非洲豬瘟疫苗研究進(jìn)展

石建州，何 健，劉陽坤，李 娜，陳宇婧，王國川，黃 克，姚倫廣* (1.南陽師范學(xué)院 生命科學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，河南 南陽 473061；2.南陽師范學(xué)院 河南省畜禽保健品工程技術(shù)研究中心，河南 南陽 473061)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)首先于1921年在肯尼亞暴發(fā)，該疾病是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染豬科動(dòng)物的一種烈性傳染病，可感染各個(gè)品種和所有年齡段的家豬及野豬，其主要特征是病程短、高熱和出血性病變，病死率高達(dá)100%，屬于養(yǎng)豬業(yè)毀滅性疾病之一，是重點(diǎn)防范的一類動(dòng)物疾病[1]。ASFV在20世紀(jì)中葉侵入歐洲，隨后傳至南美洲。在過去的十幾年里，ASF流行加速，2007年基因Ⅱ型ASFV已經(jīng)自東非蔓延至高加索地區(qū)、俄羅斯聯(lián)邦和東歐許多國家，構(gòu)成了進(jìn)一步擴(kuò)張的危險(xiǎn)態(tài)勢[2]。2018年8月，我國首例ASF疫情發(fā)生在遼寧[3]，隨即迅速席卷全國各省。由于尚無商業(yè)化應(yīng)用疫苗和抗病毒藥物，因此，撲殺成為控制疫情的首選，也是遏制疫情最有效的方法，生豬養(yǎng)殖遭受重創(chuàng)，防控形勢嚴(yán)峻。

ASFV能夠長時(shí)間穩(wěn)定存在于環(huán)境中，在豬科動(dòng)物間高效傳播。家豬、野豬和軟蜱為ASFV的天然宿主[4]。ASFV是一種龐大而復(fù)雜、有囊膜的線性雙鏈DNA病毒，屬于非洲豬瘟病毒科(Asfarviridae)、豬瘟病毒屬(Asfivirus)的唯一成員，也是目前唯一已知的蟲媒DNA病毒[5]。病毒粒子的直徑為260～300 nm，具有與核質(zhì)大DNA病毒(nucleocytoplasmic large DNA viruses，NCLDV)超家族相同的結(jié)構(gòu)、基因組以及復(fù)制特性。ASFV的整體結(jié)構(gòu)呈20面體立體對(duì)稱形態(tài)，具有多層結(jié)構(gòu)[6-7]，成熟病毒粒子包括5層結(jié)構(gòu)，由內(nèi)到外依次是病毒基因組(nucleoid)、內(nèi)核芯殼(core shell)、內(nèi)膜(inner envelope)、衣殼(caspid)和外囊膜(outer envelope)[8]。依據(jù)p72(B646L)C末端核苷酸序列差異，已鑒定出24種ASFV基因型[9]，中國、東南亞等亞洲地區(qū)以及東歐地區(qū)流行的主要是基因Ⅱ型，歐洲主要流行基因Ⅰ型和Ⅱ型。

ASFV感染周期包括吸附、內(nèi)化、復(fù)制、組裝和釋放。ASFV具有細(xì)胞嗜性，復(fù)制主要發(fā)生在網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞中，病毒主要依賴網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用和巨胞飲作用侵入宿主細(xì)胞，病毒內(nèi)層囊膜與內(nèi)體膜融合，在病毒“工廠”組裝，以出芽方式釋放到細(xì)胞外[10-11]。豬感染病毒后的重要特征為免疫抑制，細(xì)胞發(fā)生凋亡。病毒結(jié)構(gòu)和增殖過程復(fù)雜[4]，毒株間基因組介于170～194 kb之間，含有150～167個(gè)開放閱讀框，編碼150～200種蛋白[12]，成熟病毒粒子中含有至少50種結(jié)構(gòu)蛋白和100多種非結(jié)構(gòu)蛋白，參與ASFV基因組的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、病毒組裝等感染、增殖以及免疫逃逸等過程[13]，具有調(diào)控宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)、干擾宿主天然免疫系統(tǒng)和逃逸適應(yīng)性免疫應(yīng)答等功能，能夠抑制和逃避宿主的免疫，便于病毒的擴(kuò)增[14]。

2020年，我國出現(xiàn)低致死率的ASFV基因Ⅱ型自然變異流行株，至少包括4種CD2v編碼失活突變類型，病毒粒子喪失紅細(xì)胞吸附性能，致病力減弱，但是存在明顯的殘留毒力，高劑量接種會(huì)使豬死亡或呈現(xiàn)亞急性、慢性臨床癥狀，低劑量感染豬呈現(xiàn)持續(xù)性和慢性臨床癥狀。ASFV水平傳播能力強(qiáng)，潛伏期長，具有一定的隱蔽性，變異株和經(jīng)典株共存共流行，較難早期診斷，監(jiān)測和精準(zhǔn)清除更加困難，給ASF防控帶了更大的挑戰(zhàn)[15]。在這種復(fù)雜的防控形勢下，不僅需要制定和實(shí)施嚴(yán)格的預(yù)防和控制策略，也要高度重視候選疫苗的創(chuàng)制，接種ASF疫苗依然是防控的最好策略之一。ASFV龐大的基因組結(jié)構(gòu)和復(fù)雜的免疫逃逸機(jī)制，不僅阻礙了商品化疫苗的創(chuàng)制，并且對(duì)疫苗的穩(wěn)定性和有效性提出了嚴(yán)峻考驗(yàn)。雖然始于20世紀(jì)60年代的ASF疫苗研發(fā)均以失敗告終，但是還是取得了較大的進(jìn)展。本研究將對(duì)ASF傳統(tǒng)疫苗和基因工程致弱活疫苗、病毒活載體疫苗、亞單位疫苗和DNA疫苗等新型疫苗的進(jìn)展進(jìn)行介紹，以期為ASF疫苗的研究提供參考。

1 傳統(tǒng)疫苗

1.1 滅活疫苗傳統(tǒng)病毒疫苗通常包括滅活疫苗和致弱疫苗。滅活疫苗是一類常規(guī)疫苗，發(fā)現(xiàn)一種新的病毒，一般先研制滅活疫苗[16]，具有制備技術(shù)簡單，成本較低等優(yōu)點(diǎn)[17]。滅活疫苗由滅活的病原微生物制成，通過物理或化學(xué)方法使其感染能力喪失，但免疫接種能夠激活免疫系統(tǒng)，仍保留抗原性，一般不能刺激產(chǎn)生完整的細(xì)胞免疫反應(yīng)[18]，這是滅活疫苗的固有缺陷。滅活疫苗是最經(jīng)典的疫苗研制方式，ASF疫情流行之后，最先嘗試的就是滅活疫苗的相關(guān)研究。因?yàn)轶w液免疫和細(xì)胞免疫在對(duì)抗ASFV感染過程中都很重要，而滅活疫苗引發(fā)先天免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的細(xì)胞免疫水平較低，所以，很多研究通過添加佐劑刺激產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)，以增強(qiáng)滅活疫苗的效力[19]。

滅活的抗原包括接種病毒的豬肺泡巨噬細(xì)胞、感染豬的脾組織、感染細(xì)胞的提取物、滅活純化的病毒粒子以及感染豬的外周血白細(xì)胞上清[20]。滅活方式主要有加熱、福爾馬林、甲苯、甲醛、復(fù)方碘溶液、縮水甘油醛、結(jié)晶紫、乙酰氮丙啶、β-丙內(nèi)酯等理化方法[21]。

由于病毒結(jié)構(gòu)復(fù)雜、免疫逃避機(jī)制不清晰，以及缺失中和抗體介導(dǎo)的有效保護(hù)[22]，傳統(tǒng)的滅活疫苗不能有效預(yù)防ASFV。采用不同傳統(tǒng)方法滅活的疫苗接種能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價(jià)的抗體，但難以檢測出中和抗體[23]，均沒有達(dá)到理想的免疫效果，不能提供有效保護(hù)，無法抵御ASFV感染。迄今為止，沒有研制出滿意的候選滅活疫苗。即使用滅活的ASFV全病毒輔以新型佐劑(PolygenTM或Emulsigen?-D)和制備工藝重新評(píng)估滅活疫苗，雖可檢測到特異性抗體，但滅活疫苗的功效沒有提高，甚至出現(xiàn)了抗體依賴性增強(qiáng)，抗體的存在可能會(huì)使病情加重，推測與病毒免疫逃逸機(jī)制或者病毒顆粒的胞內(nèi)或胞外成熟方式有關(guān)[24]?，F(xiàn)有研究數(shù)據(jù)表明，通過ASFV滅活途徑制備有效候選疫苗不可行。

1.2 弱毒活疫苗滅活或亞單位疫苗難以誘導(dǎo)中和抗體，無法提供有效保護(hù)，理論上，弱毒活疫苗更具可行性。依據(jù)病毒致弱方法，ASF減毒活疫苗包括傳統(tǒng)減毒活疫苗和重組減毒活疫苗。傳統(tǒng)活疫苗包括自然弱毒株和人工傳代致弱毒株2種。ASFV傳統(tǒng)弱毒活疫苗的研究集中在分離鑒定自然致弱毒株、人工細(xì)胞(豬骨髓來源細(xì)胞、Vero細(xì)胞和COS-1細(xì)胞等)傳代致弱毒株[21]。自然致弱毒株在傳播流行過程中毒力下降，用其制備的疫苗使用劑量小、免疫原性好、免疫持續(xù)時(shí)間長、成本低[17]。自然致弱毒株和人工傳代致弱毒株生產(chǎn)的弱毒疫苗都存在免疫不良反應(yīng)、潛在的散毒風(fēng)險(xiǎn)、毒力返強(qiáng)、遺傳背景模糊、生物安全隱患等眾多缺陷，阻礙了ASF傳統(tǒng)弱毒疫苗的使用。不僅生物安全是傳統(tǒng)弱毒活疫苗的隱患，而且由于不能鑒別弱毒活疫苗免疫和野毒感染，增加ASFV凈化的難度。

用自然弱毒株NH/P68或OURT88/3免疫豬，可誘導(dǎo)豬產(chǎn)生抵御同源強(qiáng)毒株攻擊的保護(hù)作用，甚至達(dá)到100%的有效保護(hù)率[25-27]。ASFV基因Ⅱ型自然弱毒株Lv17/WB/Rie1無紅細(xì)胞吸附活性，對(duì)歐亞野豬進(jìn)行口服免疫，對(duì)強(qiáng)毒株Arm07的攻擊具有92%的保護(hù)作用[28]，自然弱毒株作為疫苗使用產(chǎn)生發(fā)熱、肺炎、流產(chǎn)、慢性感染甚至死亡等諸多副作用，有弱毒返強(qiáng)、散毒的風(fēng)險(xiǎn)[25,29]。在細(xì)胞傳代培養(yǎng)過程中，伴隨著對(duì)ASFV基因組部分區(qū)域的重大修改，包括基因的丟失和表型的改變，致使毒力減弱，喪失對(duì)母本病毒攻擊的保護(hù)效力[21]。例如，隨著在Vero細(xì)胞中傳代培養(yǎng)次數(shù)的增加，Georgia株的復(fù)制能力增強(qiáng)，在豬原代巨噬細(xì)胞中的復(fù)制能力下降，ASFV毒力逐漸衰弱，傳至第110代，毒力完全消失，獲得的傳代致弱毒株ASFV-G/V的抗原性改變，免疫家豬后不能誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答，無法抵御親本病毒的攻擊，推測是由基因組中多基因家族MGF360/505基因的自發(fā)缺失導(dǎo)致[29]。

用豬骨髓細(xì)胞傳代致弱的毒株免疫豬能夠使其抵抗強(qiáng)毒株感染，但是該弱毒株活疫苗在葡萄牙與西班牙的田間試驗(yàn)導(dǎo)致了災(zāi)難性的后果，免疫豬出現(xiàn)肺炎、流產(chǎn)以及死亡等嚴(yán)重的不良反應(yīng)，并出現(xiàn)眾多的病毒攜帶豬，在田間感染與異源強(qiáng)毒株并存情況下，大量的免疫豬出現(xiàn)慢性感染的臨床癥狀[23,25,30]。細(xì)胞傳代致弱毒株抗原性改變，無免疫保護(hù)作用[25,29,31]。病毒體外在豬原代巨噬細(xì)胞、Vero細(xì)胞、豬骨髓細(xì)胞、COS-1細(xì)胞、MS細(xì)胞中增殖、傳代過程中，致病力減弱，免疫原性和穩(wěn)定性也下降，難以通過傳代致弱途徑獲得安全有效的弱毒活疫苗。傳代致弱毒株的致病性是此類疫苗開發(fā)的主要阻力。

ASFV傳統(tǒng)減毒活疫苗能夠誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，對(duì)同源病毒攻擊的保護(hù)作用持續(xù)時(shí)間較長。生物安全問題是減毒活疫苗使用的隱患，可能會(huì)出現(xiàn)慢性感染的臨床癥狀[31]，安全性是ASF弱毒活疫苗研究的主要內(nèi)容。

2 基因工程疫苗

ASF疫苗的研制面臨著巨大的挑戰(zhàn)，至今無有效商品化疫苗可用，主要因?yàn)锳SFV的多樣性和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性、以及ASFV與宿主細(xì)胞互作關(guān)系、免疫逃逸機(jī)制、保護(hù)性抗原等信息缺乏。研發(fā)的基因工程疫苗，重組減毒活疫苗、病毒活載體疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗等新型疫苗具有比傳統(tǒng)疫苗免疫效果好、安全性能高、人為設(shè)計(jì)操控性強(qiáng)等優(yōu)勢，是ASF疫苗研制的主要方向[17]。尋找合適的抗原蛋白用于新型疫苗的研究至關(guān)重要。通過基因工程獲取有效的候選疫苗是最有希望的途徑。通過精準(zhǔn)刪除毒力和免疫抑制基因，獲得安全有效的弱毒疫苗是目前相對(duì)可行的技術(shù)路線。

2.1 基因工程減毒活疫苗致弱活疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)強(qiáng)烈持久，然而生物安全是潛在的風(fēng)險(xiǎn)，可以使用缺失靶向基因、重組基因等基因工程技術(shù)提高減毒活疫苗的安全性。單基因或多基因改造弱毒株或強(qiáng)毒株的重組減毒活疫苗已成為ASF基因工程疫苗研究的熱點(diǎn)[32]。基因缺失疫苗最具發(fā)展?jié)摿?，通過反向遺傳技術(shù)定點(diǎn)突變病毒基因組序列，把得到的基因缺失突變株制備成疫苗，可區(qū)分野毒感染和疫苗免疫[17]。毒力相關(guān)基因的缺失已被證明是一種有用的使毒力致弱的手段，毒力基因缺失疫苗甚至產(chǎn)生交叉保護(hù)[33]。

ASFV基因缺失弱毒疫苗可能是最快可以獲得商品化疫苗的途徑，需要解決有效性、安全性、量產(chǎn)等關(guān)鍵難點(diǎn)，是短期內(nèi)最有希望研制成功的疫苗。構(gòu)建ASFV重組減毒活疫苗應(yīng)重視其生物安全性[34]，在實(shí)現(xiàn)病毒復(fù)制誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的同時(shí)，還應(yīng)該避免發(fā)生病毒血癥等亞臨床癥狀，可以考慮刪除病毒復(fù)制必需基因[35-36]，研發(fā)復(fù)制缺陷型疫苗[12,16]。

鑒于ASFV耐受豬可獲得有效的保護(hù)性免疫反應(yīng)，ASF減毒活疫苗被認(rèn)為是候選疫苗[37]。重組減毒活疫苗是通過分子生物技術(shù)，靶向刪除單個(gè)或多個(gè)目的基因(毒力基因、功能基因、保守區(qū)基因、免疫抑制相關(guān)基因等)以減弱病毒毒力或者增強(qiáng)免疫應(yīng)答水平，理論上比傳統(tǒng)減毒活疫苗更加安全有效。目前，ASF重組減毒活疫苗的研究主要集中在構(gòu)建缺失強(qiáng)毒株或弱毒株毒力基因如UK[38]、TK[39]、9GL[40-41]和CD2v[42]、DP148R[43-44]，以及免疫逃逸相關(guān)基因如多基因家族MGF[40,45-46]、DP71L[47-48]、DP96R[49]、A238L[50]和A224L[31]。敲除毒力基因使毒株致弱。制備疫苗用于免疫接種并評(píng)價(jià)疫苗的安全性和有效性的研究發(fā)現(xiàn)，有的候選株能夠產(chǎn)生針對(duì)同源毒株或異源毒株的特異性保護(hù)作用[32,51-52]，有的候選株保護(hù)效果降低或者無保護(hù)效力[39-40,49]，有的候選株具有交叉保護(hù)作用[42]，開發(fā)出商品化疫苗的可能性較大。

在通常情況下，基因缺失疫苗能誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)，保護(hù)率較高，保護(hù)效果較明顯，但是安全性是相對(duì)的，殘存毒力能夠引起亞臨床癥狀以及低水平病毒血癥等副作用[16]，安全性是成功研發(fā)減毒疫苗亟待解決的關(guān)鍵問題。

近期，研究人員通過刪除毒力、復(fù)制或先天免疫應(yīng)答相關(guān)基因，人工把強(qiáng)毒株設(shè)計(jì)成為弱毒株，成功構(gòu)建了1株聯(lián)合缺失7個(gè)基因(MGF505-1R、MGF505-2R、MGF505-3R、MGF360-12L、MGF360-13L、MGF360-14L和CD2v)的ASF弱毒活疫苗HLJ/18-7GD，體內(nèi)完全致弱，不能轉(zhuǎn)化為強(qiáng)毒株，并對(duì)強(qiáng)毒株完全保護(hù)，該有效性和安全性良好的疫苗有望在控制ASF傳播方面發(fā)揮積極作用[53]，是當(dāng)前最具產(chǎn)業(yè)化前景的商品疫苗。研發(fā)的ASFV-G-ΔI177L是一種有效的抗ASF歐亞株的口鼻疫苗,通過從高致病毒株Georgia(ASFV-G)中刪除基因I177L獲得，對(duì)同源毒株具有較高的有效性和安全性，口鼻給藥途徑達(dá)到了與肌肉給藥相似的效果。雖然口鼻給藥的復(fù)制效率較低，但仍然誘導(dǎo)了全身抗體反應(yīng)，保護(hù)動(dòng)物免受ASFV-G的攻擊。推測ASFV-G-△I177L的口鼻給藥是一種可行的疫苗給藥方法[54]，其安全性、有效性需進(jìn)一步評(píng)價(jià)。

重組減毒活疫苗在前期試驗(yàn)研究中表現(xiàn)出了良好的保護(hù)效果，對(duì)親本毒株能夠達(dá)到100%的保護(hù)率，提供完全保護(hù)，有的也有交叉保護(hù)作用。保護(hù)力、殘存毒力和持續(xù)感染力，即安全性和有效性是成為候選重組減毒活疫苗毒株的決定因素。所以鑒定合適的缺失靶基因，確定缺失靶基因的科學(xué)組合以及免疫策略和生物安全性是確保研制出既能誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)又安全可靠的疫苗的保證[23]。

疫苗的成功不僅取決于有效性、安全性，還要求能夠?qū)崿F(xiàn)量產(chǎn)。量產(chǎn)的關(guān)鍵在于尋找成本不高且能夠進(jìn)行有效復(fù)制的體外細(xì)胞系。目前，實(shí)驗(yàn)室常用的豬骨髓細(xì)胞(PBM)、原代豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)等細(xì)胞系難以實(shí)現(xiàn)ASF疫苗量產(chǎn)。近期報(bào)道了毒力致弱的HLJ/18-7GD與ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR 2種基因缺失弱毒活疫苗在一定程度上實(shí)現(xiàn)了量產(chǎn)的突破。HLJ/18-7GD株在豬骨髓細(xì)胞中生長順利，可以保持良好的免疫原性[53]；ASFV-G-ΔI177L/ΔLVR是一種針對(duì)當(dāng)前大流行毒株的適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)的疫苗病毒株，是第1個(gè)經(jīng)過合理設(shè)計(jì)的ASF候選疫苗，解決了量產(chǎn)問題，可用于大規(guī)模商業(yè)疫苗生產(chǎn)[55]。2021年6月，弱毒疫苗HLJ/18-7GD株，已完成安全評(píng)價(jià)生產(chǎn)試驗(yàn)和第2階段臨床試驗(yàn)，遺傳穩(wěn)定，不致病、不返強(qiáng)，對(duì)育肥豬生長發(fā)育、增重和死淘等無不良影響；對(duì)田間商品豬存活保護(hù)率大于80%，具備量產(chǎn)的應(yīng)用條件[56]，為ASF的防控帶來曙光。

2.2 病毒活載體疫苗在預(yù)防病毒感染和清除病毒過程中，保護(hù)作用的提供依賴于抗體和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)反應(yīng)，為了獲得更強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫，將ASFV抗原基因重組至活病毒載體內(nèi)[57]。以痘病毒、腺病毒或偽狂犬病病毒等為保護(hù)性抗原表達(dá)載體，從而激發(fā)更佳的細(xì)胞免疫和CTL應(yīng)答[58]。

研究顯示，在抗ASFV感染中，細(xì)胞免疫和體液免疫均不可或缺[59]。目前，ASFV活載體疫苗的研究相對(duì)較少[10]，ASFV活載體疫苗的研制主要是在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答方面[60]。通過選用腺病毒(adenovirus)、痘病毒(poxviuses)、偽狂犬病病毒(pseudorabies)、甲病毒(alphavirus)等載體表達(dá)ASFV保護(hù)性抗原基因(CD2v、EP153R、p72、p54、p30、p12等)進(jìn)行疫苗的研制，以期激發(fā)高水平的細(xì)胞免疫和CTL反應(yīng)[21]。將基因p30、p54、p72和p22重組入桿狀病毒，免疫后豬體內(nèi)產(chǎn)生中和抗體[61]，構(gòu)建桿狀病毒載體的BacMam-sHAPQ可誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞應(yīng)答，在缺乏抗體的情況下，部分豬可以抵抗同源亞致死毒株的攻擊，提供部分保護(hù)[62]。

在復(fù)制缺陷型腺病毒Ad5載體中分別插入ASFV的基因B646L(p72)、CP204L(p32)、E183L(p54)和CP530R(pp62)來表達(dá)Ad-ASFV多抗原，不同劑量配制不同佐劑，采用“雞尾酒”式混合或加強(qiáng)免疫策略，誘導(dǎo)豬機(jī)體產(chǎn)生良好的特異性抗體、細(xì)胞免疫應(yīng)答和CTL反應(yīng)[63]。將ASFV的7個(gè)抗原基因B438L、K205R、A151R、B119L、B602L、A104R和EP402R分別重組入復(fù)制缺陷型腺病毒載體，配制佐劑，實(shí)施“雞尾酒”式混合免疫商品豬，在豬體內(nèi)誘導(dǎo)獲得了強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)以及細(xì)胞免疫應(yīng)答[23]。研究證實(shí)，接種此疫苗的豬能夠產(chǎn)生特異性抗體以及CTL反應(yīng)，但不能提供完全保護(hù)作用，免疫效果均不理想，疫苗的有效性需通過攻毒保護(hù)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證[64]。

利用HEK293細(xì)胞表達(dá)ASFV的基因p72(B646L)、p54(E183L)和 p12(O61R)，用改良的減毒牛痘病毒安卡拉(MVA)株病毒載體表達(dá)p72(B646L)、 EP153R 和CD2v(EP402R)，設(shè)計(jì)免疫策略，可誘導(dǎo)機(jī)體獲得特異性抗體和T細(xì)胞反應(yīng)[65]。

研究人員利用質(zhì)粒載體和重組牛痘病毒克隆了47個(gè)ASFV基因，用DNA初免，用重組牛痘病毒加強(qiáng)免疫，攻毒后免疫豬出現(xiàn)急性臨床癥狀，但血液與淋巴組織中的病毒水平顯著下降，提示利用多種保護(hù)性抗原協(xié)同免疫能夠增強(qiáng)疫苗的免疫保護(hù)水平[66]。

利用甲病毒載體表達(dá)ASFV抗原的復(fù)制子顆粒(RP)。構(gòu)建表達(dá)p30(RP-30)、p54(RP-54)和pHA-72(RP-sHA-p72)抗原的甲病毒RPs。在Vero細(xì)胞上表達(dá)量最高以及豬體免疫原性最強(qiáng)的是RP-30；用減毒活病毒增強(qiáng)的策略可能會(huì)擴(kuò)大對(duì)ASFV表位的識(shí)別[67]。

使用CRISPR/Cas9技術(shù)在偽狂犬病病毒載體中插入pE199L(E199L)、p30(CP204L)和p22(KP177R)構(gòu)建病毒活載體疫苗，結(jié)果顯示密碼子優(yōu)化后的E199L表達(dá)明顯增加，嵌合CAG啟動(dòng)子提高了轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)[21,68]。以偽狂犬病病毒為載體構(gòu)建表達(dá)CD2v和p12蛋白的重組偽狂犬病病毒，結(jié)果顯示重組毒株的毒力相比野生型毒株P(guān)RV-Fa明顯減弱[69]。

ASFV活載體疫苗的研制需要進(jìn)一步評(píng)價(jià)多抗原疫苗的免疫原性基因以及潛在的保護(hù)性抗原基因、基因組合、免疫原性以及對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的保護(hù)效力[64]。

2.3 亞單位疫苗ASF亞單位疫苗的研究思路主要是選擇可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)作用的抗原基因，即保護(hù)性抗原，通過原核或真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，用得到的蛋白或多肽配以新型佐劑制備疫苗。亞單位疫苗遞呈給抗原遞呈細(xì)胞，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生高滴度的抗ASFV抗體。此類疫苗只含特定的ASFV抗原，經(jīng)過合適的抗原傳遞系統(tǒng)免疫動(dòng)物，副作用較少，較為安全，但保護(hù)效力有待提高。ASFV編碼多達(dá)150～200種蛋白，且大多蛋白功能未知，所以，篩選有效的保護(hù)性抗原有一定的挑戰(zhàn)性。深入鑒定可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈免疫應(yīng)答的保護(hù)性抗原以及中和表位，有利于開發(fā)有效的ASFV亞單位疫苗。

前期研究表明，DNA疫苗取得了有限的成功。p30(CP204L)、p54(E183L)、p72(B646L)、pp62(CP530R)和CD2v(EP402R)等重要抗原是亞單位疫苗研發(fā)的主要靶點(diǎn)[70]。在感染中發(fā)揮作用的p72、p30和p54是激發(fā)體液免疫應(yīng)答最重要的免疫原，p30和p54參與ASFV的吸附和內(nèi)化。p72和p54的抗體可阻止ASFV的吸附，p30的抗體能阻止ASFV的內(nèi)化。p72和pp62參與了病毒顆粒的組裝。EP153R(C型凝集素)和CD2v蛋白是重要的預(yù)防感染的保護(hù)性抗原[71]。用p30或p54分別免疫豬，雖能夠產(chǎn)生中和抗體，但對(duì)致死性攻毒無保護(hù)作用，病程不變。與之不同的是，用桿狀病毒表達(dá)的p30和p54制備的疫苗共同免疫，可誘導(dǎo)豬產(chǎn)生中和抗體，提供部分保護(hù)作用，且能改善病程。免疫p72、p54和p30蛋白復(fù)合物，無免疫保護(hù)，但能延緩臨床癥狀發(fā)生時(shí)間，并降低病毒血癥水平。基于抗原分析，設(shè)計(jì)并合成模擬ASFV蛋白的46條多肽，分別用于接種家豬以確定其建立保護(hù)免疫應(yīng)答的能力，結(jié)果證實(shí)模擬多肽片段不能提供有效保護(hù)，僅延緩死亡病程。利用反向疫苗學(xué)，系統(tǒng)地挑選5種ASFV抗原，以人源293(HEK)細(xì)胞表達(dá)抗原蛋白p72(B646L)、p54(E183L)和p12(O61R)以及痘苗病毒MVA為載體的3種抗原蛋白p72(B646L)、pEP153R(EP153R)和CD2v(EP402R)。采用首免-加強(qiáng)程序免疫豬，評(píng)價(jià)免疫效果，結(jié)果顯示從HEK或MVA中表達(dá)純化的ASFV亞單位抗原是安全的，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生ASFV特異性抗體，較好的體液免疫和細(xì)胞免疫水平[65]。研究疫苗保護(hù)效力本質(zhì)上是對(duì)病毒毒力的評(píng)估[20]。免疫效果的評(píng)價(jià)受多種因素影響，包括疫苗類型、接種策略、目標(biāo)抗原、佐劑、誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答；攻毒的毒株、時(shí)間、劑量、接種途徑以及接種動(dòng)物的遺傳類別、年齡、性別等。

ASF亞單位疫苗是以目標(biāo)抗原為基礎(chǔ)的靶向方法，抗原結(jié)構(gòu)蛋白眾多，免疫刺激過程復(fù)雜，僅靠單一或少數(shù)幾種蛋白作為抗原，即使刺激機(jī)體產(chǎn)生了中和抗體，也難以獲得理想的免疫預(yù)防效果。因此，需要篩選鑒定出更多的免疫原性較好的保護(hù)性抗原、對(duì)抗原進(jìn)行科學(xué)組合以及開發(fā)新的病毒靶點(diǎn)和免疫佐劑，以期更好地提高亞單位疫苗的保護(hù)力[19,23,57]。

2.4 核酸疫苗核酸疫苗即DNA疫苗，通過設(shè)計(jì)具有潛在保護(hù)性的抗原基因，將編碼病毒抗原蛋白的基因克隆到表達(dá)載體，直接注射到機(jī)體，使外源基因在宿主細(xì)胞表達(dá)，不僅能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生特異性的體液免疫，而且能激活細(xì)胞免疫應(yīng)答，使宿主獲得免疫力，實(shí)現(xiàn)預(yù)防與治療的目的[19,23]。

研究人員給豬免疫了p30(CP204L)和p54(E183L)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-PQ，未檢測到誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，為了提高豬的免疫應(yīng)答，構(gòu)建了這2個(gè)基因和豬白細(xì)胞抗原Ⅱ(swine leukocyte antigenⅡ，SLAⅡ)的特異性抗體單鏈可變區(qū)片段(single chain variable fragment，scFv)APCH1融合表達(dá)的新質(zhì)粒pCMV-APCH1PQ，給豬接種DNA疫苗后，盡管不能提供對(duì)強(qiáng)毒株攻擊的完全保護(hù)，但體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答增強(qiáng)，表明APCH1分子在DNA免疫方案中是一種良好的免疫佐劑[72]。ARGILAGUET等[73]將p30(CP204L)、p54(E18-3L)、sHA(ASFV hemagglutinin，sHA)基因與泛素的編碼序列融合，構(gòu)建了重組質(zhì)粒 pCMV-UbsHAPQ，用其免疫后可誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞應(yīng)答，并有部分免疫豬抵御了強(qiáng)毒株的致死攻擊，說明疫苗誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答具有重要作用。由于少數(shù)幾個(gè)ASFV抗原基因構(gòu)建的DNA疫苗不能誘導(dǎo)高水平的免疫效果，為更多地激活CD8+T細(xì)胞潛在的免疫保護(hù)區(qū)，研究人員構(gòu)建了病毒DNA表達(dá)文庫，包括4 029個(gè)克隆，130 kb，約占Ba71V全基因組的76%，用其免疫后，免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，60%的豬抵御了E75強(qiáng)毒株致死性攻擊，雖不能提供完全的保護(hù)力，但存活的豬無排毒現(xiàn)象[74]，推測ASF核酸疫苗的保護(hù)力取決于保護(hù)性抗原的數(shù)量。基于ASFV是一種大型DNA病毒，編碼多種蛋白，難以識(shí)別誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)的抗原蛋白，選擇重組蛋白和表達(dá)ASFV基因的pcDNAs的組合聯(lián)合免疫，可刺激豬體內(nèi)產(chǎn)生IFN-γ，但無抵御強(qiáng)毒攻擊的能力[75]。目前，研制的ASFV核酸疫苗雖能誘導(dǎo)高水平細(xì)胞應(yīng)答，但難以抵御強(qiáng)毒株的攻擊，推測是所用的保護(hù)性抗原不足以發(fā)揮100%的保護(hù)作用。隨著深入開展ASFV未知重要抗原的篩選和鑒定，以及表達(dá)載體的改造更新，核酸疫苗作為未來開發(fā)ASF候選疫苗大有潛力[17,19,57]。

3 小結(jié)與展望

ASF大流行將繼續(xù)發(fā)展，只有實(shí)施有效和安全的疫苗才能確保減少ASFV的持續(xù)傳播[76]。ASF疫苗研制主要存在4個(gè)技術(shù)難題：①復(fù)雜性,蛋白數(shù)量大，有待于深入研究免疫原性和毒力基因；②安全性,活疫苗的安全性有待研究；③效力,滅活疫苗無效、蛋白疫苗無效或部分有效，如何提高保護(hù)效力；④量化生產(chǎn),無合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，既使疫苗安全有效，如何實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)也是一個(gè)挑戰(zhàn)[77]。

滅活疫苗暫無開發(fā)前景。DNA疫苗和亞單位疫苗不能提供完全保護(hù)?；蛉笔б呙绾椭氯趸钜呙缒軌虻钟床《竟?，保護(hù)良好甚至交叉保護(hù)。致弱活疫苗的研發(fā)進(jìn)展突出[51]。減毒活疫苗存在毒力返強(qiáng)或毒力殘留的安全隱患，雖然對(duì)同源毒株能夠提供保護(hù)，但是對(duì)異源毒株不產(chǎn)生交叉保護(hù)作用[78]。至今，尚無商品化疫苗和藥物，鑒于嚴(yán)峻的防疫壓力，亟需研發(fā)安全有效的ASF疫苗[17]。ASFV的基因組龐大、免疫逃逸機(jī)制復(fù)雜，是研發(fā)ASF疫苗面臨的巨大挑戰(zhàn)。尤其是ASFV的抗原多樣性(蛋白種類多、免疫抗原復(fù)雜、血清組份多樣)和基因多樣性(基因型、TRS/IGR插入、MGF、基因插入/缺失/突變)[79]，增大了研制有效疫苗的難度。當(dāng)前，ASFV新型疫苗的研究是熱點(diǎn)。ASFV疫苗創(chuàng)制需要解決的主要問題以及主要研究內(nèi)容是要開展ASFV基因缺失疫苗、亞單位疫苗、多表位疫苗、活載體疫苗等新型候選疫苗研究，評(píng)價(jià)候選疫苗的安全性和有效性，創(chuàng)制安全、有效的ASFV疫苗，研發(fā)相應(yīng)疫苗的產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)[80]。

ASF疫苗的前期研究取得了一定的成果，但還未獲得可用的疫苗，對(duì)于ASFV的認(rèn)知還有限，未來需要探究ASFV的生物學(xué)特性，系統(tǒng)深入地研究毒力基因、免疫逃逸基因、保守基因及其功能，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)蛋白與功能、感染與免疫等機(jī)制，解析蛋白結(jié)構(gòu)與信號(hào)通路，為研制新型疫苗和抗病毒藥物提供理論依據(jù)和靶點(diǎn)。目前，疫苗研究的方向集中在填補(bǔ)免疫反應(yīng)、交叉保護(hù)、安全、量產(chǎn)以及病毒與宿主互作機(jī)制方面的知識(shí)缺陷。生物信息學(xué)、結(jié)構(gòu)學(xué)等學(xué)科的迅猛發(fā)展為ASF疫苗的開發(fā)開辟了新的途徑，疫苗研發(fā)的低效試錯(cuò)模式將向高效科學(xué)設(shè)計(jì)模式轉(zhuǎn)變[81]，突破其安全性、有效性、穩(wěn)定性、量產(chǎn)等瓶頸，有望找到一種安全有效的疫苗，快速實(shí)現(xiàn)商業(yè)化[33]。