼠熟悉環(huán)境，實(shí)驗(yàn)前1天將小鼠放在不放平臺的水迷宮中熟悉環(huán)境1 min，然后進(jìn)行4 d的逃避潛伏期訓(xùn)練：每天訓(xùn)練4次，每次間隔30 min，每天隨機(jī)從4個(gè)入水點(diǎn)讓小鼠面向池壁放入，從入水到找到水下平臺所用時(shí)間記為逃避潛伏期。訓(xùn)練結(jié)束后進(jìn)行正式測試，先記錄逃避潛伏期，然后撤除平臺讓小鼠進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)。記錄小鼠60 s內(nèi)穿越平臺的次數(shù)及目標(biāo)象限游泳時(shí)間〔8〕。

1.6qRT-PCR檢測各組小鼠海馬白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α mRNA水平 采用Trizol提取小鼠海馬組織中總RNA 10 μg，按照RT-PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。引物序列：上游5′-CACCTGCTGCTACTCATTCACT-3′，下游5′-GTCTCTGTC ATACTGGTCACTTC-3′，GAPDH上游5′-CACCCGCGAGTACAACCATC-3′，下游5′-CTAGAAAGTGTGGTGCCAA-3′。反應(yīng)條件：48℃反轉(zhuǎn)錄45 min，94℃進(jìn)行滅活，引物變性2 min，然后94℃ 30 s，各退火1 min，68℃ 2 min，循環(huán)40次，68℃ 7 min，4℃冷卻。凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行成像，以GAPDH為參考，計(jì)算IL-6、TNF-α水平〔9〕。

1.7酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測各組小鼠海馬IL-6、TNF-α水平 對小鼠海馬組織進(jìn)行分離后取出上清液，并在-20℃下進(jìn)行凍存，在組織標(biāo)本中加入50 μl的樣本分析緩沖液，將其加入相應(yīng)的孔中，并在室溫下孵育2 h，洗滌板5次，加入100 μl抗體工作液，在室溫下孵育1 h，加入酶結(jié)合物100 μl，避光孵育20 min，加入顯色劑后，避光孵育20 min，加入50 μl終止液，混勻后使用分光光度計(jì)測量450 nm處光密度(OD)值，設(shè)置6個(gè)空白孔進(jìn)行平行對照，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到各指標(biāo)濃度〔10〕。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1Western印跡檢測各組海馬Wnt/β-catenin信號通路水平 與對照組相比，麻醉手術(shù)組海馬Wnt3a及β-catenin水平顯著降低(P<0.05)，與麻醉手術(shù)組相比，低劑量葒草苷組、中劑量葒草苷組、高劑量葒草苷組顯著升高(P<0.05)，與高劑量葒草苷組相比，高劑量葒草苷+IWR-1組顯著降低(P<0.05)，見圖1，表1。

2.2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測各組逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)和目標(biāo)象限游泳時(shí)間 與對照組相比，麻醉手術(shù)組逃避潛伏期顯著升高，穿越平臺次數(shù)明顯減少，目標(biāo)象限游泳時(shí)間顯著降低(P<0.05)；與麻醉手術(shù)組相比，低劑量、中劑量、高劑量葒草苷組逃避潛伏期顯著降低，穿越平臺次數(shù)和目標(biāo)象限游泳時(shí)間顯著增加(P<0.05)；與高劑量葒草苷組相比，高劑量葒草苷+IWR-1組逃避潛伏期顯著升高，穿越平臺次數(shù)顯著減少，目標(biāo)象限游泳時(shí)間顯著降低(P<0.05)，見表2。

2.3Western印跡檢測各組海馬Aβ、p-Tau蛋白水平 與對照組相比，麻醉手術(shù)組海馬Aβ、p-Tau蛋白水平顯著升高(P<0.05)，與麻醉手術(shù)組相比，低劑量、中劑量、高劑量葒草苷組顯著降低(P<0.05)，與高劑量葒草苷組相比，高劑量葒草苷+IWR-1組顯著升高(P<0.05)，見表2，圖2。

1～6：對照組、麻醉手術(shù)組、低劑量葒草苷組、中劑量葒草苷組、高劑量葒草苷組、高劑量葒草苷+IWR-1組；圖2同圖1 Western印跡檢測各組海馬Wnt/β-catenin信號通路水平

表1 Western印跡檢測各組海馬Wnt/β-catenin信號通路水平

表2 各組逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)、目標(biāo)象限游泳時(shí)間、Aβ及磷酸化Tau蛋白水平比較

圖2 Western印跡檢測各組海馬Aβ、p-Tau蛋白水平

2.4qRT-PCR檢測各組海馬IL-6、TNF-α mRNA水平 與對照組相比，麻醉手術(shù)組海馬IL-6、TNF-α mRNA水平顯著升高(P<0.05)，與麻醉手術(shù)組相比，低劑量、中劑量、高劑量葒草苷組顯著降低(P<0.05)，與高劑量葒草苷組相比，高劑量葒草苷+IWR-1組顯著升高(P<0.05)，見表3。

表3 qRT-PCR檢測各組小鼠海馬IL-6、TNF-α mRNA水平

2.5ELISA檢測各組小鼠海馬IL-6、TNF-α水平 與對照組相比，麻醉手術(shù)組海馬IL-6、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)，與麻醉手術(shù)組相比，低劑量、中劑量、高劑量葒草苷組顯著降低(P<0.05)，與高劑量葒草苷組相比，高劑量葒草苷+IWR-1組顯著升高(P<0.05)，見表4。

表4 ELISA檢測各組小鼠海馬IL-6、TNF-α水平

3 討 論

葒草苷是葒草、竹葉、金蓮花的主要活性成分，具有抗抑郁、抗衰老、抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗凋亡等作用〔11〕。以往研究表明，葒草苷可以改善Aβ誘導(dǎo)的癡呆小鼠，但是其作用機(jī)制還不清楚〔12〕。研究表明，葒草苷能夠改善Aβ及噪音誘導(dǎo)的癡呆小鼠的認(rèn)知功能，因此，葒草苷可能是一個(gè)潛在的多靶點(diǎn)作用的AD防治藥物，但葒草苷治療AD的確切機(jī)制仍不清楚〔12〕。本研究顯示，不同劑量的葒草苷(5、10、20 mg/kg)均改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

Aβ是由β淀粉樣前體蛋白(APP)水解產(chǎn)生的一種廣泛分布于體內(nèi)各組織的蛋白質(zhì)，有很強(qiáng)的自聚性，很容易形成極難溶的沉淀〔13〕。Tau蛋白是一種磷蛋白，Tau蛋白過度磷酸化假說認(rèn)為在AD形成早期，過度p-Tau蛋白發(fā)揮重要作用，AD患者的Tau蛋白磷酸基比正常人高3～4倍〔13～15〕。大鼠的轉(zhuǎn)基因(Tg)模型研究顯示，Aβ在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)積累能夠改變細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)/反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)信號傳導(dǎo)途徑，從而影響Tau蛋白磷酸化狀態(tài)和雄性大鼠誘發(fā)的行為障礙〔16〕。本研究結(jié)果說明葒草苷可以降低Aβ和p-Tau蛋白水平。

在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中Wnt/β-catenin信號通路起關(guān)鍵作用，參與突觸形成及神經(jīng)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程〔17〕。突觸結(jié)構(gòu)損傷會導(dǎo)大鼠發(fā)生AD。Wnt3a和β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路中的關(guān)鍵蛋白，都參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和突觸可塑性形成過程〔18〕。

綜上，葒草苷可明顯改善小鼠七氟烷麻醉手術(shù)后的認(rèn)知功能，其機(jī)制可能與激活Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)，大腦Aβ、Tau蛋白水平也具有一定的影響。