反芻動物外植體的研究進展

王秋菊，任雨龍，魏 笑，張 昊，孫 愉，高炳南 (黑龍江八一農(nóng)墾大學 動物科技學院，黑龍江 大慶 163319)

在反芻動物的養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中，經(jīng)常會出現(xiàn)營養(yǎng)代謝紊亂導致的生產(chǎn)性能下降等問題[1]。因此，如何能夠在保證經(jīng)濟效益的前提下，安全高效的解決養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的問題，提高反芻動物生產(chǎn)性能，成為了很多學者頗為關注的內容[2]。

按照學科領域的劃分，外植體有以下兩個定義。在細胞生物學中，外植體是指：在植物組織培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)中，作為離體培養(yǎng)材料的器官或組織片段[3];而在生態(tài)學中將其定義為：把一些生物體移植到人工控制條件下，以觀測它們在環(huán)境變化時的反應，此生物體即為外植體[4]。本文主要就生態(tài)學定義的有關反芻動物外植體的研究進行綜述，希望能夠為反芻動物營養(yǎng)代謝的研究提供新的思路和幫助。

1 外植體在試驗研究中的應用

近年來，反芻動物一直是國內外學者研究的熱門對象。但多數(shù)反芻動物的價格昂貴，樣本采集困難，而外植體能夠代替活體動物機體內的某些反應機制，并且成本低、易采集，成為了很多學者的優(yōu)先選擇[5-7]。然而，由于反芻動物外植體培養(yǎng)技術出現(xiàn)的時間較晚，部分外植體的培養(yǎng)體系尚不完善，國內外有關外植體培養(yǎng)的報道還比較少。

目前，反芻動物外植體的研究對象主要集中于牛，羊等家畜[8-9]，奶牛，綿羊的子宮內膜，腸道以及綿羊的瘤胃外植體已經(jīng)被用于試驗研究?？赡苁怯捎诜雌c動物獨特的消化方式，這些研究主要以細菌或其代謝衍生物與外植體之間的相互作用為切入點開展試驗[10]。

和反芻動物外植體相關的研究不斷取得新的成果，發(fā)現(xiàn)的共同點是隨著培養(yǎng)時間的延長，外植體會出現(xiàn)活性逐漸降低，直至完全喪失的現(xiàn)象。而通過調整培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分以及配比，可以延緩外植體活性的喪失時間。

1.1 瘤胃外植體的應用反芻動物的瘤胃主要分為3層，由腔內層到外層依次是黏膜層，黏膜肌層和漿膜層。黏膜層即為瘤胃上皮，分布著大量的角質化乳頭。瘤胃外植體保留的是瘤胃上皮，它能夠通過上調動物體內與酮體代謝、角蛋白纖維錨定、細菌識別和皮膚屏障等生物學功能有關基因的表達，進化出更強的酮體代謝和調控微生物定植的能力[11]。

有研究通過分離培養(yǎng)綿羊的瘤胃外植體，檢測釀酒酵母β-葡聚糖對綿羊瘤胃外植體中β-防御素-1及其mRNA的影響，發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖能夠有效的促進綿羊瘤胃外植體內β-防御素-1的表達，證實瘤胃外植體比單層瘤胃上皮細胞更能夠保留與機體相似的組織學特征[12]。FATHI等[13]通過體外模擬綿羊瘤胃模型，首次發(fā)現(xiàn)半乳糖凝集素在離體的瘤胃節(jié)段模型中上調，認為瘤胃外植體模型是評估細菌脂多糖對綿羊瘤胃外植體影響的合適工具。而瘤胃外植體在培養(yǎng)24 h后，會出現(xiàn)輕微的上皮細胞層脫落，這種現(xiàn)象主要與培養(yǎng)方法，供體動物和分離部位有關，而24 h也被認為是綿羊瘤胃外植體最佳的培養(yǎng)時間[9]。

1.2 腸道外植體的應用腸道保護屏障主要包括黏膜屏障，生物屏障，免疫屏障，機械屏障。任何一個屏障遭到破壞都會影響動物的生理健康狀況，而腸道屏障功能的維持主要依靠黏膜免疫系統(tǒng)和腸道菌群之間的相互作用[14]。目前，反芻動物腸道免疫與腸道菌群的研究受限于動物品種、養(yǎng)殖環(huán)境和不同生長階段的養(yǎng)殖模式等因素[15]。腸道外植體可以反映腸內膜在黏附中的作用。ADRIAN等[16]將eaeA基因插入到滅活的大腸桿菌中，進行犢牛腸道外植體黏附試驗，證實了腸道外植體內膜的缺失與大腸桿菌的黏附程度無關。FRANCIS等[17]明確了大腸桿菌在牛的結腸，回腸和直腸外植體上的定植、附著和消退的病變變化。此外，有研究用細菌激活劑刺激大腸外植體，明確TNF-α，IL-1RA等細胞因子在大腸外植體內的釋放機制，證明腸道外植體可以反映機體對外界刺激產(chǎn)生免疫的機制[18]。腸道外植體在研究菌群調控動物的營養(yǎng)代謝、免疫物質活性和增強抗炎細胞因子表達等方面，起著十分重要的導向作用。

1.3 子宮內膜外植體的應用子宮內膜和機體中大多數(shù)黏膜一樣，是病原菌侵入機體時第一道發(fā)揮作用的防線[19]。它對病原體的免疫反應體系包括補體系統(tǒng)、抗菌肽、免疫球蛋白、急性期蛋白和模式識別受體[20]。細菌感染通常通過先天免疫途徑引起牛子宮內膜炎和不孕。然而，直接使用細胞進行的機制研究可能會因為子宮內膜結構的破壞，以及相關分子模式的損傷而受影響，所以完整的子宮內膜外植體模型是研究反芻動物先天免疫和炎癥較好的體外模型[21]。有研究建立了完整的子宮內膜體外模型，發(fā)現(xiàn)子宮內膜外植體對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌或其識別病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)都存在功能性的先天免疫應答，該技術為免疫機制的體內觀察研究以及體外研究提供一個有效的途徑[22]。LI等[23]從奶牛子宮內膜黏膜層中分離出含上皮和間質組織的內膜組織，明確了β-雌二醇對奶牛子宮內膜外植體中前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)功能發(fā)揮的影響，發(fā)現(xiàn)外植體培養(yǎng)的條件越接近動物體內的生理環(huán)境，外植體存活時間也會越長。MIYNARCZUK等[24]在添加不同劑量的農(nóng)藥后發(fā)現(xiàn)，質量濃度低于100 μg/L的農(nóng)藥對牛絨毛膜外植體的活性不會產(chǎn)生影響，證實了犢牛絨毛膜外植體存在著與體內相似的反應機制。此外，牛子宮內膜外植體可以間接反映LPS對子宮內膜上皮細胞增殖能力和形態(tài)損傷的影響[25]。

2 外植體模型的構建方法

外植體的采集和培養(yǎng)方法需要根據(jù)組織的來源以及具體的試驗目的來確定。無論是瘤胃外植體，腸道外植體還是子宮內膜外植體，在采取時要求整個過程無菌操作，且組織要完整，為了減緩組織活性的喪失，用含有雙抗的PBS緩沖液沖洗掉雜物后，通常在37℃條件下置于含雙抗的PBS緩沖液中暫存[26]。

瘤胃外植體需要分離瘤胃組織的漿膜層和黏膜肌層，保留黏膜層，再將黏膜層剪切成4 mm2大小，瘤胃乳頭朝上放置于6孔培養(yǎng)板中。在37℃、5% CO2環(huán)境中進行培養(yǎng)，使用DMEM/F12培養(yǎng)基即可滿足營養(yǎng)需要[27]。在培養(yǎng)基中不添加胎牛血清可能更有利于瘤胃外植體的存活以及形態(tài)結構的維持[28]。

腸道外植體的分離方法與瘤胃外植體十分相似，需要保留腸道組織的上皮部分，棄去其他部分。用無菌的PBS緩沖液多次沖洗后，使用DMEM培養(yǎng)基作為培養(yǎng)液，并補充氯霉素，氨芐西林或者四環(huán)素，使之終質量濃度分別為10，100，30 mg/L。在37℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)6 h后收取樣品[29]。也有研究將腸道外植體剪切成12 mm2，置于RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)[30-31]。

在分離子宮內膜時，用70%的酒精先沖洗子宮外表面，沖洗干凈后使用無菌剪刀縱向打開子宮角，再用含抗生素的PBS(50 IU/mL青霉素，50 mg/L鏈霉素，2.5 mg/L兩性霉素B)沖洗暴露的子宮內膜，然后使用無菌剪刀分離出大約2 mm厚的半透明子宮內膜。將之轉移到6孔組織培養(yǎng)板中，添加3 mL含有10%滅活胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)基。在37℃、5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)，每24 h或者更短的時間更換1次培養(yǎng)基[22]。培養(yǎng)期間根據(jù)具體的試驗設計進行不同的處理,在外植體培養(yǎng)時，需要讓組織與空氣充分接觸，使細胞能夠更好的吸收氧氣，同時還要防止組織代謝產(chǎn)物造成的培養(yǎng)基過度酸化，導致外植體的存活時間縮短[23]。

總之，培養(yǎng)外植體使用常規(guī)細胞培養(yǎng)基DMEM，RPMI 1640、DMEM/F12等可基本滿足營養(yǎng)需要，至于是否添加胎牛血清以及添加血清的含量還需要進一步的驗證，在不同的研究中使用抗生素的種類和含量也存在一些差異。而目前有關不同培養(yǎng)基以及抗生素對外植體培養(yǎng)效果差異的研究報道較少。因此，在構建外植體模型時，具體的培養(yǎng)方法還需要根據(jù)試驗的目的和要求進行細節(jié)上的變動和完善。

3 外植體活性的評價方法

3.1 細胞角蛋白-18細胞角蛋白(cytokerati，CK)通常在上皮細胞中可以檢測到，它與上皮細胞的種類，增殖和分化聯(lián)系密切，常用來評價上皮組織的完整性以及上皮細胞分化程度[32]。CK有20種，是最大的中間絲蛋白家族成員。在這些CK中，細胞角蛋白-18(cytokerati-18，CK-18)在構成細胞骨架，維持機體組織結構的完整性中發(fā)揮著十分重要的作用。

在不同的細胞分化階段和不同種類的上皮細胞中，CK的表達也是不同的。Ⅰ型CK呈酸性，Ⅱ型CK呈中性或堿性[33]。而CK-18根據(jù)酸堿性分類屬于Ⅰ型CK，當細胞發(fā)生凋亡時，CK-18會被端粒酶特異性裂解[34]。利用CK-18的這種特性可以鑒別培養(yǎng)組織中的細胞是發(fā)生凋亡還是發(fā)生壞死，即死亡細胞釋放CK-18如果為端粒酶裂解，則為細胞凋亡。如果是非裂解形式，則為細胞壞死[35]。

通過檢測CK-18的M65片段與M30片段濃度的比值也可以判斷培養(yǎng)組織細胞的死亡形式[36]。在細胞發(fā)生凋亡時，CK-18會被半胱天冬酶切割，產(chǎn)生的片段會釋放到細胞外，這些裂解的片段會進一步促進細胞凋亡。因此，細胞外的 CK-18 濃度間接反映了凋亡細胞的數(shù)量，CK-18的M65與M30 2個片段可作為細胞凋亡的標志物[37]。

3.2 抗原Ki-67抗原Ki-67(antigen Ki-67，Ki-67)是一種核蛋白，其基因主要由15個外顯子與14個內含子組成[38]。它與細胞內核糖體RNA的轉錄緊密相關，在細胞增殖過程中的各個周期(G1期，S期，G2期和M期)中都能夠表達，只有在細胞靜止時期(G0期)不表達[39]。由于Ki-67在細胞增殖時期表現(xiàn)較為活躍，而在細胞停止增殖時則會消失，所以通常稱之為細胞增殖指數(shù)(proliferation index，PI)，可作為細胞增殖狀態(tài)的標志反應細胞的增值活躍程度，Ki-67蛋白表達越高，則說明細胞增殖的活性越強[40]。此外，Ki-67具有顯示細胞生長活性的特性，利用這種特性判斷細胞的增殖活性具有比較高的靈敏度，常用來評估細胞的生長狀態(tài)[41]。從根本上來看，外植體是諸多組織細胞緊密連接的一個整體，細胞的活性也可以反映整個外植體的活性。因此，Ki-67作為評價外植體活性的指標具有較高的靈敏度以及準確性。

3.3 E-鈣黏附蛋白E-鈣黏附蛋白(epithelia cadherin，E-cadherin)是黏附蛋白家族中十分重要的一類單鏈跨膜蛋白，參與機體細胞與細胞間黏附的生理過程。根據(jù)鈣黏附蛋白的分子結構以及基因序列可以將其分為經(jīng)典鈣黏附蛋白、橋粒鈣黏附蛋白、原始鈣黏附蛋白以及其他的一些鈣黏附蛋白相關蛋白[42]。在反芻動物機體中，它廣泛分布于各類組織的上皮細胞中，在維持組織細胞的結構完整以及抑制細胞之間的離散等方面起著十分重要的作用[43]。E-cadherin在動物組織中的表達量逐漸下降時，則表明組織中的細胞黏附能力由強向弱轉變，細胞也比較容易從組織中脫落下來，組織的活性也會隨之降低[44]。

3.4 蘇木精-伊紅染色蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)，即HE染色，是觀察組織細胞形態(tài)和結構完整性的常用方法。一般動物外植體正常的生理變化或者是添加某些刺激物之后的形態(tài)變化，都可以通過HE染色方法觀察出來，這主要是培養(yǎng)組織中的不同成分對染液的親和力不同造成的[45]。HE染色的切片在經(jīng)過適當?shù)奶幚碇?，組織中的細胞核會呈現(xiàn)出十分清晰的深藍色區(qū)域，而細胞的細胞質和細胞外基質中的各種成分則會呈現(xiàn)出深淺不一的粉紅色，從而能夠將各種組織或細胞成分的形態(tài)結構特點顯現(xiàn)出來[46]。

3.5 細胞計數(shù)試劑盒與噻唑藍法細胞計數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)和噻唑藍(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)法是較為普遍的檢測動物外植體和細胞活性方法。CCK-8法與MTT法相比有更多的優(yōu)點，不但能夠減少外植體在空氣中的暴露時間，降低活性損失，而且CCK-8法檢測動物外植體活性的靈敏度也優(yōu)于MTT法，整個試驗過程不需要放射性同位素和有機溶劑，對外植體細胞的毒性很低，外植體細胞形態(tài)基本上不會發(fā)生變化，而MTT法會導致細胞的形態(tài)完全消失。在外植體的培養(yǎng)過程中，分離的樣本量是十分多的，所以CCK-8法更加適合動物外植體活性的檢測[47]。除了CCK-8和MTT方法外，還有一些比較方便快捷的檢測方法，比如XTT鈉鹽(XTT sodium salt，XTT)法，水溶性四唑鹽-1(WST-1)法等。

4 外植體存在的問題與展望

4.1 外植體存在的問題

4.1.1培養(yǎng)存活時間短 外植體的存活時間主要與培養(yǎng)方法、供體動物和分離部位有關[18]。存活時間短的特點也決定了外植體模型僅僅適用于一些試驗周期短的研究。而通過進一步豐富培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質，能夠延長牛子宮內膜外植體上皮細胞和外周基質細胞的生存時間至48 h[26]。因此，如何進一步優(yōu)化培養(yǎng)條件，延長外植體存活時間，是外植體培養(yǎng)技術面臨的主要問題。

4.1.2組織采取技術要求高 大多數(shù)外植體模型的采集都是通過用器械對組織物理切割獲得的，對采集的手法和準確度有較高的要求。在采集動物子宮內膜時，需要用手術剪剪開子宮角中間的側壁部分，再將子宮內膜從子宮肌層上揭下來，這個過程中很有可能會出現(xiàn)子宮內膜破損等情況[28]。

4.1.3組織處理精確度低，誤差大 當試驗有較多的分組或對組織塊大小有要求時，這個問題是無法避免的。目前并沒有特定的器材能夠準確而快速的將組織處理成相同的大小。利用普通的手術器械操作誤差較大，很難保證每個分組中組織的大小相同，會給試驗結果帶來較大的影響[48]。

4.2 展望近年來，諸多學者從試驗中發(fā)現(xiàn)問題，解決問題，對外植體存活時間短，組織處理操作困難等問題進行了積極的探索[9-13]。進一步改進了外植體的培養(yǎng)技術方案，對外植體培養(yǎng)技術的應用與發(fā)展起到了極大的推動作用，促進了反芻動物外植體培養(yǎng)技術的完善與進步。但由于諸多外植體培養(yǎng)技術存在一些差異，尤其是環(huán)境條件，營養(yǎng)供應和生長因子等方面，對試驗結果會造成不同程度的影響，導致外植體培養(yǎng)技術的使用范圍仍具有一定的局限性[49-51]。因此，我們需要根據(jù)外植體的來源以及試驗目的等因素，整合各個培養(yǎng)方案中的優(yōu)點，建立一個有針對性的、系統(tǒng)的、標準化的培養(yǎng)方案。

隨著新研究的不斷進行，反芻動物外植體培養(yǎng)技術也會日趨完善。這項技術的應用和普及有利于充分發(fā)揮外植體的優(yōu)勢，降低試驗成本，豐富研究內容，為反芻動物營養(yǎng)代謝，黏膜免疫機制，感染預防以及治療等方向的研究提供試驗基礎。在生產(chǎn)實踐方面，也能為解決養(yǎng)殖生產(chǎn)中存在的問題提供一定的理論幫助。