1株鴿毛滴蟲的分離鑒定、體外培養(yǎng)和感染動物模型的建立

丁 聰，翟 濤，李 玲，王曉岑，宮鵬濤，張西臣，李建華，李 新 (吉林大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062)

鴿毛滴蟲(Trichomonasgallinae)是一種嚴(yán)重危害鴿養(yǎng)殖業(yè)的寄生性原蟲，引起鴿消化道出現(xiàn)嚴(yán)重潰瘍、黃白色的干酪性壞死病變?yōu)橹饕卣鞯镍澝蜗x病，該病又稱“鴿癀”[1-2]，這種病可以阻塞雛鴿的食道和呼吸道，致使患病雛鴿死于饑餓或窒息[3-4]。鴿毛滴蟲主要寄生于禽類的消化道上部，多見于咽部、食管、肝臟等部位，嚴(yán)重者可引起全身感染。SPRIGGS等[5]發(fā)現(xiàn)鴿毛滴蟲可侵入禽類頭部，寄生于腦部和眼部。鴿毛滴蟲病呈世界性分布[6-8]，對不同品種和年齡段的鴿都具有傳染性，其中雛鴿和青年鴿最易感染。JIANG等[9]對山東省5個鴿場和1個鴿屠宰場進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)鴿毛滴蟲感染率為33.8%，青年鴿患病率最高，為35.2%，種鴿患病率為13.6%，雛鴿患病率為4.8%。在北京地區(qū)，鴿總患病率為28.30%，雛鴿患病率最高，為33.16%，其次為青年鴿和種鴿，分別為30.05%和20.59%[10]。鴿毛滴蟲病的主要傳播方式為經(jīng)口傳播。鴿子通過采食帶有鴿毛滴蟲蟲體的飼料、飲水而發(fā)生感染。因患鴿的毛滴蟲大量聚集在口腔潰瘍病灶，導(dǎo)致鴿口腔唾液內(nèi)含有大量的毛滴蟲，故而易感鴿通過和患鴿或帶蟲鴿子的接吻也會導(dǎo)致感染[11]。除發(fā)病鴿以外，無癥狀的帶蟲鴿也是重要的傳染源[12]，導(dǎo)致鴿毛滴蟲病在鴿場很難被清除，給鴿養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[13]。目前治療鴿毛滴蟲病主要使用甲硝唑等藥物，尚無其他有效措施。

鴿毛滴蟲鑒定可采用形態(tài)學(xué)觀察和ITS1/5.8S/ITS2基因分析方法。形態(tài)學(xué)觀察主要為咽拭子涂片鏡檢，當(dāng)觀察到活的鴿毛滴蟲蟲體時即可確診?；贗TS1/5.8S/ITS2基因的系統(tǒng)發(fā)育分析及限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性分析可進一步確定鴿毛滴蟲的基因型，可將鴿毛滴蟲分為3種基因型：基因型A、基因型B及基因型T.tenax(包括T.tenax-樣分離株)[3,14-15]。鴿毛滴蟲的體外培養(yǎng)主要通過采集病鴿口咽拭子，培養(yǎng)基可使用RPMI1640培養(yǎng)基、肝浸湯培養(yǎng)基、TYM培養(yǎng)基或Hollander瓊脂培養(yǎng)基等。動物感染模型的建立是研究鴿毛滴蟲病的關(guān)鍵途徑。王飛等[16]、羅峰等[17]和YOUSSEFI等[18]成功建立了鴿毛滴蟲感染動物模型。但國內(nèi)外對鴿毛滴蟲病的研究尚不十分系統(tǒng)。因此，有待加強鴿毛滴蟲病的研究，以保障鴿養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

本研究從感染鴿毛滴蟲的落地王鴿分離出鴿毛滴蟲，對蟲體進行體外純培養(yǎng)；通過形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)觀察鑒定蟲體；基于ITS1/5.8S/ITS2基因序列分析確定其基因型；以不同劑量蟲體經(jīng)口感染鴿建立鴿毛滴蟲感染動物模型。為進一步研究鴿毛滴蟲致病機理、免疫機制及藥物篩選等提供材料和方法。

1 材料與方法

1.1 試驗動物患病落地王鴿和40日齡健康落地王鴿均購自長春市某養(yǎng)鴿場。

1.2 材料瑞氏-吉姆薩染色液和Vero細胞，保存于本實驗室；RPMI1640培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液(雙抗)、胎牛血清均購自BI公司；DH5α感受態(tài)細胞購自天根生化科技(北京)有限公司； pMDTM18-T Vector Cloning Kit、DL2000 DNA Marker、DNA膠回收試劑盒、HaeⅢ限制性內(nèi)切酶、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase等均購自TaKaRa公司；細胞/血液基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；BsiEⅠ限制性內(nèi)切酶購自賽默飛世爾科技公司；多聚賴氨酸購自Sigma公司。

1.3 鴿毛滴蟲的分離鑒定

1.3.1牛肝浸湯培養(yǎng)基的配制 取15 g新鮮牛肝，研磨后放入燒杯。加入100 mL蒸餾水，混勻后放入4℃靜置過夜。次日取出蒸煮1 h。用紗布過濾取上清液，后加入0.5 g氯化鈉、1 g麥芽糖、0.2 gL-半胱氨酸鹽酸鹽、2 g蛋白胨直至溶解，再用濾紙過濾。將濾液加蒸餾水定容至100 mL，121℃條件下30 min高溫高壓滅菌。冷卻后置于4℃保存。取4 mL的無菌肝浸湯于無菌試管中，加入60 μL雙抗溶液和1 mL滅活的胎牛血清，混勻后置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2鴿毛滴蟲的分離 取患鴿毛滴蟲病落地王鴿腦組織于75%乙醇溶液中浸泡5 min，更換75%乙醇溶液后再次浸泡5 min，取中間未被浸泡的部分，在200目細胞篩上研磨至鋪好Vero細胞的6孔板中，加入1 mL含2%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃,5% CO2的條件下培養(yǎng)48 h。取培養(yǎng)上清涂片后鏡檢鴿毛滴蟲。

1.3.3鴿毛滴蟲的純化培養(yǎng) 取上述1 mL培養(yǎng)上清，2 500 ×g離心10 min收集蟲體，棄上清，使用PBS清洗2次，取適量PBS重懸沉淀，接種于5 mL牛肝浸湯培養(yǎng)基內(nèi)進行第1代傳代培養(yǎng)，每隔24 h傳代1次，直至剩下純凈的鴿毛滴蟲。繼續(xù)培養(yǎng)無菌的鴿毛滴蟲至對數(shù)生長期，使用DMSO將部分蟲體凍存于液氮中。

1.4 鴿毛滴蟲形態(tài)學(xué)觀察

1.4.1鴿毛滴蟲光學(xué)顯微鏡形態(tài)觀察 于2 500 ×g離心10 min收集蟲體，棄上清，使用PBS清洗2次，取適量PBS重懸沉淀，涂于載玻片上，用酒精燈加熱固定，經(jīng)瑞氏-吉姆薩染色后，按低倍鏡→高倍鏡的順序觀察涂片。

1.4.2鴿毛滴蟲掃描電子顯微鏡(SEM)形態(tài)觀察 收集蟲體使用多聚賴氨酸進行蟲體的固定，染色后在SEM下進行觀察。

1.4.3鴿毛滴蟲透射電子顯微鏡(TEM)形態(tài)觀察 收集蟲體緩慢加入1 mL 2.5%的戊二醛固定液，之后進行超薄切片樣品制備，染色后于TEM下進行觀察。

1.5 鴿毛滴蟲基因分型的鑒定

1.5.1引物的設(shè)計與合成 引物序列參考ALREFAEI等[7]研究中使用的鴿毛滴蟲TFR引物(TFR1：5′-TGCTTCAGTTCAGCGGGTCTTCC-3′，TFR2：5′-CGGTAGGTGAACCTGCCGTTGG-3′)，由吉林庫美生物公司合成。

1.5.2ITS1/5.8S/ITS2基因的PCR擴增及測序 收集蟲體用細胞/血液基因組提取試劑盒提取蟲體全基因組DNA。以獲得的基因組DNA為模板，擴增ITS1/5.8S/ITS2基因，反應(yīng)體系(50 μL)：5×Buffer 10 μL，dNTP 4 μL，PrimeSTAR GXL Enzymes 1 μL，TFR1 1 μL，TFR2 1 μL，基因組DNA 2 μL，ddH2O 31 μL。PCR擴增程序：98℃ 2 min；98℃ 10 s，60℃ 15 s，68℃ 40 s，共30個循環(huán)；68℃延伸5 min，4℃保存。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，并用膠回收試劑盒回收目的片段。將擴增后片段連接至pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)，均勻涂于含有氨芐抗性的培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)12 h后，挑取陽性單菌落進行測序。

1.5.3鴿毛滴蟲ITS1/5.8S/ITS2基因系統(tǒng)發(fā)育進化分析 利用NCBI網(wǎng)站的BLAST工具對測序結(jié)果進行比對，獲得與其同源性較高的序列，使用MEGA 6.0軟件對測序結(jié)果及與其同源性較高的序列進行聚類分析，統(tǒng)計方法采用鄰接法，系統(tǒng)發(fā)生檢測采用自舉法，置信值為重復(fù)抽樣1 000次。

1.5.4限制性片段長度多態(tài)性分析 分別使用限制性內(nèi)切酶BsiEⅠ和HaeⅢ對擴增出的ITS1/5.8S/ITS2基因片段進行酶切鑒定，BsiEⅠ可以將基因型為A或B的片段進行切割，HaeⅢ可以將基因型為B的片段進行切割，基因型為T.tenax(包括T.tenax樣分離株)的片段不會被BsiEⅠ或HaeⅢ切割[9]。

1.6 鴿毛滴蟲感染動物模型的建立將20只40日齡健康落地王鴿分為4組，每組5只，Ⅰ組灌服生理鹽水為對照，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組分別灌服1×105,1×106,1×107個鴿毛滴蟲，連續(xù)5 d。觀察鴿臨床癥狀，1周后采集鴿口咽拭子鏡下觀察鴿毛滴蟲感染情況，同時剖檢鴿觀察口咽病理變化。

2 結(jié)果

2.1 鴿毛滴蟲形態(tài)學(xué)觀察

2.1.1鴿毛滴蟲培養(yǎng) 經(jīng)Vero細胞培養(yǎng)24 h后，鴿毛滴蟲生長狀態(tài)良好，部分蟲體聚團，呈橢圓形或梨形，運動迅速，活力強，Vero細胞輪廓清晰,胞漿透亮,細胞形態(tài)完整(圖1A)；培養(yǎng)48 h后，鴿毛滴蟲生長狀態(tài)良好，大量蟲體聚團，Vero細胞部分裂解，從壁上脫落(圖1B)。經(jīng)牛肝浸湯培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 的鴿毛滴蟲生長狀態(tài)良好(圖1C);培養(yǎng)48 h后，鴿毛滴蟲大量死亡(圖1D)。鴿毛滴蟲呈橢圓形或梨形，長8～10 μm，寬4～6 μm。

A.經(jīng)Vero細胞培養(yǎng)24 h；B.經(jīng)Vero細胞培養(yǎng)48 h；C.經(jīng)牛肝浸湯培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；D.經(jīng)牛肝浸湯培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h圖1 鴿毛滴蟲活體形態(tài)學(xué)觀察(400×)

2.1.2鴿毛滴蟲吉姆薩染色后形態(tài)學(xué)觀察 經(jīng)瑞氏-吉姆薩染色后，蟲體被染成藍紫色，呈橢圓形或不規(guī)則形(圖2A)。細胞核呈橢圓形，且被染成藍紫色，位于蟲體前端。4根前鞭毛呈紫紅色。軸柱顏色淺于原生質(zhì)，且稍突出于蟲體后緣。一側(cè)可清晰觀察到波動膜外邊緣的輪廓(圖2B)。

A.20倍放大蟲體形態(tài)；B.100倍放大蟲體形態(tài)(F.鞭毛；B.毛基體；N.細胞核；UM.波動膜；AX.軸柱)圖2 鴿毛滴蟲吉姆薩染色后形態(tài)學(xué)觀察

2.1.3鴿毛滴蟲掃描電鏡形態(tài)觀察 鴿毛滴蟲呈圓形、卵圓形或梨形，輪廓清晰，表面有許多孔洞且凹凸不平。蟲體前端毛基體處伸出長短不一的4根鞭毛，是蟲體的運動器官。在蟲體的中央，有一根細長的軸柱以自前向后的方向延伸至蟲體游離的后鞭毛之外。蟲體一側(cè)有起始于蟲體前端終止于蟲體側(cè)后方的波動膜(圖3A)。

2.1.4鴿毛滴蟲透射電鏡形態(tài)觀察 TEM下可見呈橢圓形或卵圓形的細胞核位于蟲體的前端中央，細胞核周圍的核膜粗糙不齊，細胞質(zhì)中含有大量的糖原顆粒，在蟲體內(nèi)部還可見到氫化酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細胞器，還有食物泡等結(jié)構(gòu)，蟲體周圍可以觀察到覆蓋于外側(cè)的波動膜和游離的鞭毛等結(jié)構(gòu)(圖3B)。

A.鴿毛滴蟲掃描電鏡形態(tài)觀察；B.鴿毛滴蟲透射電鏡形態(tài)觀察(N.細胞核；NU.核仁；NM.核膜；G.糖原顆粒；ER.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；GO.高爾基體；C.中脈；UM.波動膜；AX.軸柱；H.氫化酶體；B.鞭毛基體；F.鞭毛；V.食物泡)圖3 鴿毛滴蟲電子顯微鏡下形態(tài)觀察

2.2 鴿毛滴蟲基因分型的鑒定

2.2.1鴿毛滴蟲ITS1/5.8S/ITS2基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹的構(gòu)建 使用引物TFR1和TFR2對鴿毛滴蟲ITS1/5.8S/ITS2基因進行PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可在350 bp左右的位置看見明顯條帶(圖4A)。將擴增得到的ITS1/5.8S/ITS2片段的測序結(jié)果與GenBank上登錄的基因序列進行BLAST比對，顯示其與英國分離株MT632479.1同源性為100%。使用MEGA 6.0軟件對ITS1/5.8S/ITS2基因及與其同源性較高的序列進行聚類分析，可以認(rèn)定所分離得到的毛滴蟲即為鴿毛滴蟲(圖4B)。

A.ITS1/5.8S/ITS2的PCR擴增(M.DL2000 DNA Marker；1.ITS1/5.8S/ITS2基因PCR產(chǎn)物)；B.ITS1/5.8S/ITS2基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹圖4 鴿毛滴蟲ITS1/5.8S/ITS2基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹

2.2.2限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性分析 擴增得到的ITS1/5.8S/ITS2序列片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶BsiEⅠ處理后被切割為大小為234 bp和125 bp的2個片段；經(jīng)限制性內(nèi)切酶HaeⅢ處理后未被切割，可以判定該株鴿毛滴蟲的基因型為A型(圖5)。

M.DL2000 DNA Marker；1.未酶切；2.BsiEⅠ單酶切；3.HaeⅢ單酶切圖5 限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性分析

2.3 鴿毛滴蟲感染動物模型的建立Ⅰ組落地王鴿灌服生理鹽水，為對照組，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組落地王鴿每天分別灌服1×105,1×106,1×107個毛滴蟲，連續(xù)5 d。對照組鴿只死亡率為0，無明顯臨床癥狀，口咽部剖檢均未見病變(圖6A)，取口咽拭子鏡檢鴿毛滴蟲感染率為0(圖6E)；攻蟲量為1×105個時，鴿只死亡率為0，無明顯臨床癥狀，口咽部剖檢均未見明顯病變(圖6B)，取口咽拭子鏡檢顯示，鴿毛滴蟲感染率為40%(圖6F)；攻蟲量為1×106個時，鴿只死亡率為20%，出現(xiàn)精神萎靡、食欲不振、羽毛松亂、腹瀉等癥狀，口咽部剖檢可見黃色粘液或黃白色干酪樣物質(zhì)(圖6C)，取口咽拭子鏡檢顯示，鴿毛滴蟲感染率為80%(圖6G)；攻蟲量為1×107個時，鴿只迅速死亡，死亡率為100%，臨床癥狀加劇，甚至無法站立(圖6D)，取口咽拭子鏡檢顯示，鴿毛滴蟲感染率為80%(圖6H)。

A～D.分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組落地王鴿口咽病理變化；E～H.分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組落地王鴿口咽拭子鏡檢圖6 鴿毛滴蟲感染動物模型的建立

3 討論

鴿毛滴蟲主要寄生于禽類的消化道上部，多見于咽部、食管、肝臟等部位，嚴(yán)重者可引起全身感染，甚至入侵大腦[4]。鴿毛滴蟲的體外培養(yǎng)主要通過采集病鴿口咽拭子，接種于含抗生素及血清的培養(yǎng)基中37℃恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)基可使用RPMI1640培養(yǎng)基、肝浸湯培養(yǎng)基、TYM培養(yǎng)基或Hollander瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24～48 h后收集蟲體，經(jīng)光學(xué)及電子顯微鏡對蟲體進行形態(tài)學(xué)觀察，確認(rèn)是否為鴿毛滴蟲。楊秀環(huán)等[19]、陳海華等[20]和陸雨楠等[21]經(jīng)光學(xué)顯微鏡觀察可見鴿毛滴蟲呈圓形、卵圓形、梨形或紡錘形，有折光性,運動活潑；經(jīng)掃描顯微鏡觀察可見鴿毛滴蟲多呈卵圓形或梨形,少數(shù)呈球形,蟲體表面分布皺褶；長5～9 μm,寬2～9 μm,具有4根前鞭毛,1根延伸至蟲體的后緣以外的軸柱,波動膜起始于蟲體的前端,終止在蟲體后端的稍前方。MEHLHORN等[22]經(jīng)透射電子顯微鏡觀察可見鴿毛滴蟲細胞質(zhì)中含有大量的糖原顆粒及氫化酶體；在蟲體內(nèi)部可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細胞器，還有食物泡等。蟲體周圍可以觀察到覆蓋于外側(cè)的波動膜和游離的鞭毛等。本研究成功從落地王鴿腦組織中分離出鴿毛滴蟲，并使用Vero細胞及牛肝浸湯培養(yǎng)基對鴿毛滴蟲進行體外純培養(yǎng)。該株鴿毛滴蟲形態(tài)與前人研究結(jié)果一致。

目前鑒定鴿毛滴蟲的基因型主要依賴ITS1/5.8S/ITS2 基因的系統(tǒng)發(fā)育分析及限制性內(nèi)切酶片段多態(tài)性分析，可將鴿毛滴蟲分為3種基因型：基因型A、基因型B及基因型T.tenax(包括T.tenax樣分離株)[3,14-15]。已報道蟲體基因型與致病性相關(guān)[9]，A型鴿毛滴蟲的致病性相比于B型更強，其感染的家鴿更易出現(xiàn)嚴(yán)重的口腔病變。FENG等[10]對北京地區(qū)和JIANG等[9]對山東地區(qū)的鴿毛滴蟲分別進行ITS1/5.8S/ITS2基因分析，均檢出A型和B型鴿毛滴蟲。ELKHATAM等[23]對埃及米努菲亞地區(qū)的鴿毛滴蟲進行分析，確定其基因型為A型。西歐和南歐的野生鴿群中均檢出A型及B型鴿毛滴蟲[24]。西班牙東部鴿群中流行的A型鴿毛滴蟲占76.1%，B型鴿毛滴蟲占20.5%，混合感染占3.4%[25]。本研究通過對分離的鴿毛滴蟲進行基于ITS1/5.8S/ITS2基因系統(tǒng)發(fā)育分析及限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性分析，確定其基因型為A型，與英國分離株MT632479.1序列一致[26]。為研究長春地區(qū)鴿毛滴蟲病的流行情況、蟲株致病性和基因型的相關(guān)性提供了依據(jù)。

鴿毛滴蟲病的發(fā)生發(fā)展是鴿毛滴蟲和免疫系統(tǒng)相互作用的病理過程，動物感染模型的建立是研究鴿毛滴蟲致病性和防治技術(shù)的關(guān)鍵途徑。王飛等[16]使用25～30日齡肉鴿灌服1×106個毛滴蟲，連續(xù)5 d，鴿只剖檢可見口腔和咽喉黏膜出現(xiàn)白色干酪樣沉著物，死亡率為0，發(fā)病率為80%。羅峰等[17]使用120日齡健康鴿口腔接種1×107個鴿毛滴蟲,連續(xù)觀察15 d，鴿只感染率為100%，死亡率為18.75%。YOUSSEFI等[18]使用6周齡健康鴿口腔接種4×104個鴿毛滴蟲,連續(xù)觀察7 d，鴿只感染率為100%，死亡率為0。肉鴿對鴿毛滴蟲感染的抵抗力會隨著年齡增長而增強[9]，故肉鴿日齡的選擇十分關(guān)鍵。25日齡肉鴿雖易感鴿毛滴蟲，但需母鴿喂食鴿乳及飼料，在實驗室條件下不易存活；120日齡的肉鴿對鴿毛滴蟲感染的抵抗力較強，在實際生產(chǎn)中多為隱性感染。40日齡肉鴿已脫離母鴿，獨立進食，可在實驗室條件下穩(wěn)定飼養(yǎng)，且40日齡肉鴿仍屬于實際生產(chǎn)中鴿毛滴蟲病發(fā)病率較高的群體[10]。故本研究選用40日齡健康肉鴿(落地王鴿)，每日口腔接種1×106個強致病性的鴿毛滴蟲，連續(xù)5 d，在攻蟲后采集鴿只口咽拭子鏡檢、剖檢觀察感染鴿只口咽病理變化，成功建立了鴿毛滴蟲感染動物模型。

綜上，本研究成功分離鑒定了1株基因A型鴿毛滴蟲，成功進行體外培養(yǎng)并建立感染鴿模型，為研究鴿毛滴蟲免疫機制及藥物篩選等提供了技術(shù)支撐。