環(huán)氧二十碳三烯酸對老年慢性心力衰竭大鼠的保護作用及機制

劉運陽 歐奇林 王素俠 劉陽

(南華大學附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖南 衡陽 421000)

慢性心力衰竭(CHF)是由于多種原因導致心室功能及結構異常引起的心室射血功能減少的臨床綜合征〔1〕，是多種心血管疾病的終末期表現(xiàn)。CHF主要表現(xiàn)為心肌收縮功能和心輸出量下降，機體組織供氧和代謝的血液供應減少〔2〕。CHF的發(fā)病率逐年上升，并且臨床預后差、死亡率高，5年死亡率與癌癥患者接近，嚴重影響患者的生活質(zhì)量〔3〕。環(huán)氧二十碳三烯酸(EETs)作為花生四烯酸經(jīng)細胞色素P450代謝途徑的代謝產(chǎn)物，可擴張血管及降低炎性反應等，在高血壓、心肌缺血及肥胖等方面都起著重要的治療作用〔4〕。目前關于EETs對CHF的治療作用鮮有報告。本研究探討EETs對老年CHF大鼠的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級SD大鼠60只，22～24周齡，雌雄各半，體重200～300 g，購自南華大學實驗動物部，生產(chǎn)許可證號SCXK(湘)2004-0009。實驗開始前先適應性喂養(yǎng)1 w，動物房溫度20～26℃，相對濕度45%～55%，晝夜時間12 h/12 h，用標準大鼠顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲用純凈水。

1.2藥品試劑及儀器 EETs由美國Cayman Chemical公司提供；注射用鹽酸阿霉素購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批準文號H33021980；白細胞介素(IL)-6和腫瘤壞死因子(TNF)-α購自西門子醫(yī)學診斷產(chǎn)品上海有限公司；原位末端標記法(TUNEL)試劑盒購自德國Roche公司；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司；蛋白酶K購自德國Merck公司；磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)及磷酸化(p)-AKT、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)和半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗體均購自美國Abcam 公司生產(chǎn)；RIPA裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、兔抗鼠β-actin抗體、辣根過氧化物酶(HRP)-羊抗大鼠IgG、電化學發(fā)光(ECL)Prime 蛋白印跡試劑均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。主要儀器：Vevo 2100 超高分辨率小動物多普勒超聲影像系統(tǒng)購自加拿大Visualsonics 公司；-80℃超低溫冰箱購自青島海爾電冰箱有限公司；RM2245型石蠟切片機、ASP300S型全自動脫水機購自德國 Leica公司；BX53型顯微鏡購自日本Olympus公司；Thermo CL31R型離心機購自美國 Thermo 公司；Multiskan Spectrum 全波長酶標儀購自美國Thermo Scientific 公司；Western印跡電泳儀購自美國Bio-Rad公司；Fluor Chem Q蛋白印跡成像和定量分析系統(tǒng)購自美國Alpha公司。

1.3CHF大鼠模型的制備 隨機選擇10只大鼠作為正常對照組，其余40只大鼠制備CHF模型。其方法如下：每只大鼠每周腹腔注射鹽酸阿霉素注射液4 mg/kg連續(xù)6 w，以10%水合氯醛(4.5 ml/kg)進行麻醉，經(jīng)彩色多普勒超聲進行左室射血分數(shù)(LVEF)檢測，以LVEF≤ 60%判定為造模成功。正常對照組腹腔注射同體積生理鹽水，其他操作相同。40只造模成功的大鼠進行后續(xù)實驗。

1.4分組及給藥 將40只造模成功的大鼠隨機分為模型對照組、EETs小劑量組、EETs中劑量組和EETs大劑量組各10只。EETs小、中、大劑量組分別每日腹腔注射EETs 10、20、40 μg/kg。正常對照組和模型對照組分別每日腹腔注射同體積生理鹽水。各組均連續(xù)給藥4 w。

1.5觀察指標 治療4 w時檢測各組心功能、心臟質(zhì)量指數(shù)(HMI)和左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)、血清IL-6和TNF-α、心肌細胞凋亡指數(shù)(AI)及PI3K/AKT信號通路相關蛋白。

1.5.1各組心功能測定 各組末次給藥2 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛(4.5 ml/kg)進行麻醉后仰臥固定，胸前區(qū)剃毛，涂抹超聲耦合劑后進行測量，取3個心動周期計算平均值。測量參數(shù)包括左室舒張期內(nèi)徑(LVIDd)、左室收縮期內(nèi)徑(LVIDs)，計算左室舒張末期容量(LVEDV)和左室收縮末期容量(LVESV)、縮短分數(shù)(FS)和LVEF。

1.5.2各組心臟指標(HMI和LVMI)檢測 各組大鼠處死后立即取出心臟，采用4℃的生理鹽水沖洗心臟殘血，用濾紙吸干水分，電子天平分別稱取全心質(zhì)量(THW)、左心室實際質(zhì)量(LVW)，計算HMI及LVMI，HMI=THW/BW，LVMI=LVW/BW。

1.5.3各組血清IL-6 和TNF-α測定 各組末次給藥心功能測定后腹腔靜脈采血約1 ml，室溫下靜止至血液完全凝固后離心(3 000 r/min×10 min)，取上清液采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定各組血清中 IL-6和TNF-α，測定時嚴格按照試劑盒說明書上所提供的方法及步驟操作。

1.5.4各組心肌細胞凋亡指數(shù)測定 剪取各組大鼠左心室的1/2組織，置于4%多聚甲醛溶液固定，經(jīng)全自動脫水機脫水14 h，常規(guī)石蠟包埋，石蠟切片厚5 μm，常規(guī)脫蠟，用 0.3%過氧化氫溶液封閉30 min，再用20 mg/L 蛋白酶K消化心肌膜蛋白及核蛋白后，加入TUNEL反應液，37 ℃孵育60 min；加入熒光素-5-異硫氰酸鹽(FITC)標記抗體，DAB顯色，蘇木素復染，脫水透明，封片后用顯微鏡觀察。細胞凋亡判定標準：正常細胞核呈藍色，凋亡細胞核呈棕褐色。每只大鼠觀察3 張切片，每張切片隨機觀察5個高倍視野(×400)，每個視野計算凋亡細胞數(shù)和細胞總數(shù)，計算AI=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%，取其平均值。

1.5.5各組心肌細胞PI3K/AKT信號通路相關蛋白測定 剪取各組左心室的剩余1/2組織，通過液氮研磨組織分離單細胞，后離心收集細胞，加入RIPA裂解液對細胞進行裂解，于4℃離心(12 000 r/min×10 min)，分離得可溶性蛋白，用BCA法進行蛋白定量，于-20℃保存。進行測量前先將蛋白室溫下解凍，100℃變性10 min。取10 μl上樣，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠加載等量的蛋白溶液進行電泳，然后用聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉印。用5%脫脂奶粉(磷酸化抗體用4% BCA)封閉2 h，分別加入PI3K、AKT、p-AKT、Bcl-2、Bax、Caspase-3和β-actin一抗，4℃下孵育過夜。含吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBST)洗膜3次，加入IgG-HRP，室溫避光孵育1 h，PBST洗膜3次。加 ECL 液曝光、顯影、定影。 用掃描儀掃描曝光膠片，用 Image J軟件分析條帶灰度值。

1.6統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗、配對t檢驗。

2 結 果

2.1各組治療后心功能指標比較 模型對照組LVIDd、LVIDs、LVEDV和LVESV均較正常對照組顯著升高(P<0.05)，而FS和LVEF均較正常對照組顯著降低(P<0.05)。EETs小劑量組和模型對照組LVIDd、LVIDs、LVEDV、LVESV、FS和LVEF差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；EETs中劑量組LVIDd、LVIDs、LVEDV和LVESV均較模型對照組和EETs小劑量組顯著降低(P<0.05)，而FS和LVEF均較模型對照組和EETs小劑量組顯著升高(P<0.05)；EETs大劑量組LVIDd、LVIDs、LVEDV和LVESV均較模型對照組、EETs小、中劑量組顯著降低(P<0.05)，而FS和LVEF均較模型對照組、EETs小、中劑量組顯著升高(P<0.05)。見表1。

2.2各組治療后心臟指標(HMI和LVMI)、心肌細胞AI及血清IL-6、TNF-α水平比較 模型對照組HMI、LVMI、心肌細胞AI及血清IL-6、TNF-α水平均較正常對照組顯著升高(均P<0.05)。EETs小劑量組和模型對照組HMI、LVMI、心肌細胞AI及血清IL-6、TNF-α水平差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；EETs中劑量組HMI、LVMI、心肌細胞AI及血清IL-6、TNF-α水平均較模型對照組和EETs小劑量組顯著降低(均P<0.05)；EETs大劑量組HMI、LVMI、心肌細胞AI及血清IL-6、TNF-α水平均較模型對照組、EETs小、中劑量組顯著降低(均P<0.05)。見表2。

表1 各組治療后心功能指標比較

表2 各組治療后心臟指標、心肌細胞AI及血清IL-6、TNF-α水平比較

2.3各組治療后心肌細胞PI3K/AKT信號通路相關蛋白比較 模型對照組心肌細胞PI3K、p-AKT和Bax蛋白表達均較正常對照組顯著升高(均P<0.05)，而AKT、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達均較正常對照組顯著降低(均P<0.05)。EETs小劑量組和模型對照組PI3K、AKT、p-AKT、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；EETs中劑量組心肌細胞PI3K、p-AKT和Bax蛋白均較模型對照組和EETs小劑量組顯著降低(均P<0.05)，而AKT、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達均較模型對照組和EETs小劑量組顯著升高(均P<0.05)；EETs大劑量組心肌細胞PI3K、p-AKT和Bax蛋白均較模型對照組、EETs小、中劑量組顯著降低(均P<0.05)，而AKT、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達均較模型對照組、EETs小、中劑量組顯著升高(均P<0.05)。見表3。

表3 各組治療后PI3K/AKT信號通路相關蛋白比較

3 討 論

CHF時由于心臟的損害或超負荷而導致的心臟工作效率降低，直接的表現(xiàn)就是心臟功能發(fā)生障礙。隨著人口老齡化和生活方式的改變，CHF患病人數(shù)不斷增加，據(jù)估算目前全球有超過3 800萬例心衰患者〔5〕。因為CHF需要長期治療，并且病情反復，因此產(chǎn)生巨額的醫(yī)療費用，成為日益嚴重的全球性公共衛(wèi)生問題。EETs是花生四烯酸經(jīng)細胞色素 P450 表氧化酶的代謝產(chǎn)物，在炎癥、心血管功能和血管生成方面發(fā)揮著重要作用。EETs在脈管系統(tǒng)通過抑制核轉錄因子(NF)-κB的激活具有明顯的抗炎作用〔6〕。在心血管系統(tǒng)EETs可松弛血管平滑肌細胞，通過激活鈣激活K+通道提供心肌保護，還可增加內(nèi)皮型一氧化氮合成酶的表達和活性從而降低動脈血壓〔7〕。EETs通過環(huán)磷酸腺苷(cAMP)和蛋白激酶(PK)A介導的信號通路增加環(huán)氧酶-2的表達促進血管生成〔8〕。EETs通過PI3K/AKT信號的激活和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)脫磷酸作用等機制抑制細胞凋亡〔9〕。本研究說明EETs可改善老年CHF大鼠的心功能。HMI和LVMI是分別是左心室腫瘤與心臟質(zhì)量與體質(zhì)量的比值，間接反映心臟的左心室功能，而EETs可劑量依賴性降低CHF大鼠HMI和LVMI。

細胞凋亡是一種基因程序化的、活躍的細胞自殺過程，在體內(nèi)平衡和清除不需要的細胞方面起著至關重要的作用。CHF發(fā)病機制尚不明確，而心肌細胞凋亡在CHF 的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，會導致心肌收縮功能下降，使 CHF發(fā)生進行性惡化〔10，11〕。因此，阻斷心肌細胞凋亡可降低CHF發(fā)病率，延緩CHF發(fā)展，改善心臟各項功能〔12〕。本研究結果說明EETs可抑制CHF大鼠心肌細胞凋亡。

心肌細胞對缺血、缺氧非常敏感，在缺血或缺氧的情況下，炎性因子增多、脂質(zhì)過氧化水平增加、細胞膜的穩(wěn)定性及完整性被破壞，導致心肌細胞凋亡〔13〕。IL-6和TNF-α是由單核-巨噬細胞分泌的炎性細胞因子，是參與HF病理過程的細胞因子〔14〕。IL-6 主要由單核細胞和血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，可直接或者間接參與炎性細胞的活化，參與左心室重構和心肌纖維化過程從而使其功能失調(diào)，加重HF過程中心肌缺血缺氧等炎性損傷反應〔15〕。TNF-α 為抗腫瘤活性細胞因子，當患者出現(xiàn)HF時，其血流動力學異常，左心室舒張末期壓力升高，導致心肌細胞受到牽張刺激而產(chǎn)生TNF-α〔16〕。TNF-α可通過負性肌力作用，誘導心室重構，并且對部分原癌基因有激活作用而促發(fā)心肌細胞凋亡。本研究結果說明EETs可能通過降低CHF大鼠血清IL-6和TNF-α水平而降低機體炎癥反應，從而抑制心肌細胞凋亡。

細胞凋亡途徑包括死亡受體途徑、線粒體途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑等，PI3K/AKT信號通路被認為是細胞內(nèi)最重要的生存通路〔17〕，在促進細胞增殖和抗凋亡中發(fā)揮重要作用，并且與CHF的發(fā)生和發(fā)展密切相關〔18〕。PI3K作為該信號通路的起始因子，各種生長因子作用于膜受體而使PI3K激活而產(chǎn)生第二信使三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，PIP3與AKT結合，使 AKT 從細胞質(zhì)轉移到細胞膜上，使AKT磷酸化而被活化〔19〕。過度活化的AKT可直接磷酸化前凋亡基因Bax，激活抗凋亡蛋白Bcl-2，而Bax表達的增加可使線粒體膜對細胞色素 C 的通透性增加，由線粒體進入胞質(zhì)的細胞色素 C 能夠啟動 Caspase級聯(lián)反應并最終激活 Caspase-3執(zhí)行細胞凋亡過程〔20〕。本研究結果說明EETs可通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路蛋白的表達而抑制CHF大鼠心肌細胞的凋亡。

綜上，EETs對老年CHF大鼠心功能具有改善作用，其作用可能與其抑制心肌細胞凋亡、降低機體炎癥反應、調(diào)節(jié)PI3K/ AKT 信號通路蛋白的表達有關。