基于PET效應(yīng)檢測(cè)8-氧鳥嘌呤DNA糖基化酶的熒光傳感器

劉 萍，金 東，李哲建，喬成芳

（1.商洛學(xué)院 化學(xué)工程與現(xiàn)代材料學(xué)院，陜西 商洛 726000；2.陜西省尾礦資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西商洛 726000；3.南京郵電大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 043000）

生物體的生命活動(dòng)經(jīng)常會(huì)受到內(nèi)、外致突變因素的影響，引起DNA 堿基損傷。8-氧鳥嘌呤（8-oxoG）是DNA氧化損傷的重要標(biāo)志［1］。8-氧鳥嘌呤DNA糖基化酶（OGG1）是一類存在于生物體內(nèi)能夠參與DNA 損傷修復(fù)過程的蛋白酶，可與DNA 雙鏈進(jìn)行非特異性結(jié)合，選擇性識(shí)別并切除DNA 雙鏈中的8-oxoG，形成脫嘌呤（AP）位點(diǎn)，并在一系列修復(fù)酶協(xié)助下完成DNA 分子的修復(fù)［2］。人體中8-氧鳥嘌呤DNA 糖基化酶（OGG1）稱為hOGG1。研究表明：OGG1的異常與多種疾病以及癌癥密切相關(guān)［3］，其已成為多種疾病發(fā)展?fàn)顟B(tài)的重要標(biāo)志物和癌癥的潛在治療靶點(diǎn)，因此實(shí)現(xiàn)對(duì)OGG1 活性的快速、靈敏檢測(cè)對(duì)于基礎(chǔ)生化研究和臨床醫(yī)學(xué)發(fā)展具有十分重要的意義。

檢測(cè)OGG1 的傳統(tǒng)方法有凝膠電泳法［4］、放射性檢測(cè)法［5］、高效液相色譜法（HPLC）［6］、比色法［7］、電化學(xué)法［8］和熒光分析法［9-10］等，如蔣健暉課題組［7］基于探針末端保護(hù)原理，利用表面修飾寡核苷酸的AuNP作為識(shí)別探針，發(fā)展一種檢測(cè)hOGG1活性的比色分析法。Liu等［8］基于hOGG1對(duì)8-oxoG 的識(shí)別特性，設(shè)計(jì)了包含8-oxoG及亞甲基藍(lán)分子（MB）的DNA探針，利用方波伏安法（SWV）表征hOGG1的活性，將酶活性成功轉(zhuǎn)化成物理信號(hào)輸出，建立了目標(biāo)蛋白與電化學(xué)信號(hào)之間的量化關(guān)系，構(gòu)建了靈敏的hOGG1 電化學(xué)傳感器。劉斌等［9］利用標(biāo)記熒光的發(fā)夾結(jié)構(gòu)分子信標(biāo)，設(shè)計(jì)含有8-oxoG 且有標(biāo)記的雙鏈DNA，利用hOGG1的特異性功能解鏈，再用適體與解旋鏈形成復(fù)合物，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)8-oxoG 切割過程建立了一種hOGGl 活性分析的新方法。李峰課題組［10］發(fā)展一種核酸外切酶ExoⅢ輔助的等溫循環(huán)信號(hào)放大策略，實(shí)現(xiàn)了對(duì)hOGG1活性的熒光檢測(cè)。但多數(shù)方法存在靈敏度差、操作復(fù)雜、分析耗時(shí)、儀器昂貴、污染環(huán)境等不足，極大地限制了方法的推廣應(yīng)用。

本文基于G堿基與羧基熒光素（FAM）產(chǎn)生光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）效應(yīng)［11-12］，利用OGG1酶能特異識(shí)別含有8-oxoG 的雙鏈DNA 的特點(diǎn)，建立了一種檢測(cè)OGG1 酶活性的熒光新方法。該方法具有操作簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-4600 型日立熒光分光光度計(jì)（日本日立公司），便攜式pH 計(jì)、XS105DU 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司），TGL-18C離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），移液槍（北京大龍公司），恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）。

三（羥甲基）氨基甲烷（Tris，上海青析化工科技有限公司），NaCl、EDTA、無水乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），MgCl2、Cd（NO3）2·4H2O（上海麥克林生化科技有限公司），均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水（18.2 MΩ·cm）。

8-氧鳥嘌呤糖基化酶（OGG1）、10×NEB緩沖液（100 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L MgCl2、10 mmol/L 1，4-二硫蘇糖醇（DTT），pH 7.0）、100 × 牛血清白蛋白（10 mg/mL BSA）購(gòu)于NEB 公司（New England Bioblabs 公司），尿嘧啶DNA 糖基化酶（UDG）、10 × 反應(yīng)緩沖液（200 mol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl，pH 8.2）核糖核酸酶（RNase A）、實(shí)驗(yàn)所用DNA序列（表1）均購(gòu)于上海生物工程股份有限公司。DNA 使用前在10 000 r/min 下離心5 min，然后用10 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（含1 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA，pH 8.0）配制成100μmol/L DNA儲(chǔ)備液，于-18 ℃冷凍保存。

表1 實(shí)驗(yàn)所用的DNA序列（5'-3'）Table 1 DNA sequences used in the experiment（5'-3'）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 雜交 取5μL 100μmol/L FAM-DNA1 溶液于離心管中，加入5μL 100μmol/L 含G 堿基且與FAM-DNA1 互補(bǔ)的DNA（c-DNA）溶液，用10 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（含50 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgCl2、1 mmol/L EDTA，pH 8.0）定容至100 μL，充分混合。然后置于水浴中緩慢升溫至95 ℃，保持10 min 后自然降至室溫并孵育30 min，室溫下避光培育過夜，使DNA 充分雜交。2 條單鏈DNA 序列互補(bǔ)，形成穩(wěn)定的DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)，將得到的FAM/dsDNA1 溶液儲(chǔ)存于4 ℃的冰箱中備用。采用同法得到FAM/dsDNA2。

1.2.2 OGG1 的測(cè)定 取100μL FAM/dsDNA1 溶液于比色皿中，測(cè)定其熒光強(qiáng)度（F0），然后加入不同濃度的OGG1，反應(yīng)溶液為1×NEB，300 g/mL BSA 的緩沖液，混勻后在40 ℃恒溫水浴中反應(yīng)2.5 h。待溶液冷卻至室溫后，設(shè)置熒光儀的激發(fā)波長(zhǎng)為490 nm，狹縫寬度為5 nm，激發(fā)和發(fā)射光倍增管電壓為700 V，在500 ～650 nm 范圍內(nèi)測(cè)定熒光發(fā)射光譜強(qiáng)度（F）。根據(jù)加入OGG1 前、后體系熒光強(qiáng)度的差值ΔF（ΔF=F-F0）測(cè)定OGG1的濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

基于G堿基對(duì)熒光染料的猝滅效應(yīng)以及OOG1對(duì)8-oxoG的識(shí)別和切除作用，以1條5'末端標(biāo)記羧基熒光素且含有8-oxoG 的DNA 鏈為信號(hào)探針，1 條3'末端含多個(gè)G堿基的互補(bǔ)序列作為猝滅基團(tuán)，當(dāng)2 個(gè)鏈雜交后G 堿基末端會(huì)接近FAM，從而引發(fā)有效的光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致熒光猝滅。當(dāng)體系中加入OGG1，其將受損G堿基剪切后DNA 序列產(chǎn)生缺口，較短的帶有FAM 信號(hào)的DNA 片段由于熔化溫度降低從互補(bǔ)鏈上解旋下來，釋放出FAM 的熒光信號(hào)，導(dǎo)致體系熒光增強(qiáng)。根據(jù)加入OGG1 前、后體系的熒光強(qiáng)度變化可實(shí)現(xiàn)對(duì)OGG1的活性檢測(cè)。檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of the experimental principles

2.2 傳感器的可行性

為驗(yàn)證方法的可行性，實(shí)驗(yàn)考察了加入OGG1 前、后反應(yīng)體系的熒光光譜（如圖2）。結(jié)果顯示，F(xiàn)AM-DNA1具有很強(qiáng)的熒光信號(hào)，與c-DNA雜交后體系的熒光強(qiáng)度明顯降低，說明形成雙鏈DNA 后G 堿基和FAM之間產(chǎn)生PET效應(yīng)，猝滅了FAM的熒光；當(dāng)向底物中加入OGG1 后，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，且加入的OGG1 濃度越大，熒光信號(hào)增強(qiáng)越大。說明向猝滅體系中加入OGG1 后，由于酶對(duì)oxoG 堿基的識(shí)別切除作用，使得雙鏈結(jié)構(gòu)被破壞，熔化溫度降低，釋放出帶FAM 的DNA片段，阻止了PET 過程，體系的熒光強(qiáng)度得到恢復(fù)。實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象與設(shè)計(jì)的原理相一致。

圖2 不同條件下FAM-DNA1的熒光光譜Fig.2 Fluorescent spectra of FAM-DNA1 in different conditions a：5 mmol/L FAM-DNA1；b：a+5 mmol/L c-DNA；c：b+10 U/mL OGG1；d：b+60 U/mL OGG1

為進(jìn)一步驗(yàn)證體系熒光信號(hào)的升高是OGG1 剪切釋放FAM-DNA 片段所致，以1 條相同序列的FAMDNA2 作為空白對(duì)照，在其它條件不變的情況下，考察其加入OGG1前、后體系的熒光信號(hào)變化（如圖3）。結(jié)果表明，F(xiàn)AM-DNA2與c-DNA雜交后熒光信號(hào)同樣被猝滅，當(dāng)加入OGG1 后熒光強(qiáng)度無明顯變化，說明雙鏈結(jié)構(gòu)未被破壞，不能產(chǎn)生熒光恢復(fù)。原因在于該體系中沒有供OGG1 特異識(shí)別切除的oxoG，當(dāng)加入OGG1 后，不會(huì)引起熒光信號(hào)的增強(qiáng)，進(jìn)一步驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)原理是合理的。

圖3 不同條件下FAM-DNA2的熒光光譜Fig.3 Fluorescent spectra of FAM-DNA2 in different conditions a：5 mmol/L FAM-DNA2；b：a+5 mmol/L c-DNA；c：b+60 U/mL OGG1

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.3.1 培育溫度的優(yōu)化 由于酶的活性與溫度有密切關(guān)系，溫度太低會(huì)使酶不能發(fā)揮最佳性能，溫度過高會(huì)使酶失去活性。為得到最佳的培育溫度，考察了加入酶后反應(yīng)體系溫度對(duì)熒光信號(hào)的影響。圖4 為加入OGG1后不同溫度時(shí)體系熒光強(qiáng)度的變化圖。由圖4 可知，當(dāng)反應(yīng)溫度在30 ～35 ℃時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度變化不明顯，當(dāng)溫度達(dá)40 ℃時(shí)，體系的熒光強(qiáng)度變化明顯增大，且繼續(xù)升溫時(shí)體系的熒光信號(hào)略有增加但變化不明顯?？紤]到實(shí)驗(yàn)效率，選擇培育溫度為40 ℃。

圖4 不同培育溫度對(duì)反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effects of different incubation temperature on fluorescence intensity of the reaction system FAM/dsDNA1：5μmol/L；OGG1：40 U/mL

2.3.2 剪切時(shí)間的優(yōu)化 剪切時(shí)間是一個(gè)非常重要的因素，影響著方法的靈敏度?？疾炝薋AM/dsDNA1 體系與OGG1充分作用所需的時(shí)間。圖5顯示了酶剪切時(shí)間對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果顯示，在30 ～180 min 范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度差值不斷增加，當(dāng)達(dá)到150 min 后，變化趨于平緩，ΔF達(dá)到一個(gè)平臺(tái)值，說明此時(shí)剪切反應(yīng)已趨于完全。因此，實(shí)驗(yàn)選擇最佳反應(yīng)時(shí)間為150 min。

圖5 加入OGG1后剪切時(shí)間對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of shear time on fluorescence intensity of the reaction system after addition of OGG1 FAM/dsDNA1：5μmol/L；OGG1：40 U/mL

2.4 線性范圍與檢出限

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)方法靈敏度進(jìn)行了評(píng)估。如上所述，當(dāng)向FAM/dsDNA1 體系中加入OGG1 前后，體系的熒光強(qiáng)度發(fā)生改變，通過熒光強(qiáng)度的變化值實(shí)現(xiàn)對(duì)OGG1 的活性檢測(cè)。向FAM/dsDNA1 體系中加入不同濃度OGG1，對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行測(cè)定（如圖6）。圖6A 顯示，隨著OGG1 濃度從2 U/mL 增至1 000 U/mL，體系的熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，表明OGG1 濃度越高，越多的FAM/dsDNA1 中的oxoG 受損堿基被切除，釋放越多帶FAM 信號(hào)的DNA片段，熒光增強(qiáng)變化越顯著，說明熒光信號(hào)的增強(qiáng)高度依賴OGG1 的濃度。由圖6B 可知，OGG1 的濃度（C，U/mL）在0 ～60 U/mL 范圍內(nèi)與體系熒光強(qiáng)度的變化值（ΔF）呈良好的線性關(guān)系，線性方程為：ΔF＝21.672 5C＋6.982 0，相關(guān)系數(shù)（r2）為0.993 2。根據(jù)3σ規(guī)則計(jì)算得到OGG1的檢出限為0.7 U/mL。

圖6 FAM/dsDNA1體系與不同濃度OGG1作用的熒光光譜（A），F(xiàn)AM/dsDNA1體系中加入不同濃度OGG1的線性曲線（B）Fig.6 Fluorescent spectra of FAM/dsDNA1 reaction system with different concentrations of OGG1（A），and linear curves of concentrations of OGG1 versus fluorescence intensity changes of FAM/dsDNA1 reaction systems（B）a：5μmol/L FAM-DNA1；b：a+5μmol/L c-DNA；OGG1（c-k）：2，10，20，40，60，80，100，500，1 000 U/mL

2.5 選擇性

選擇性是衡量檢測(cè)方法優(yōu)劣的重要指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)考察了其他蛋白質(zhì)對(duì)FAM/dsDNA1 熒光信號(hào)的影響。以UDG酶和RNase A 作為干擾酶，將UDG酶、RNase A 和OGG1分別加入到FAM/dsDNA1 反應(yīng)體系中，在FAM/dsDNA1為5 μmol/L，RNase A 為100 μg/mL，UDG 為100 U/mL，OGG1為40 U/mL條件下，檢測(cè)相應(yīng)的熒光強(qiáng)度變化。

結(jié)果顯示，RNase A 和UDG 體系的熒光信號(hào)變化（ΔF）很小，而在OGG1 存在情況下，熒光強(qiáng)度變化很大，說明本方法可以高特異性地區(qū)分OGG1 與其他干擾蛋白，對(duì)OGG1檢測(cè)有較好的選擇性，在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有很大的潛力。

2.6 抑制劑分析

Cd2+對(duì)許多酶存在抑制作用，常被選作酶抑制劑分析模型［13］。為研究OGG1抑制劑對(duì)OGG1酶活性的影響，選擇硝酸鎘Cd（NO3）2為抑制劑模型。OGG1的活性位點(diǎn)是通過Zn2+結(jié)合位點(diǎn)形成［14］，而Cd2+能夠占據(jù)該活性位點(diǎn)使得OGG1 活性被抑制［15］。在FAM/dsDNA1 為5 μmol/L，OGG1 為60 U/mL 條件下，將5、10、20、30、50、80μmol/L的Cd2+與OGG1在40 ℃下培育20 min，然后加入到FAM/dsDNA1體系進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測(cè)。

基于公式（1）確定OGG1 被抑制的相對(duì)活性（RA）。根據(jù)RA與Cd2+濃度擬合的曲線確定最大半抑制濃度（IC50）。

RA=（Fi-F0）/（FCd-F0） （1）

其中，F(xiàn)i為不存在Cd2+時(shí)的熒光強(qiáng)度；FCd為存在Cd2+時(shí)的熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，當(dāng)Cd2+濃度從0 增至80μmol/L 時(shí)，OGG1的相對(duì)活性逐漸降低。根據(jù)擬合曲線確定在60 U/mL OGG1體系中，Cd2+抑制作用的IC50為22.26μmol/L。說明本方法可用于對(duì)OGG1酶活性的抑制作用研究。

2.7 血清樣品中OGG1活性分析

采用本方法檢測(cè)了正常人血清中OGG1的濃度。將血液樣品在3 000 r/min下離心5 min，上層淡黃色液體即為待測(cè)的血清樣品，-4 ℃冷藏備用。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，將不同濃度的OGG1加入正常人血清樣品中，測(cè)定OGG1 的回收率。結(jié)果如表2 所示，OGG1 的回收率為99.1%～105%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.0%～4.3%。表明本方法可用于實(shí)際樣品中OGG1的定量分析，在臨床診斷中具有很大的應(yīng)用潛力。

表2 人血清樣品添加OGG1的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Recoveries and relative standard deviations of human serum samples added OGG1

3 結(jié) 論

本文基于脫氧鳥苷G 堿基的猝滅，設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)單、靈敏的熒光方法用于DNA 糖基化酶OGG1 的檢測(cè)。該方法具有明顯的優(yōu)勢(shì)：探針設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，避免探針的復(fù)雜合成；其識(shí)別響應(yīng)原理是高效的PET機(jī)制，且利用鳥嘌呤天然高效的熒光猝滅能力，無需使用有機(jī)染料分子標(biāo)記的DNA 或額外的納米材料作為猝滅劑，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本。方法不僅能提高OGG1 活性的分析效率，而且可為DNA損傷相關(guān)修復(fù)酶的檢測(cè)提供簡(jiǎn)便、通用的傳感平臺(tái)，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞中OGG1活性的檢測(cè)。