α-細(xì)辛醚緩解大鼠外周神經(jīng)痛的作用機(jī)制研究

范煒斌 殷煒銘 張小麗 王友梅 盧洪慧 林彬

神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain,NP）指體感覺系統(tǒng)損傷或疾病導(dǎo)致的疼痛，通常表現(xiàn)為慢性的持續(xù)性或反復(fù)性疼痛，其發(fā)病率約為6.9%～10.0%[1]。NP成因和機(jī)制復(fù)雜，現(xiàn)有藥物對許多患者的效果并不令人滿意[2]。因此，從天然植物中尋找具有潛在抗炎和鎮(zhèn)痛作用的新化學(xué)物質(zhì)成為鎮(zhèn)痛治療領(lǐng)域的研究方向。石菖蒲是天南星科菖蒲屬植物石菖蒲的干燥根莖，已被證實(shí)對多種心血管疾病具有確切的防治作用[3-4]。α-細(xì)辛醚是石菖蒲根莖提取物中含量最高的具有藥用價(jià)值的化合物[5-6]，被證實(shí)可通過抑制γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶活性以降低γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid,GABA）分解代謝，上調(diào)谷氨酸脫羧酶67表達(dá)使GABA合成增加，上調(diào)γ-氨基丁酸A型受體表達(dá)以增強(qiáng)GABA介導(dǎo)的抑制功能，發(fā)揮抗癲癇作用[7-8]。NF-κB是炎性反應(yīng)的核心調(diào)控分子，活化的NF-κB轉(zhuǎn)位到核內(nèi)與相關(guān)DNA序列結(jié)合后誘發(fā)下游通路炎癥因子，如環(huán)氧合酶-2、TNF-α、IL-1等的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[9]。α-細(xì)辛醚可能通過阻斷NF-κB的活化來抑制這些炎癥因子的表達(dá)，從而緩解疼痛[10]。坐骨神經(jīng)結(jié)扎（chronic constriction injury，CCI）大鼠是目前公認(rèn)的神經(jīng)病理性疼痛模型[11-12]，本研究通過分析α-細(xì)辛醚對CCI模型大鼠行為學(xué)的影響來探討α-細(xì)辛醚的鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制，以期為開發(fā)新藥緩解NP提供參考。

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑 α-細(xì)辛醚購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。BCA蛋白試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Rat IL-6 ELISA試劑盒和Rat TNF-α ELISA試劑盒均購于杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，批號分別為EK306/3-48和EK382/3-48；p65抗體購自Cell Signaling公司，批號：8242S；IL-6抗體購自SANTA公司，批號：SC32296；TNF-α抗體購自Abcam公司，批號：ab205587。將α-細(xì)辛醚均勻分散在0.4%吐溫-80溶液（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）中，制成1 g/L和5 g/L的混懸液。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 24只6～8周雄性SD大鼠，體重約220～260 g，SPF級，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，合格證號：20170005024951，使用許可證號：SYXK（浙）2015-0008。飼養(yǎng)于20～25℃、相對濕度40%～70%的實(shí)驗(yàn)動物房，試驗(yàn)前在動物房環(huán)境中適應(yīng)1周。維持飼料由江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司提供，符合GB14924.3—2010執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 分組、建模及給藥處理 取24只大鼠按隨機(jī)數(shù)字法分成假手術(shù)組、溶媒組、低劑量組、高劑量組，每組6只。適應(yīng)性飼養(yǎng)后，將溶媒組大鼠用水合氯醛腹腔麻醉，取左側(cè)臥位并固定于手術(shù)臺上，消毒，鋪巾，在右股骨下方約1 cm平行于股骨切開皮膚，用小剝離子經(jīng)股二頭肌間隙鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)，用神經(jīng)剝離子輕柔將坐骨神經(jīng)與周圍軟組織分離；在坐骨神經(jīng)分成3支前的主干部位游離神經(jīng)7 mm左右、在距神經(jīng)起始處（3支分叉處）上方2 mm處，用4.0含鉻羊腸線結(jié)扎坐骨神經(jīng)4道，每道間隔約1 mm，被結(jié)扎的神經(jīng)長度為4～5 mm。注意結(jié)扎的松緊度，以打結(jié)時(shí)可見肌肉輕微抽動為準(zhǔn)；局部0.9%氯化鈉溶液沖洗，間斷縫合肌肉筋膜、皮下組織以及皮膚；術(shù)畢將大鼠放入鼠籠，于溫暖、安靜環(huán)境自由喂養(yǎng)。低劑量組和高劑量組作相同處理，假手術(shù)組除不結(jié)扎坐骨神經(jīng)外，其余同溶媒組。各組大鼠造模當(dāng)天開始給藥，連續(xù)灌胃14 d，低劑量組、高劑量組分別給予1 g/L和5 g/L的α-細(xì)辛醚混懸液，溶媒組和假手術(shù)組均給予0.4%吐溫-80溶液，給藥劑量均為10 ml/kg。

1.4 機(jī)械痛閾測定 采用Von Frey細(xì)絲法。造模前，造模后第1、3、5、7、10、14天，用 Von Frey纖維細(xì)絲測定大鼠機(jī)械性縮足閾值（mechanical paw withdrawal threshold,MPWT）。將大鼠單獨(dú)置于一帶有金屬篩網(wǎng)的有機(jī)玻璃箱內(nèi)適應(yīng)至少20 min，使用Von Frey纖維細(xì)絲刺激大鼠右后腿足底中部。大鼠出現(xiàn)快速抬足遠(yuǎn)離細(xì)絲或舔足行為視為陽性反應(yīng)，反之為陰性反應(yīng)。當(dāng)陽性反應(yīng)或陰性反應(yīng)出現(xiàn)后，再給予相鄰小一級力度或者相鄰大一級力度的刺激，如此連續(xù)進(jìn)行5次，每次刺激間隔30 s，記錄最后刺激所用的刺激強(qiáng)度值。

1.5 熱覺痛閾測定 采用熱板法。造模前，造模后第1、3、5、7、10、14天，將大鼠放置于熱板儀中適應(yīng)30 min。之后打開熱板儀，控制溫度為52℃，放入大鼠的同時(shí)開始計(jì)時(shí)，記下當(dāng)大鼠出現(xiàn)快速抬右足或舔足行為的時(shí)間。每只大鼠測試5次，每次間隔5 min，取平均值。行為學(xué)測試結(jié)束后，處死各組大鼠，取血清和脊髓，用于后續(xù)檢測。

1.6 大鼠脊髓p65、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法。將各組大鼠脊髓組織分別放入裂解液中，充分勻漿后4℃11 000 r/min離心20 min，取上清為蛋白樣本。參照BCA蛋白試劑盒方法測定大鼠脊髓樣本p65、IL-6、TNF-α蛋白相對表達(dá)量，以待測蛋白與β-actin的灰度值比值表示。

1.7 大鼠血清IL-6和TNF-α含量檢測 采用ELISA法。參照IL-6和TNF-α檢測試劑盒方法進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示。4組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著差法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠機(jī)械痛閾的比較 與造模前比較，造模后第1天的假手術(shù)組大鼠MPWT輕微降低，溶媒組、低劑量組和高劑量組大鼠MPWT均顯著降低，并在第3天降至最小值，表明造模成功。從術(shù)后第5天起，與溶媒組相比，低劑量組和高劑量組MPWT開始明顯升高（均P＜0.05），術(shù)后第7～10天MPWT顯著增加（均P＜0.05），接近假手術(shù)組水平?？梢娊o予α-細(xì)辛醚連續(xù)灌胃減輕了CCI造模所致的神經(jīng)病理性疼痛，且呈劑量相關(guān)性。見表1。

表1 4組大鼠的機(jī)械痛閾比較（g）

2.2 4組大鼠熱覺痛閾的比較 與造模前比較，造模后第1天假手術(shù)組大鼠熱覺痛閾有輕微降低，溶媒組、低劑量組和高劑量組大鼠熱覺痛閾均顯著降低（均P＜0.05）。與造模前比較，溶媒組大鼠的熱覺痛閾在術(shù)后第1天即顯著降低，并在第7～14天維持極低值。低劑量組和高劑量組大鼠的熱覺痛閾也在第7天降到了極低值，但比溶媒組高。從造模后第10天起，與溶媒組相比，低劑量組和高劑量組熱覺痛閾均開始明顯升高（均P＜0.05），且高劑量組比低劑量組升高更明顯，見表2。

表2 4組大鼠的熱覺痛閾比較（s）

2.3 4組大鼠脊髓組織中p65、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平的比較 與假手術(shù)組相比，溶媒組p65、IL-6、TNF-α的蛋白相對表達(dá)量均顯著升高（P＜0.01）。與溶媒組相比，低劑量組和高劑量組脊髓組織中p65、IL-6、TNF-α的熒光密度均降低，相比其他3組，高劑量組大鼠脊髓組織中p65、IL-6、TNF-α的蛋白相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）；與溶媒組相比，低劑量組p65蛋白相對表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.05），但兩組IL-6和TNF-α的蛋白相對表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見圖1。

圖1 4組大鼠脊髓組織中p65、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)的比較（a：蛋白電泳圖；b-d：蛋白相對表達(dá)量）

2.4 4組大鼠血清IL-6和TNF-α質(zhì)量濃度的比較與假手術(shù)組相比，溶媒組IL-6和TNF-α質(zhì)量濃度均上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；與溶媒組相比，低劑量組IL-6和TNF-α質(zhì)量濃度均下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與溶媒組相比，高劑量組IL-6和TNF-α質(zhì)量濃度均下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見圖2。

圖2 4組大鼠血清樣本IL-6和TNF-α質(zhì)量濃度比較

3 討論

一直以來，炎癥和疼痛的藥物治療存在較大挑戰(zhàn)。目前治療NP的藥物主要有抗抑郁藥、抗驚厥藥、非甾體類抗炎藥和阿片類藥物等4種，但長期使用易造成藥物相關(guān)不良事件，顯著影響了鎮(zhèn)痛治療的持續(xù)性、依從性和有效性，造成患者精神和生理功能的紊亂[13]。伴隨著現(xiàn)代藥理學(xué)與制劑技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究人員轉(zhuǎn)向傳統(tǒng)中草藥研究，尋找新的治療炎癥及疼痛的天然藥物[14-15]。

炎癥是機(jī)體應(yīng)對微生物病原體感染以及物理、化學(xué)刺激而發(fā)生的生理防御過程，受一系列炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的嚴(yán)格調(diào)節(jié)；受到疼痛刺激時(shí)，機(jī)體內(nèi)單核細(xì)胞選擇性運(yùn)輸?shù)酱碳げ课?，并分化為促炎巨噬?xì)胞，產(chǎn)生TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和其他炎癥介質(zhì)來促進(jìn)組織炎癥[16-17]。TNF-α和IL-6是炎癥發(fā)生時(shí)的主要促炎細(xì)胞因子，觸發(fā)初級傳入傷害感受器的激活，導(dǎo)致痛覺過敏[18]。

NF-κB信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長、分化，參與炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵信號通路，在慢性炎癥疾病和神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用。p65常與核因子κB抑制蛋白α（I-kappa-B-alpha,IκBα）以同源或異源二聚體形式構(gòu)成炎癥主要調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB；受到外界刺激時(shí)，IκBα通過蛋白酶體途徑參與NF-κB和p65的磷酸化，并發(fā)生水解，NF-κB易位到細(xì)胞核中，隨后激活參與細(xì)胞生長、分化和存活的多個(gè)下游基因的表達(dá)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)：α-細(xì)辛醚處理后大鼠脊髓和血清中TNF-α和IL-6相對表達(dá)量均顯著下調(diào)，脊髓中p65相對表達(dá)量顯著下調(diào)。此外，α-細(xì)辛醚抑制了CCI誘導(dǎo)的p65磷酸化，進(jìn)而消除NF-κB作用，抑制IL-6和TNF-α的產(chǎn)生；隨劑量加大，抑制程度上升。這提示α-細(xì)辛醚可能通過阻斷NF-κB信號通路的激活發(fā)揮治療神經(jīng)病理性疼痛的作用，且具有一定劑量依賴的特性。

α-細(xì)辛醚是中國傳統(tǒng)藥材石菖蒲的主要活性化合物，已被證實(shí)具有多種生物學(xué)功能[20-21]，如抗氧化、抗抑郁、抗焦慮、抗癲癇、抗腫瘤作用等。Sutariya等[10]發(fā)現(xiàn)：α-細(xì)辛醚對腎病綜合征有治療作用，在多柔比星誘導(dǎo)的腎病綜合征中，α-細(xì)辛醚能顯著抑制蛋白尿，降低膽固醇和甘油三酯并改善腎小球硬化。這種作用也是通過抑制NF-κB通路，下調(diào)IL-6、TNF-α等炎癥標(biāo)志物來介導(dǎo)的。

本研究初步證實(shí)了石菖蒲提取物α-細(xì)辛醚的抗炎活性，其機(jī)制可能是通過抑制NF-κB通路，抑制p65、IL-6、TNF-α的表達(dá)而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。α-細(xì)辛醚很可能成為鎮(zhèn)痛藥物的候選藥物之一。