西藏地區(qū)牦牛源沙門菌分離鑒定、血清分型及致病性研究

李天嬌，班馬澤郎，李登宇，張開琴，趙曉慧，王保寧，2，索朗斯珠

(1.西藏農(nóng)牧學院動物科學學院，林芝 860000；2.四川大學華西基礎(chǔ)醫(yī)學與法醫(yī)學院，成都 610041)

1 引 言

沙門菌(Salmonella)為革蘭氏陰性短小桿菌，腸桿菌科沙門菌屬[1].據(jù)國內(nèi)外研究報道，沙門菌在多種動物中均有發(fā)現(xiàn)，在動物相關(guān)副產(chǎn)品及食材中也常有檢出，所以沙門菌也是食源性疾病中最常見的病原菌之一，動物感染沙門菌時，常引起胃腸炎及局部炎癥，嚴重時會引起不同程度的敗血癥[2-4].成牛感染時臨床表現(xiàn)為水樣或血樣腹瀉，嚴重時表現(xiàn)為呼吸系統(tǒng)疾病或流產(chǎn)；犢牛感染時死亡率高于成牛[5].牦牛是生長在我國高海拔地區(qū)的特有物種，西藏作為我國牦牛主產(chǎn)地之一，牦牛更是當?shù)啬撩竦闹匾?jīng)濟來源之一[6].自關(guān)龍伏等人[7]于1985年首次報道從青海牦牛源中分離出沙門菌后；張斌等[8]、柏雪等[9]和馮蘭等[10]也陸續(xù)報道了青海、四川等地牦牛源沙門菌相關(guān)研究，說明沙門菌在高海拔牧區(qū)長期處于流行狀態(tài).加之，沙門菌主要以糞-口傳播，牧區(qū)養(yǎng)殖模式又以放牧為主，利于沙門菌的傳播，嚴重影響當?shù)仃笈ｐB(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展.

沙門菌血清型多達2500種，常見血清型均具有一定致病性，同時根據(jù)宿主的感染范圍不同，血清型也會有所不同，致病性也有所差異[11].牛沙門菌病可由多種血清型引起，都柏林沙門菌為其中最主要的血清型，牛作為其天然宿主極易被感染，沙門菌也易導致母牛流產(chǎn)，犢牛死亡.了解宿主的優(yōu)勢血清型及致病性強弱，有助于為相關(guān)疫病提出較為針對性的防控管理措施.

目前，國內(nèi)外針對牦牛源沙門菌的研究較少，西藏地區(qū)沙門菌感染情況、菌株的分離鑒定和優(yōu)勢血清型等相關(guān)方面的研究更甚.因此，本研究通過采集西藏拉薩市、林芝市、昌都市和山南市等西藏全部七地市牦牛源腹瀉樣品，對樣品中的沙門菌進行分離鑒定及血清型分型，旨在了解西藏各地區(qū)牦牛源沙門菌感染情況及優(yōu)勢血清型分布情況，同時隨機選取本試驗中優(yōu)勢血清型沙門菌一株進行動物試驗和病變組織切片，旨在了解其菌株的致病性強弱.為后續(xù)相關(guān)方面深入研究提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持.

2 材料與方法

2.1 材 料

牦牛源新鮮腹瀉糞便，采集自西藏拉薩市、林芝市、昌都市和山南市等七地市，共199份，樣品具體分布情況見表1.樣品采集后及時編號，保存至-20 ℃冰箱.

表1 樣品分布情況

BPW培養(yǎng)基、MRSV培養(yǎng)基購自美國BD公司；LB培養(yǎng)基、TTB培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基、BS培養(yǎng)基、TSI培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂購自杭州微生物試劑有限公司；革蘭氏染色試劑盒購自青島海博生物技術(shù)有限公司；TR101沙門菌屬診斷血清試劑盒購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0)、DL 2000 DNA marker購自大連寶生物有限公司.試驗動物為SPF級，4～6周年齡、體重18～20 g的KM小鼠72只，購自成都達碩實驗動物有限公司.

2.2 方 法

2.2.1 細菌分離培養(yǎng) 將采集的樣品參照GB4789.4-2010[12]和Liu等人[13]的方法進行分離培養(yǎng).將樣品接種于BPW培養(yǎng)液中，進行前期預增菌；將上述增菌液接種在MRSV半固體培養(yǎng)基上，進行初篩；初篩后的菌液在SS、XLT4選擇性培養(yǎng)基上復篩；篩選出的單菌落進行革蘭氏染色、鏡檢；并將符合形態(tài)特征的菌落接種于TTB培養(yǎng)液進行純化.

2.2.2 生化試驗 將TSI固體培養(yǎng)基制成斜面培養(yǎng)基，將純培養(yǎng)菌液在TSI培養(yǎng)基上進行斜面穿刺，37 ℃培養(yǎng)12 h后觀察結(jié)果.

2.2.3 PCR鑒定 利用高溫裂解法提取菌株的DNA，并利用PCR技術(shù)檢測菌株的特異性鑒定基因invA[14]，引物序列：5′-GTGAATTATCGCACGTTCGGCAA-3′；5′-TCATCGCACGTCAAAGGAACC-3′.將引物序列送至上海生工生物科技有限公司合成.

反應總體系25 μL，其中：DNA模板2 μL，Premix TaqTM12.5 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O補充至25 μL.退火溫度為61 ℃，共35個循環(huán).PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將擴增產(chǎn)物送至上海生工生物科技有限公司測序.

2.2.4 血清型鑒定 將TSB中純培養(yǎng)菌液接種于營養(yǎng)瓊脂上，37 ℃培養(yǎng)12 h.將培養(yǎng)基中的單菌落在玻片上與TR101沙門菌屬血清診斷試劑盒(寧波天潤生物藥業(yè)有限公司)中的血清混合，觀察凝集的情況并記錄凝集情況，血清凝集結(jié)果根據(jù)Kauffman-white[15]標準進行分析.

2.2.5 測定菌株LD50從此次菌株優(yōu)勢血清型(Salmonelladublin)中隨機選取一株沙門菌，該菌株編號為H42，測定其LD50.將馴養(yǎng)后的KM小鼠隨機分成7組試驗組，1組對照組，1組空白組，每組各8只小鼠.

表2 試驗組小鼠注射菌量

2.2.6 病理切片 將攻毒后24 h內(nèi)(急性)死亡小鼠，72 h后(慢性)死亡小鼠立即解剖后，取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、胃組織、腸組織于無菌生理鹽水洗滌后，用4%多聚甲醛進行固定，并將組織委托成都里來生物有限公司制作HE切片進行觀察，并記錄結(jié)果.

3 結(jié) 果

3.1 細菌分離純化

將疑似菌落接種于SS固體培養(yǎng)基和BS固體培養(yǎng)基上，菌株在SS平板上生長出透明且中心帶黑點的圓形單菌落，在BS平板上生長出黑褐色且?guī)в薪饘俟鉂傻膱A形單菌落，將疑似單菌落染色鏡檢后，顯微鏡油鏡下觀察為粉紅色短小桿菌.以上特征均符合沙門菌生長特性及形態(tài)學特征，結(jié)果見圖1.

圖1 分離菌株的菌落形態(tài)和鏡檢結(jié)果

分離菌株均能與TSI反應生成H2S黑色沉淀，且分解TSI中葡萄糖，使斜面變紅，表面氧化后則變黃，符合沙門菌生化特性.

疑似沙門菌的單菌落進行特異性基因invA檢測顯示，分離菌株目的條帶約為284 bp，與預期條帶大小相似，結(jié)果見圖2.將PCR結(jié)果結(jié)合培養(yǎng)特性、形態(tài)學特征及生化特性結(jié)果顯示：西藏7地市共分離出50株沙門菌，檢出率為25.13%(50/199).其中拉薩19株，檢出率為32.20%(19/57)；林芝9株，檢出率為19.57%(9/46)；那區(qū)7株，檢出率為19.44%(7/36)；日喀則2株，檢出率為20.00%(2/10)；山南4株，檢出率為28.57%(4/14)；阿里2株，檢出率為13.34%(2/15)；昌都7株，檢出率36.84%(7/19).本次分離結(jié)果中，拉薩、昌都和山南三地分離率相較于其他四地較高，阿里地區(qū)的分離率最低.

圖2 牦牛源沙門菌invA基因PCR結(jié)果

3.4 血清型鑒定

本次血清型分型結(jié)果顯示：50株沙門菌共分屬B群、C1群、C2群、D群4種血清群，含都柏林沙門菌、傷寒沙門菌、阿邦尼沙門菌等血清型共18種.按血清群統(tǒng)計結(jié)果顯示：4種血清群中，以D群所占血清菌株最多，為常見血清群，含5種血清型，共20株分離菌；其次是B群含8種血清型，共19株菌；C1群占3種血清型，共9株菌；C2群占2種血清型，共2株菌，具體結(jié)果詳見圖3.

圖3 50株牦牛源沙門菌所占血清群比例

從18種血清分型結(jié)果顯示：西藏地區(qū)沙門菌的優(yōu)勢血清型為都柏林沙門菌共10株，占總分型菌株的20.00%(10/50)；其次是傷寒沙門菌和阿邦尼沙門菌個7株，占總分型菌株的14.00%(7/50)；接著是丙型副傷寒沙門菌共6株，占總分型菌株的12.00%(6/50)，血清型統(tǒng)計結(jié)果詳見圖4.

圖4 50株牦牛源沙門菌血清型分布情況

從各地沙門菌血清分型結(jié)果顯示：各地所占血清群、血清型數(shù)量均不相同.其中，拉薩市共有10種血清型，且4種血清群均有分布，以都柏林沙門菌和傷寒沙門菌為優(yōu)勢血清群；林芝市共5種血清型2種血清群，以都柏林和阿邦尼沙門菌為優(yōu)勢血清型；那曲市共5種血清型，以丙型副傷寒、傷寒沙門菌為優(yōu)勢血清型；日喀則兩株分離菌均為伯里沙門菌；昌都市共包括6種血清型，以阿邦尼沙門菌為優(yōu)勢血清型；阿里和山南分離菌株均為不同血清型，具體結(jié)果詳見表3.

表3 西藏各地市牦牛源沙門菌血清分型情況(單位：株)

3.5 牦牛源Salmonella Dublin感染小鼠的LD50

LD50試驗結(jié)果(詳見表4)，經(jīng)SPSS 21.0軟件分析，牦牛源都柏林沙門菌對感染小鼠的LD50為0.368×108CFU/mL，95%置信區(qū)間為0.311×108～0.434×108CFU/mL.

表4 各組小鼠感染牦牛源都柏林沙門菌死亡情況

3.6 病理切片

光鏡下觀察小鼠組織病理切片結(jié)果顯示：急性(24 h內(nèi))死亡組小鼠的心臟、腸組織和胃組織相關(guān)細胞結(jié)構(gòu)完整清晰無明顯病變，肝臟、脾臟和肺臟相關(guān)細胞出現(xiàn)輕微壞死和變性.慢性(72 h后)死亡組小鼠心臟間質(zhì)輕微炎細胞浸潤，以淋巴細胞為主；脾臟相較于急性組較為嚴重，白髓和紅髓細胞變性、壞死且細胞邊緣基本消失，免疫細胞聚集增多；肺泡上皮細胞也相較于急性組嚴重，出現(xiàn)上皮細胞慢性壞死；腸組織黏膜層結(jié)構(gòu)模糊，大面積溶解壞死，腸腔壞死區(qū)域細胞大量壞死，部分區(qū)域出現(xiàn)輕微充血擴張；胃部黏膜層也壞死溶解明顯，結(jié)果詳見圖5.

圖5 牦牛源都柏林沙門菌感染小鼠各病變組織病理切片

4 討 論

沙門菌作為一類重要的食源性病原菌，宿主眾多，可感染各個年齡段的牛只，以犢牛最為常見[17].李慧明等人[18]對四川省牦牛群調(diào)查結(jié)果顯示，沙門菌引起的的牦牛發(fā)病率2.76%～34.82%，死亡率高達4.61%～47.32%.隨著研究深入，國內(nèi)各地有關(guān)牦牛源沙門菌的相關(guān)報道也逐步增多，說明沙門菌在牦牛群中處于長期流行狀態(tài)，且死亡率也較高，但針對西藏牦牛源沙門菌相關(guān)研究報道卻較為少見.本次研究中，西藏地區(qū)牦牛源沙門菌總分離率為25.13%，與逯玉等人[19]從青海犢牛腹瀉樣品的分離率24.00%結(jié)果相似.本次研究結(jié)果確定沙門菌在西藏牦牛源中存在，七地市均有分離說明該細菌在西藏存在一定的流行趨勢.

目前，高原草場超載、礦元素缺乏等問題普遍存在于青藏高原等高海拔地區(qū)，這些原因可直接影響牦牛生長發(fā)育、機能維持等方面[20].而西藏整體處于該情況，加之牛群結(jié)構(gòu)不合理、養(yǎng)殖模式單一，牛群常有未淘汰的老牛、未及時發(fā)現(xiàn)的病牛和抵抗力較弱的犢牛，導致牛群極易感染各類病原菌；并且在放牧情況下，病牛和隱性感染牛不易發(fā)現(xiàn)，污染放牧環(huán)境，加大牛群患病機率[21].本次研究結(jié)果提示我們需改善養(yǎng)殖方式和加強監(jiān)管措施，減少感染機率，尤其分離率高的地區(qū)更應引起重視.同時，分離率最高的拉薩、昌都、山南三地，環(huán)境相似，海拔較為接近，但感染率高是否與海拔存在相關(guān)性，還需深入研究.

沙門菌對人和溫血動物致病的血清型主要集中于A～F血清群，朱曉霞等人[22]針對四川藏區(qū)沙門分群中血清型也主要集中于B群、D群中，與本次試驗中常見血清群結(jié)果相似，說明牦牛雖產(chǎn)地不同，但高海拔地區(qū)也存在一定的相似性.沙門血清根據(jù)宿主感染不同，存在專嗜性、偏嗜性、泛嗜性.牛沙門菌病可由多種血清型引起，都柏林沙門菌為牛源最主要的血清型，其次是鼠傷寒沙門菌，本次研究中以上兩種血清型均有分離，都柏林沙門菌更是西藏牦牛源優(yōu)勢血清型[23].李慧明等人[18]針對四川牦牛源沙門菌鑒定結(jié)果顯示，菌株中21.87%為都柏林沙門菌；20世紀80年代陳含義等人[24]和滕振光等人[25]分別從青海兩地牦牛源中分離出的沙門菌也均為都柏林沙門菌；國外也曾有牛群感染都柏林沙門菌的報道.

本次試驗中牦牛源都柏林沙門菌感染KM小鼠的半數(shù)致死結(jié)果為0.368×108CFU/mL，相較于馮蘭等[10]感染小鼠的半數(shù)致死結(jié)果1.2×107CFU/mL較高，屬于強致死性菌株.隨后觀察病變組織切片發(fā)現(xiàn)此株都柏林沙門菌可引起宿主全身性感染，心臟組織心肌纖維變性壞死，肝臟組織肝細胞變性壞死、肝竇淤血擴張，脾臟組織淋巴細胞減少、壞死、白髓萎縮、脾血竇淤血，肺臟組織支氣管脫落、肺泡上皮細胞變性壞死、水腫、炎細胞浸潤、出血，腸組織黏膜層變性壞死、充血，胃組織黏膜層變性壞死等病理改變，與對照組相比，急性組和慢性組均可見不同程度病理改變，且慢性組整體病理程度重于急性組，其中脾臟、肺臟、腸和胃組織病變程度較重.因此，我們需重視S.Dublin引起的危害，及時制定有針對性的防控管理措施.同時此次沙門血清分型種類較多，我們也需考慮存在多種血清型引起牛只患病的情況，需要我們提高對牛群沙門菌感染情況的重視.

此次牦牛源沙門菌中還分離出鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌，這兩種血清型具有泛嗜性，擁有廣泛感染的宿主譜，可引起人和多種動物相關(guān)沙門菌病，具有重要的公共衛(wèi)生學意義[26].乙型、丙型副傷寒沙門菌主要造成人類食物中毒，孔雪英等人[27]曾從牦牛肉中檢出這兩種副傷寒沙門菌，說明牦牛在屠宰過程中可能感染沙門菌，而人類食用牦牛肉時，也存在一定的感染風險.因此我們需加強在牛只屠宰到銷售過程中的監(jiān)管環(huán)節(jié)，降低副產(chǎn)品被污染的機率.同時，病牛沙門菌作為罕見的非傷寒沙門菌，和紐波特沙門菌，在研究報道中主要是食物污染而引起的食物中毒，也需引起相關(guān)監(jiān)管部門的重視[28,29].阿邦尼沙門菌毒性也較強，孫陽陽等人[30]曾在驢源中分離，陳俊等人[31]人則從鴨源中分離得到奧斯陸沙門菌，而本次牦牛源沙門分型結(jié)果中均分離得到這兩種血清型，需考慮這兩種血清型可能存在多種動物間交叉感染的情況.而伯里、阿雷查瓦萊塔、里森、塔西、仙臺等血清型相關(guān)研究報道較少，是否具有較強毒性和致病性還需進一步研究.本次分型結(jié)果中沙門菌血清型種類較多，優(yōu)勢血清型特點突出，部分血清型宿主廣泛、危害較大，提示我們需引起高度重視，也可針對相關(guān)優(yōu)勢血清型進行深入研究.

5 結(jié) 論

目前，國內(nèi)外針對牦牛源沙門菌研究較少，有關(guān)全區(qū)牦牛源沙門菌的研究更少.本次實驗針對西藏全區(qū)牦牛源沙門菌進行分離鑒定，確定沙門菌在西藏牦牛源中確實廣泛存在，且具有一定流行趨勢；本次試驗也確定了西藏地區(qū)的常見血清群和優(yōu)勢血清型；確定了牦牛源S.Dublin具有較強的致病性.為以后相關(guān)方面深入研究提供理論基礎(chǔ)，也為相關(guān)部門防治提供數(shù)據(jù)支撐.