重金屬的生物體原位成像技術(shù)研究進(jìn)展

裴誠誠，聶亞光，趙亞楠，倪珅瑤，許 安，2*

（1.安徽大學(xué) 物質(zhì)科學(xué)與信息技術(shù)研究院，安徽 合肥 230601；2.環(huán)境毒理與污染控制技術(shù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院強(qiáng)磁場科學(xué)中心，安徽 合肥 230031）

重金屬是指密度大于4.5 g/cm3的金屬，一般存在于自然環(huán)境中，環(huán)境中的重金屬主要分布于大氣、水、土壤，其來源可分為自然來源和人為來源。隨著工業(yè)化、城市化進(jìn)程的不斷推進(jìn)，重金屬的污染程度和潛在生態(tài)風(fēng)險正逐漸增大［1］。目前我國很多地區(qū)受到不同程度的重金屬污染，其中大氣中的重金屬主要來源于工業(yè)生產(chǎn)和汽車尾氣排放，而水體中的重金屬主要來源于各類生產(chǎn)、生活污水排放［2］。重金屬能夠通過飲水、被污水灌溉的糧食和蔬菜等途徑進(jìn)入人體，從而危害人體健康［3］。

重金屬對人體的危害具有隱蔽性，當(dāng)少量重金屬攝入時不易被察覺，但通過食物鏈在人體中積累到一定程度會造成慢性中毒，損害人體健康［4］，因此檢測生物體內(nèi)重金屬的含量及分布對于解釋其致毒機(jī)制十分重要。不同重金屬對人體的毒性不同，例如微量的鎘（Cd）通過生物累積進(jìn)入人體后會對腎、肺、肝、睪丸、腦、骨骼以及血液系統(tǒng)產(chǎn)生一系列損傷［5］；飲水和食物導(dǎo)致的長期砷（As）暴露會顯著提升罹患癌癥風(fēng)險［6］；汞（Hg）主要通過消化道、呼吸道和皮膚等侵入人體，造成肺、腎、肝、神經(jīng)系統(tǒng)等發(fā)生病變［7］；而鉛（Pb）會降低人體的免疫力，直接損害生殖系統(tǒng)［8］。目前針對重金屬的毒理學(xué)一般借助模式生物，如秀麗隱桿線蟲［9］、蚯蚓、小鼠等進(jìn)行研究，將重金屬在生物體內(nèi)的積累與不同的生物學(xué)終點(diǎn)相結(jié)合進(jìn)行分析，如Yu 等［10］發(fā)現(xiàn)銅離子（Cu2+）在小鼠肝臟積累后會導(dǎo)致肝臟的線粒體吞噬及細(xì)胞凋亡從而造成肝損傷；Yin 等［11］的研究表明鉻離子（Cr6+）在魚的肝、腎中積累后，會引起氧化應(yīng)激從而造成器官損傷。

重金屬在生物體內(nèi)的分布及形態(tài)是決定其生物效應(yīng)的核心要素，是引起毒性和損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此原位檢測生物體內(nèi)重金屬是進(jìn)一步探索其致毒機(jī)制的重要手段?，F(xiàn)階段的主要檢測技術(shù)包括激光燒蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜法（LA-ICP-MS）、同步輻射以及金屬感測熒光團(tuán)成像等。由于發(fā)展周期較短，因此原位檢測重金屬分布的方法有限，同時不同檢測方法的原理、測試精度、對樣品大小及前處理方法的需求不同［12］，需研究人員對這些技術(shù)手段有全面深入的了解，以選擇對自身研究最有利的方法?；诖?，本文將從技術(shù)原理、前處理方法和實(shí)際應(yīng)用等方面介紹上述原位檢測生物體內(nèi)重金屬的手段。

1 激光燒蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜法（LA-ICP-MS）

1.1 LA-ICP-MS的基本原理及特點(diǎn)

LA-ICP-MS具有很高的靈敏度，是一種痕量和超痕量分析技術(shù)，具有較低的檢出限，幾乎無污染且干擾相對較小，可進(jìn)行生物體內(nèi)重金屬的原位成像分析。LA-ICP-MS主要由激光剝蝕（LA）系統(tǒng)和電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）系統(tǒng)兩部分組成，基本原理是將高能激光束聚焦于固體樣品表面進(jìn)行剝蝕取樣，隨后使用ICP-MS 分析產(chǎn)生的氣溶膠［13］。前者是一種快速直接的微區(qū)取樣技術(shù)，后者用于檢測所取生物樣品中的元素含量。由于高能激光束是直徑為數(shù)微米的光斑，因此通過LA連續(xù)采樣覆蓋生物樣品時，每一次采樣都如同一個“像素點(diǎn)”，測定其中的元素含量能獲取整個生物體的元素分布，具體工作流程及原理如圖1 所示［14］。由于樣品的激光剝蝕過程需在真空中進(jìn)行，因此在分析生物體內(nèi)元素分布前需對樣品進(jìn)行預(yù)處理，如冷凍干燥、切片等使其樣品狀態(tài)和大小以達(dá)到儀器檢測的標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 利用LA-ICP-MS檢測秀麗線蟲中銀（Ag）含量的原理及工作流程［14］Fig.1 Schematic and workflow for the detection of silver（Ag）in C. elegans by LA-ICP-MS［14］

激光的工作條件（包括燒蝕模式、光斑大小和激光能量密度等）對檢出限、分辨率和分析時間均有一定影響，測試前需確定合適的操作條件以保證分析的準(zhǔn)確性。對于LA-ICP-MS，選擇合適的空間分辨率十分重要，這不僅是一個光學(xué)設(shè)計(jì)問題，同時也取決于許多其他因素，如元素濃度、探測功率等。Brinkhaus等［15］總結(jié)LA-ICP-MS準(zhǔn)確分析需滿足3個條件：①激光剝蝕取樣需具有代表性，即激光剝蝕產(chǎn)生的氣溶膠的組成與樣品組成相同；②具有高的氣溶膠傳輸效率，即傳輸過程中氣溶膠損失較少；③具有高的離子化效率，即氣溶膠顆粒能在等離子體中完全離子化。

1.2 LA-ICP-MS在重金屬原位成像中的應(yīng)用

受限于樣品倉尺寸和LA 掃描速度，LA-ICP-MS 一般用于檢測小型動物，如線蟲等［15-17］。Brinkhaus等［15］通過LA-ICP-MS研究了L1期線蟲對錳（Mn）的吸收，將經(jīng)過暴露的線蟲離心沖洗冷凍干燥后直接進(jìn)行檢測，結(jié)果展示了線蟲體Mn元素的分布。Wang等［14］利用L3期線蟲檢測了納米二氧化鈦（TiO2NPs）對Cd吸收的影響，結(jié)果顯示TiO2NPs有助于Cd在線蟲生殖細(xì)胞和卵中的積累（圖2），從而增強(qiáng)了Cd的多世代毒性。Crone等［18］將L4期線蟲暴露在含鉑（Pt）的溶液中，洗滌后用冰甲醇進(jìn)行固定，利用LA-ICP-MS檢出Pt元素主要位于腸道及線蟲頭部。該技術(shù)可運(yùn)用到其他動物體內(nèi)金屬元素含量的檢測，對無法達(dá)到LA擊穿厚度的大型動物，可通過器官或組織切片進(jìn)行分析。Becker等［19］通過將小鼠心臟在液氮中冷凍后進(jìn)行切片檢測，得到的結(jié)果很直觀地展示了小鼠心臟金屬元素的分布，并觀察到心肌中的重金屬富集程度高于血液，與左心室相比，右心室的鋅（Zn）、Mn、Cu 濃度更高。Togao等［20］用冷凍干燥將小鼠整個腎臟、肝臟和大腦樣本處理后進(jìn)行切片，通過圖像結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)Pb在肝臟中分布均勻，在腎臟和大腦中分布不均勻，其中在大腦中Pb 主要積聚于髓質(zhì)而非皮質(zhì)。Pornwilard等［21］報道LA-ICP-MS 分析證實(shí)了Wilson 病伴隨有小鼠肝部鐵（Fe）、Cu 和Zn 的異常值，具有作為常規(guī)診斷依據(jù)的潛力，為實(shí)驗(yàn)和臨床肝病學(xué)提供了新的診斷證據(jù)。Egger 等［22］通過對人體組織切片的檢測，發(fā)現(xiàn)除了腎臟、骨骼和肝臟中有積累外，Cd在肌肉和脂肪中的含量很低，在直腸及腎臟中分布不均勻，Zn在人腦中分布不均勻，推測其在大腦中不同位置的作用不同。

圖2 利用LA-ICP-MS分析線蟲體內(nèi)Cd和Ti的分布［17］Fig.2 Distributions of Cd and Ti in C. elegans revealed by LA-ICP-MS［17］

除了動物個體和組織器官外，LA-ICP-MS 同樣廣泛應(yīng)用于植物體內(nèi)重金屬的檢測，如Becker等［23］在不同尺寸的薄片組織切片上觀察到多種重金屬元素的分布。楊紅霞等［24］通過對暴露于Cd溶液的印度芥菜進(jìn)行原位分析，發(fā)現(xiàn)Cd 大量積聚于韌皮部與木質(zhì)部組成的維管組織，且Cd 與鈣（Ca）具有相似的分布規(guī)律，說明重金屬元素進(jìn)入植株體內(nèi)吸收運(yùn)輸過程與其它元素相伴。Promchan等［25］通過LAICP-MS 對單個大米縱截面進(jìn)行重金屬分布分析，以此區(qū)分大米樣品的類型，從而為稻米顆粒分類提供了新依據(jù)。

LA-ICP-MS對許多重金屬元素均具有高靈敏度和高準(zhǔn)確性，可同時檢測生物樣品中多種重金屬元素的分布，同樣還可以通過外部校準(zhǔn)進(jìn)行半定量分析，以快速、直接進(jìn)行生物原位分析（表1）。LA是LAICP-MS技術(shù)的核心，未來的分析應(yīng)在成像分辨率、掃描速度以及對樣品的穿透性等方面進(jìn)行優(yōu)化。

表1 LA-ICP-MS在生物成像中的應(yīng)用Table 1 Application of LA-ICP-MS in bio-imaging

2 基于同步輻射（Synchrotron radiation）的成像方法

2.1 同步輻射成像的基本原理及特點(diǎn)

同步輻射光源是一種具有從遠(yuǎn)紅外到X射線波長范圍的連續(xù)光譜，具有高強(qiáng)度、高穩(wěn)定性以及寬波段等特點(diǎn)，同步輻射技術(shù)是利用同步輻射光源轟擊樣品，激發(fā)樣品中各元素的特征X射線，或與樣品發(fā)生交互作用時產(chǎn)生各種信號，然后接收和分析相應(yīng)信號，從而獲得被轟擊樣品的化學(xué)組成、原子價態(tài)及結(jié)構(gòu)組成等信息的技術(shù)［27］，可用于原位分析生物樣品。基于同步輻射技術(shù)的分析手段有很多，如同步輻射X射線熒光光譜（SRXRF）、同步輻射X射線吸收光譜（SRXAS）、X射線熒光顯微鏡（XFM）等［28］，這些測試方法具有選擇性強(qiáng)、靈敏度高等共同特性。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇合適的同步輻射方法，無需復(fù)雜前處理過程即可檢測生物樣品中的重金屬元素，實(shí)現(xiàn)原位無損分析。同步輻射技術(shù)的工作原理見圖3［29］。

圖3 識別晶體結(jié)構(gòu)的微X射線吸收近邊緣光譜（μ-XANES）及微衍射（μ-XRD）技術(shù)原理圖［29］Fig.3 Schematic diagram of micro-X-ray absorption near-edge spectroscopy（μ-XANES）and micro-diffraction（μ-XRD）techniques for identifying crystal structures［29］

2.2 同步輻射方法在重金屬原位成像中的應(yīng)用

由于同步輻射光源具有極強(qiáng)亮度，高垂直性，所以SRXRF具有檢出限低，對樣品損傷小，微米級光束（可進(jìn)行微區(qū)掃描、成像、結(jié)構(gòu)等分析，提供微觀精細(xì)信息）分辨率高，以及可同時檢測樣品中多種元素等特點(diǎn)。SRXRF的使用范圍廣，可運(yùn)用到大部分生物體內(nèi)的元素分析。Zhang等［30］將大腸桿菌在含鑭（La）溶液中進(jìn)行培養(yǎng)，再將線蟲接到含La元素的瓊脂板（NGM）中，利用SRXRF原位檢出La在線蟲L4時期體內(nèi)的分布，推斷線蟲體內(nèi)的La元素是通過食物大腸桿菌被攝入和積累。Gao等［31］通過SRXRF測得線蟲體內(nèi)K和Cu在體內(nèi)的含量，發(fā)現(xiàn)暴露于Cu納米顆?？蓪?dǎo)致K和Cu含量升高且線蟲中的Cu分布發(fā)生變化。袁靜等［32］對Pb污染的土壤中蚯蚓進(jìn)行原位分析，通過SRXRF發(fā)現(xiàn)蚯蚓體內(nèi)富集一定量的Pb，且主要集中在蚯蚓前部，此外還發(fā)現(xiàn)Pb在蚯蚓消化道表面固定，但未產(chǎn)生毒性效應(yīng)，因此推斷蚯蚓消化道表面可以阻止重金屬運(yùn)移到其他器官。Al-Ebraheem等［33］使用化學(xué)固定劑和冷凍干燥制備了人體表皮組織樣本，通過光斑尺寸為10μm×10μm的SRXRF檢出樣品中Fe、Cu在人體中的含量分布。Zhao等［34］通過SRXRF檢出Hg和硒（Se）在大蒜根、葉和莖中的含量，Se使莖中的Hg積累增加，但根和葉中的Hg積累減少，且Se抑制了Hg從根到葉的轉(zhuǎn)運(yùn)。Meng等［35］分析顯示稻米中的無機(jī)汞（Hg2+）在加工過程中會被清除，而毒性更大的甲基汞（MeHg）則被保留。同樣可用于元素原位檢測的還有XFM，Gao等［31］選用光束尺寸3μm×5μm的XFM觀察Cu納米顆粒在線蟲中的生物累積，在成蟲期，暴露于納米顆粒后Cu和K的水平升高，Cu的生物分布與未暴露對照組相比，其在頭部聚集明顯。James等［36］通過XFM觀察到線蟲從幼年到產(chǎn)卵后腸細(xì)胞中的Fe有所增加，但不足引起線蟲的衰老，實(shí)際衰老的原因是鐵蛋白功能喪失和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的喪失，因此線蟲衰老程度與線蟲體內(nèi)Fe的含量并無直接聯(lián)系。

重金屬對環(huán)境和人體健康的危害不僅受濃度影響，還取決于其形態(tài)，SRXAS可原位檢出生物體內(nèi)重金屬及微量元素的形態(tài)，為不同形態(tài)的重金屬元素的毒性效應(yīng)研究提供幫助。Weekley等［37］用SRXAS檢測了由食物進(jìn)行亞硒酸鹽暴露的小鼠體內(nèi)Se的形態(tài)及分布狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)在腎臟和肝臟中存在Se—Se和Se—C結(jié)構(gòu)，腎臟中還存在未在肝臟中發(fā)現(xiàn)的Se—S結(jié)構(gòu)，從而為在未來的疾病預(yù)防和治療中有效合理地使用硒化合物奠定了基礎(chǔ)。Diacomanolis等［38］用SRXAS將小鼠組織暴露于不同濃度的Cd2+溶液中，發(fā)現(xiàn)Cd2+在肝臟和腎臟中的配位環(huán)境一致，大多數(shù)Cd2+會與組織中金屬硫蛋白結(jié)合。Porcaro等［39］通過將擬南芥暴露于高濃度Cd2+后，檢出Cd2+在根和葉毛狀體的維管中積累，造成植物生長受阻。

由于不同同步輻射裝置檢測出的信息不同，聯(lián)用技術(shù)在原位成像方面發(fā)揮了很大作用。Guimar?es等［40］利用同步輻射X射線熒光微束分析（SR-μXRF）發(fā)現(xiàn)As主要在蝦的頭部和腹部節(jié)段有局部積累（圖4B），同時用μ-XANES在蝦的頭部對As進(jìn)行表征，并與LA-ICP-MS結(jié)果進(jìn)行對比分析，確定砷化物和砷酸膽堿是可能存在的形態(tài)，證實(shí)大多數(shù)As 以基本無毒的砷酸膽堿進(jìn)行代謝（圖4A、B）。Weekley等［41］用XAS和XFM聯(lián)用技術(shù)檢測了Se和Cu在小鼠腎臟中的分布及形態(tài)，發(fā)現(xiàn)在腎臟部位中這兩種元素含量較高，而XAS分析顯示在腎組織中存在Se—Se鍵，而非Se—Cu鍵，Cu在腎臟中與S、N元素相結(jié)合。Homma-Takeda等［42］通過SR-μXRF成像結(jié)合μ-XAFS，對小鼠組織進(jìn)行化學(xué)染色，以1μm×1μm的空間分辨率分析獲得鈾（U）在小鼠腎臟中的分布。Kopittke等［43］將豇豆的根暴露在As（Ⅲ）和As（Ⅴ）溶液中24 h，通過SRXRF與μ-XRF聯(lián)用檢測根中As的含量，發(fā)現(xiàn)As（Ⅴ）的積累量更多。

圖4 蝦體內(nèi)不同砷形態(tài)的熒光μ-XANES光譜（A），及蝦體內(nèi)的As、Ca、Br 元素分布（SR-μXRF）（B）［40］Fig.4 μ-XANES spectra of K-edge fluorescence of arsenic species in shrimp（A），and element distribution of As，Ca，Br in shrimp by SR-μXRF（B）［40］

基于同步加速器技術(shù)可對含水和新鮮植物組織中的金屬和類金屬進(jìn)行原位檢測，且不會造成明顯的損傷［44］。同步輻射相比于LA-ICP-MS 的分辨率更高，且可檢出重金屬在生物體內(nèi)的分布及形態(tài)，從而解釋其不同形態(tài)重金屬所造成的毒性效應(yīng)，但該技術(shù)受設(shè)備機(jī)時和樣品大小的限制。

表2列出了部分同步輻射在生物成像中的應(yīng)用。

表2 同步輻射在生物成像中的應(yīng)用Table 2 Application of synchrotron radiation in bio-imaging

3 金屬感測熒光團(tuán)（Metal sensing fluorophore）成像

3.1 金屬感測熒光團(tuán)成像的基本原理及特點(diǎn)

金屬感測熒光團(tuán)成像是通過熒光染料將金屬離子染色，從而檢測生物體內(nèi)重金屬的一種技術(shù)。圖5 展示了熒光PET（光誘電子轉(zhuǎn)移）傳感器識別重金屬的成像原理［45］。金屬熒光傳感器主要具有兩個基本特征：①金屬結(jié)合部位至少有一個熒光團(tuán)，與待測金屬結(jié)合后，用熒光顯微鏡檢測被熒光染色的離子；②不同熒光染料對金屬離子有特異性，因而能檢出生物體內(nèi)多種重金屬的分布［46］。

圖5 熒光PET傳感器識別重金屬的原理［45］Fig.5 Schematic of heavy metal recognition by fluorescent PET sensors［45］

3.2 金屬感測熒光團(tuán)成像在重金屬原位成像中的應(yīng)用

金屬感測熒光團(tuán)技術(shù)在線蟲中應(yīng)用廣泛，Huang等［47］通過一種基于超靈敏雙鏈DNA 特異性染料和無標(biāo)記核苷酸傳感器，將8種金屬離子染色后，發(fā)現(xiàn)對Pb2+具有很高的選擇性。Huo等［48］開發(fā)了一種Pb2+的熒光探針（TPI），其通過催化脫丙炔化反應(yīng)生成肟，能在80 s內(nèi)快速檢測到細(xì)胞內(nèi)低濃度的Pd2+。熒光探針也可原位檢測線蟲體內(nèi)的重金屬元素，如Kaletta等［49］在線蟲培養(yǎng)基上添加Zn特異性熒光染料，用熒光顯微鏡進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)在線蟲體內(nèi)的Zn2+主要集中在腸細(xì)胞的囊泡中。Chung等［50］利用氰化物傳感器與Cu2+之間的熒光作用判斷是否存在Cu2+。有研究報道了一種Fe3+選擇性熒光傳感器，該傳感器對Fe3+有62倍的熒光增強(qiáng)，可用于線蟲體內(nèi)Fe3+的分布檢測［51］。Chen 等［52］用一種含巰基和羧酸基團(tuán)的羅丹明腙衍生物作為Hg2+的選擇性熒光傳感器，可觀察到Hg2+在線蟲體內(nèi)的積累，由于熒光檢測的靈敏度高，可進(jìn)一步探索Hg2+在體內(nèi)的運(yùn)移情況，這是首次用熒光傳感器觀察到生物體內(nèi)nmol級別的Hg2+。

熒光感測技術(shù)不僅適用于線蟲體內(nèi)金屬的檢測（表3），同樣也可用于其他生物體內(nèi)金屬離子的檢測。Lakshmi等［53］發(fā)現(xiàn)含羅丹明單元的3種新型聚芳醚樹枝狀衍生物在含有其他競爭金屬離子的情況下可選擇性地感應(yīng)小鼠體內(nèi)的Hg2+。Hirayama 等［54］通過Cu 的熒光傳感器揭示了小鼠體內(nèi)Cu 含量的變化，為研究健康和疾病狀態(tài)下Cu 的生理行為提供了新的技術(shù)手段。Chereddy 等［55］合成了4 種基于羅丹明的選擇性識別金屬離子的化學(xué)傳感器，其中D 是1 種添加了三唑的無色化學(xué)傳感器，分別考察未處理和Cu2+孵育的成纖維細(xì)胞的顯微鏡和熒光顯微鏡照片（圖6A、B、D、E），發(fā)現(xiàn)在存在其他競爭性金屬離子的情況下，D仍可與Cu2+形成粉紅色的復(fù)合物（圖6C、F）。Shu等［56］用小鼠的Cu2+-EDTA單克隆抗體捕獲EDTA中的Cu2+，通過UV降解Cu2+-EDTA螯合物從而釋放游離Cu2+，并利用CdSe/ZnS量子點(diǎn)熒光的猝滅效應(yīng)檢測Cu2+。Xu等［57］利用熒光染料EPNP 檢測出芥菜植株和細(xì)胞中Hg2+的分布和運(yùn)輸，Hg2+被熒光染料染色后的共聚焦顯微鏡圖像顯示Hg2+主要積聚在溶解液泡而非細(xì)胞核或線粒體，研究結(jié)果為開展植物中金屬離子的分布、轉(zhuǎn)運(yùn)研究提供了新的技術(shù)手段。

圖6 未經(jīng)處理的成纖維細(xì)胞（A），與Cu2+（5μmol/L）孵育的成纖維細(xì)胞（B），以及與Cu2+（5μmol/L）和D化學(xué)傳感器（1μmol/L）孵育的成纖維細(xì)胞（C）的顯微圖像；未經(jīng)處理的成纖維細(xì)胞（D），與Cu2+（5μmol/L）孵育的成纖維細(xì)胞（E），以及與Cu2+（5μmol/L）和D化學(xué)傳感器（1μmol/L）孵育的成纖維細(xì)胞（F）的熒光顯微圖像［55］Fig.6 Microscopic images of untreated fibroblast cells（A），cells incubated with Cu2+（5μmol/L）（B），and cells incubated with Cu2+（5μmol/L）and D（1μmol/L）（C）；fluorescence microscopic images of untreated fibroblast cells（D），cells incubated with Cu2+（5μmol/L）（E），and cells incubated with Cu2+（5μmol/L）and D（1μmol/L）（F）［55］

表3 生物感測熒光團(tuán)成像的應(yīng)用Table 3 Application of fluorescence sensor in bio-imaging

熒光團(tuán)成像的核心機(jī)制是通過特異性熒光將特定的金屬元素染色后進(jìn)行直接觀察。由于熒光染料的特異性，該方法在只針對生物體內(nèi)某一種金屬元素時具有很好的選擇性，但和LA-ICP-MS及同步輻射技術(shù)相比，若同時將幾種金屬染色，則可能造成一定的干擾，因此并不適于同時研究生物體內(nèi)多種重金屬元素的含量及分布。

4 總結(jié)與展望

原位檢測技術(shù)除以上介紹的3種方法，激光誘導(dǎo)擊穿光譜（LIBS）［58-59］、拉曼光譜（需要制作基底間接檢測［60］）等技術(shù)在原位檢測生物體內(nèi)重金屬方面的應(yīng)用也在逐漸增加。根據(jù)已有文獻(xiàn)顯示，重金屬在生物體內(nèi)的原位成像已成為毒理學(xué)、病理學(xué)、環(huán)境化學(xué)等多學(xué)科領(lǐng)域的重要研究手段，是揭示重金屬與生物體相互作用的重要工具。通?？筛鶕?jù)研究需要選擇合適的檢測方法，LA-ICP-MS和同步輻射可以檢測生物體內(nèi)的幾乎所有重金屬元素［61-63］。其中LA-ICP-MS可檢測的重金屬種類與ICP-MS相同。而同步輻射技術(shù)一般用于檢測生物體內(nèi)元素價態(tài)及元素結(jié)合位點(diǎn)，如As形態(tài)的檢測，Cu在生物體內(nèi)結(jié)合方式的檢測等［64-65］。金屬感測熒光團(tuán)成像已用于Ag、Cd、Zn、Hg、Pb、Cu等元素的檢測［66-69］。盡管龐大的應(yīng)用需求推動了這些檢測手段的快速發(fā)展，也產(chǎn)生了許多具有典型代表性的工作，但受限于其自身的局限性，這些技術(shù)仍存在不足，如LA-ICP-MS的分辨率有待提高，樣品大小和厚度受限，同步輻射技術(shù)的設(shè)備機(jī)時有限，難以開展大規(guī)模檢測，金屬感測熒光團(tuán)在多種重金屬同時染色時存在干擾等（表4）。通過對上述3種方法的總結(jié)，可發(fā)現(xiàn)樣品大小、檢測時間、空間分辨率是生物體原位檢測時無法同時滿足的需求：目前進(jìn)行分析的樣品主要以小型動物的整體或是大型動植物的組織切片為主，類似線蟲、蚤等小型動物雖能做到整體的重金屬分布檢測，但分辨率不足以區(qū)分其內(nèi)部組織器官，大型動物僅以切片樣品進(jìn)行檢測，很難對重金屬在生物整體層面的傳輸和富集進(jìn)行表征，同時無限制擴(kuò)大樣品大小也會導(dǎo)致檢測分辨率無法適應(yīng)，從而造成檢測時間無法控制，因此在技術(shù)條件存在較大限制的情況下，研究者更需在選擇檢測方法時謹(jǐn)慎權(quán)衡。此外，目前的檢測方法還無法實(shí)現(xiàn)活體生物的檢測，一些重金屬與生物相互作用的細(xì)節(jié)無法被揭示，時間尺度上的動態(tài)變化過程只能通過截取不同暴露階段的不同生物樣品進(jìn)行探索，無損且能夠?qū)y試生物進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測的分析方法將是相關(guān)技術(shù)未來發(fā)展的方向。

表4 不同技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及使用范圍Table 4 Advantages，disadvantages and application scope of different technologies