杞菊景明顆粒在大鼠血漿、膽汁、尿液、糞便中代謝產(chǎn)物的鑒定

吳勵(lì)萍 張祎盈馮一帆錢大瑋朱悅尚爾鑫郭盛康宏杰段金廒*

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京210023； 2.中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京210023； 3.寧夏枸杞創(chuàng)新中心，寧夏 銀川750002）

杞菊景明顆粒由菊花、枸杞子、黃芪、當(dāng)歸、茯苓、山楂、益智仁、鐵皮石斛、石決明9 味藥材配伍而成，具有滋補(bǔ)肝腎、益肝明目的功效，是中醫(yī)治療肝腎陰虧、視物昏花的臨床經(jīng)驗(yàn)方。方中菊花［1-3］、枸杞子［4-7］、黃芪［8-10］、當(dāng)歸［11-12］等藥味中的酚酸、黃酮、生物堿抗炎、抗氧化活性良好，并且芹菜素、玉米黃素、黃芪甲苷等成分具有一定的視網(wǎng)膜保護(hù)作用［13-15］，但該制劑來源于臨床，目前缺乏文獻(xiàn)研究，有效物質(zhì)尚不明確。

液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)具有分析范圍廣、檢測(cè)限低、定性分析結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，故本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF／MS法，對(duì)杞菊景明顆粒在大鼠血漿、膽汁、尿液、糞便中的代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，以期為闡明該制劑藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供參考，也為進(jìn)一步開發(fā)相關(guān)產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料

Waters ACQUITY UPLC 系統(tǒng)（配置四元泵溶劑系統(tǒng)、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器）、SynaptG2-s TOF 質(zhì)譜儀（配置MassLynx 4.2 質(zhì)譜工作站軟件）（美國(guó)Waters 公司）；D2021 離心機(jī)、MX-S 渦旋混勻器［大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）有限公司］；ML204、MS105 電子分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）。

阿魏酸（批號(hào)110773-201915，純度≥99.4%）、咖啡酸（批號(hào)110885-201703，純度≥99.7%）、綠原酸（批號(hào)110753-202018，純度≥96.1%）、木犀草素（批號(hào)111520-202006，純度≥94.4%）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；芒柄花素（批號(hào)F27J7S18516）、芹菜素（批號(hào)T04S8F43072）、芹菜素-7-O-β-D吡喃糖苷（批號(hào)Y20S6Y17404）、異牡荊素（批 號(hào)Y25A8H42502）、毛蕊異黃酮（批 號(hào)Y05J11H115098）、毛蕊異黃酮苷（批 號(hào)Y13F11H108672）對(duì)照品均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，純度均≥98%。枸杞子、菊花、黃芪、茯苓、當(dāng)歸、石決明、山楂、益智仁、鐵皮石斛均購(gòu)自亳州市紫銳藥業(yè)有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)輝副教授鑒定為正品，均符合2020 年版《中國(guó)藥典》 要求。甲酸、乙腈均為色譜純，購(gòu)自德國(guó)Merck 公司。

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，體質(zhì)量200～220 g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（浙）2019-0001，飼養(yǎng)條件為溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度（45±10）%，12 h／12 h 光照／黑暗循環(huán)，自由進(jìn)食飲水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

2 方法

2.1 濃縮液制備 按處方配比稱取顆粒組方藥材共520 g，10 倍量30% 乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液，減壓濃縮至生藥量1 g／mL，即得，在4 ℃下保存。

2.2 分組與給藥 12 只大鼠隨機(jī)分為空白組、給藥組，每組6只，分別灌胃給予生理鹽水、“2.1”項(xiàng)下濃縮液 ［蒸餾水稀釋至0.5 g／mL，劑量為5.46 g／kg（臨床等效量）］，每天1次，連續(xù)3 d。

2.3 生物樣品采集

2.3.1 血漿 大鼠于末次給藥前禁食12 h，自由飲水，于給藥后0.5、1、2、4、6、8 h 眼眶叢靜脈取血，置于預(yù)先加入10 μL 1%肝素鈉的EP 管中，3 500 r／min 離心10 min，取上清，保存于-80 ℃冰箱中。

2.3.2 膽汁 大鼠于末次給藥前禁食12 h，自由飲水，給藥后麻醉，進(jìn)行膽管插管手術(shù)，引流膽汁，每2 h 收集1次，持續(xù)10 h，保存于-80 ℃冰箱中。

2.3.3 尿液、糞便 大鼠于末次給藥前禁食12 h，自由飲水，給藥后置于代謝籠中，收集0～12、12～24、24～36 h 的尿液和糞便，保存于-80 ℃冰箱中。

2.4 供試品溶液制備

2.4.1 血漿 將不同時(shí)間點(diǎn)大鼠血漿等體積混合，取300 μL，加入900 μL 甲醇沉淀蛋白，渦旋30 s，4 ℃、13 000 r／min 離心10 min，取上清，濃縮，用50% 甲醇、0.1% 甲酸各50 μL 復(fù)溶，4 ℃、13 000 r／min 離心10 min，取上清，即得。

2.4.2 膽汁 將不同時(shí)間點(diǎn)大鼠膽汁等體積混合，取200 μL，加入200 μL 乙腈渦旋30 s，4 ℃、13 000 r／min 離心10 min，取上清，即得。

2.4.3 尿液 將不同時(shí)間點(diǎn)尿液等體積混合，取200 μL，加入200 μL 甲醇渦旋3 min，4 ℃、13 000 r／min 離心10 min，濃縮至干，200 μL 5%乙腈（含0.1% 甲酸）復(fù)溶，4 ℃、13 000 r／min離心10 min，取上清，即得。

2.4.4 糞便 將不同時(shí)間點(diǎn)糞便等質(zhì)量混合，取1.0 g，加入3倍量50% 甲醇溶解，超聲處理30 min，4 ℃、13 000 r／min 離心10 min，取上清液，即得。

2.5 UPLC-Q-TOF／MS 分析條件

2.5.1 色譜 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相0.1% 甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～2 min，95%～87%A；2～4 min，87%～82%A；4～5 min，82%A；5～8 min，82%～80% A；8～9 min，80%～60% A；9～13 min，60%～35%A；13～15 min，35%～20%A；15～16 min，20%A～0）；體積流量0.4 mL／min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

2.5.2 質(zhì)譜條件 ESI 電噴霧離子源，正負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓3.0 kV；離子源溫度120 ℃；脫溶劑氣溫度400 ℃；錐孔電壓30 V，體積流量50 L／h；脫溶劑氣體積流量80 L／h，碰撞能量20～50 V；質(zhì)量掃描范圍m／z100～1 000。

2.6 數(shù)據(jù)處理 通過Metabolynx XS、Mass Frontier 7.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)采集使用MassLynxTM v 4.2工作站，方式、模式分別為Centroid、碰撞能量梯度（MSE）；數(shù)據(jù)分析模式為質(zhì)量虧損過濾（MDF）。

3 結(jié)果

3.1 UHPLC-Q-TOF／MS 分析 總離子流圖見圖1，將化合物可能的代謝方式輸入MetaboLynx XS 軟件，并將MDF 應(yīng)用于數(shù)據(jù)處理，結(jié)合對(duì)照品及參考文獻(xiàn)中的保留時(shí)間、一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜信息，共發(fā)現(xiàn)30 種成分，其中原型成分10種，代謝產(chǎn)物20種。通過與對(duì)照品比對(duì)，確定原型成分分別為阿魏酸、咖啡酸、綠原酸、芹菜素、芹菜素-7-O-β-D吡喃糖苷、異牡荊素、木犀草素、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花素。

圖1 UHPLC-Q-TOF／MS 總離子流圖Fig.1 UHPLC-Q-TOF／MS total ion current chromatograms

3.2 酚酸及其代謝產(chǎn)物鑒定 在生物樣品中檢測(cè)到阿魏酸、咖啡酸、綠原酸原型及其代謝產(chǎn)物，具體信息見表1，代謝途徑見圖2。以阿魏酸為例，其原型主要存在于大鼠尿液中，保留時(shí)間為3.12 min，準(zhǔn)分子離子峰m／z193.049 1 ［M-H］-（C7H6O5），m／z178.028 5 為［M-OH］-，與對(duì)照品相符；代謝物A1-1 對(duì)應(yīng)準(zhǔn)分子離子峰m／z274.014 7 ［M-H］-，與阿魏酸準(zhǔn)分子離子峰相差81，可能為阿魏酸硫酸酯化產(chǎn)物，其二級(jí)碎片m／z193.049 1、178.025 3與阿魏酸一致，m／z149.059 4 為阿魏酸脫去羧基，m／z134.035 7 為進(jìn)一步脫去甲基產(chǎn)生的碎片離子；A1-2 準(zhǔn)分子離子峰為m／z369.080 1 ［M-H］-，推斷其分子式為C16H18O10，在二級(jí)碎片中裂解產(chǎn)生了m／z193.048 2、178.023 6、134.036 0 離子峰，與阿魏酸特征離子峰相同，可能為阿魏酸葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。另外，阿魏酸主要進(jìn)行Ⅱ相代謝反應(yīng)（硫酸酯化、葡萄糖醛酸化），與文獻(xiàn)［16］報(bào)道一致。

圖2 阿魏酸（A1）、咖啡酸（A2）、綠原酸（A3）代謝途徑Fig.2 Metabolic pathways of ferulic acid（A1），caffeic acid（A2）and chlorogenic acid（A3）

3.3 黃酮及其代謝產(chǎn)物鑒定 在生物樣品中檢測(cè)到芹菜素、芹菜素-7-O-β-D吡喃糖苷、異牡荊素、木犀草素、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花素及其代謝產(chǎn)物，具體信息見表1，代謝途徑見圖3～4。以毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷為例，B5準(zhǔn)分子離子峰m／z285.075 4 ［M-H］＋脫甲基形成m／z270.045 6 碎片離子峰，與毛蕊異黃酮對(duì)照品一致；B6 準(zhǔn)分子離子峰m／z447.091 7 ［M-H］＋，二級(jí)碎片m／z285.075 2［M-C6H10O5］＋、271.059 1［M-C6H10O5-CH3］＋，與毛蕊異黃酮苷對(duì)照品一致；代謝物B5-1 準(zhǔn)分子離子峰m／z301.072 5 ［M＋H］＋（C16H12O6），其二級(jí)碎片m／z286.049 0 ［M ＋HCH3］＋、153.019 2 ［M＋H-C9H8O2］＋與文獻(xiàn)［17］報(bào)道一致，可能為毛蕊異黃酮羥基化產(chǎn)物；B5-2、B5-3 準(zhǔn)分子離子峰m／z461.107 5、365.032 8［M＋H］＋，其特征離子峰m／z285.07、270.05 與毛蕊異黃酮苷相近，B5-2 比毛蕊異黃酮多176，可能為毛蕊異黃酮醛酸化產(chǎn)物，而B5-3 比毛蕊異黃酮多80，可能為毛蕊異黃酮醛酸化硫酸酯化產(chǎn)物；B5-4 準(zhǔn)分子離子峰m／z447.091 9 比B10 少14，其二級(jí)離子碎片m／z271.059 6 為毛蕊異黃酮脫CH2特征峰，可能為毛蕊異黃酮脫甲基葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物。另外，該類化合物在體內(nèi)進(jìn)行羥基化、還原等Ⅰ相代謝反應(yīng)，以及甲基化、硫酸酯化、葡萄糖醛酸化等Ⅱ相代謝反應(yīng)。

圖3 芹菜素（B1）、芹菜素-7-O-β-D 吡喃糖苷（B2）、異牡荊素（B3）、木犀草素（B4）代謝途徑Fig.3 Metabolic pathways of apigenin（B1），apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside（B2），isovitexin（B3）and luteolin（B4）

4 討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，杞菊景明顆粒吸收進(jìn)入體內(nèi)的主要成分是酚酸、黃酮。

4.1 酚酸 來源于當(dāng)歸、菊花的綠原酸、咖啡酸、阿魏酸代謝途徑以甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸酯化等Ⅱ相代謝反應(yīng)為主，而阿魏酸、咖啡酸及其代謝產(chǎn)物主要集中在大鼠尿液、糞便中，表明游離酚酸在胃中可被迅速吸收，主要通過尿糞排泄，與文獻(xiàn)［18］報(bào)道一致。另外，在大鼠膽汁中也檢測(cè)到酚酸代謝產(chǎn)物，表明肝臟也參與其體內(nèi)代謝過程。

圖4 毛蕊異黃酮（B5）、毛蕊異黃酮苷（B6）、芒柄花素（B7）代謝途徑Fig.4 Metabolic pathways of calycosin（B5），calycosin-7-glucoside（B6）and formononetin（B7）

4.2 黃酮 來源于菊花的芹菜素、芹菜素-7-O-β-D吡喃糖苷、異牡荊素、木犀草素，以及來源于黃芪的毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花素主要代謝反應(yīng)有羥基化、葡萄糖醛酸化、硫酸酯化結(jié)合等，以Ⅱ相代謝反應(yīng)為主［19］，并且檢測(cè)到多種來源于菊花的原型成分及其代謝產(chǎn)物，提示該藥材可能是重要組成藥味。芹菜素及其糖苷（芹菜素-7-O-β-D吡喃糖苷、異牡荊素）、木犀草素屬于黃酮類，而毛蕊異黃酮、芒柄花素屬于異黃酮類，芹菜素與木犀草素、毛蕊異黃酮與芒柄花素之間可通過羥基化和脫羥基實(shí)現(xiàn)相互轉(zhuǎn)化［17］。該類化合物主要集中在大鼠膽汁、尿液中，表明肝臟、腸道是其代謝的主要場(chǎng)所，進(jìn)入體內(nèi)后一部分以原型直接吸收，進(jìn)入體循環(huán)，最終于肝臟中代謝滅活；另一部分在小腸中經(jīng)過腸道微生物的代謝轉(zhuǎn)化，進(jìn)而吸收參與體內(nèi)循環(huán)［20-21］。另外，在大鼠血漿中鑒定出毛蕊異黃酮、木犀草素原型成分，表明杞菊景明顆粒入血成分以兩者及其羥基化、硫酸酯化、葡萄糖醛酸化代謝產(chǎn)物為主。

4.3 其他成分 枸杞子中多糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，質(zhì)譜分析較困難；色素含量較低，在該條件下也難以檢測(cè)。因此，本實(shí)驗(yàn)未能定位到該藥材相關(guān)代謝成分，有待今后作進(jìn)一步研究。