超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜快速鑒定左歸降糖舒心方化學(xué)成分

黃雅蘭，張艷玲，向 琴，喻 嶸，吳勇軍，劉 秀

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410011；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 科技處，湖南 長(zhǎng)沙 410208；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；5.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

左歸降糖舒心方是湖南中醫(yī)藥大學(xué)陳大舜教授創(chuàng)立的中藥復(fù)方，由人參（Panax ginseng C. A. Meyer）、黃芪（Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge）、生地（Rehmannia glutinosa（Gaetn.）Libosch. ex Fisch. et Mey.）、葛根（Pueraria lobata（Willd.）Ohwi）、山茱萸（Cornus officinalis Sieb. et Zucc.）、丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）、黃連（Coptis chinensis Franch.）、麥冬（Ophiopogon japonicus（Linn. f.）Ker-Gawl.）、山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）9味中藥組成，具有滋陰益氣、活血解毒的功效，臨床多用于糖尿病合并心血管疾病的治療。本課題組的前期臨床與實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，左歸降糖舒心方可改善糖尿病合并冠心病、糖尿病合并心肌病患者的糖脂代謝異常，并改善心功能；可通過(guò)抗脂質(zhì)過(guò)氧化對(duì)轉(zhuǎn)基因2型糖尿病MKR鼠心肌產(chǎn)生保護(hù)作用［1］；體外實(shí)驗(yàn)表明，左歸降糖舒心方含藥血漿對(duì)氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)的J774A.1巨噬細(xì)胞泡沫化和細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用［2］。雖然臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明左歸降糖舒心方的療效顯著，但尚未對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)全面分析，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)鮮有報(bào)道。

超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)（UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS）以靈敏度高、分辨率高、質(zhì)量精度高等優(yōu)點(diǎn)成為快速分離鑒定中藥復(fù)方化學(xué)成分的有力工具。本研究采用該技術(shù)對(duì)左歸降糖舒心方進(jìn)行化學(xué)成分分析，可不依賴于實(shí)時(shí)質(zhì)量軸校正，能長(zhǎng)時(shí)間維持ppm 級(jí)的質(zhì)量準(zhǔn)度。實(shí)驗(yàn)樣品經(jīng)液相色譜分離后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，以高分辨質(zhì)譜采集得到的一級(jí)和二級(jí)精確質(zhì)量數(shù)為未知物鑒定最主要的信息，并通過(guò)數(shù)據(jù)依賴性采集模式獲得高質(zhì)量的二級(jí)質(zhì)譜圖。各個(gè)碎片亦具有超高質(zhì)量精度，可以準(zhǔn)確擬合出各碎片的化學(xué)式。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜及相關(guān)中藥數(shù)據(jù)庫(kù)匹配，從左歸降糖舒心方水煎液中共鑒定出290 個(gè)化學(xué)成分，為進(jìn)一步研究左歸降糖舒心方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，指導(dǎo)臨床合理用藥以及后期實(shí)驗(yàn)研究提供了參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及軟件

Vanquish Flex 超高效液相色譜儀、Thermo Scientific?Q Exactive 四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀、Heraeus Pico& Fresco 離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific 公司）。定性分析軟件：Compound Discoverer軟件及Xcalibur qual browser（Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 藥材與試劑

左歸降糖舒心方組方藥材購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院吳勇軍教授鑒定為正品。將各味中藥放于砂鍋中以5倍蒸餾水浸泡1 h，加熱煮沸后，轉(zhuǎn)用文火煎煮20 min，紗布過(guò)濾藥液，藥渣再加3倍量蒸餾水煎煮20 min并過(guò)濾，將兩次煎煮的濾液濃縮至含生藥量為2 g/mL的藥液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?5 mL中藥水煎液高速離心，取上清液直接進(jìn)樣。

甲酸、乙腈（HPLC級(jí)，德國(guó)默克公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件 Vanquish Flex超高效液相色譜系統(tǒng)由真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱和二元泵組成。色譜柱為Xbridge BEH C18（2.1 mm×100 mm，2.6μm，Waters公司）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水（A）和乙腈（B）。流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣體積為10 μL，柱溫為40 ℃。梯度洗脫程序如下：0 ～1.5 min，2% B；1.5 ～20 min，2% ～45% B；20 ～27 min，45% ～95% B；27 ～32 min，95% B；32 ～32.1 min，95%～2%B；32.1 ～35 min，2%B。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源正、負(fù)離子（±ESI）檢測(cè)模式，離子源參數(shù)如下：噴霧電壓：+3.8 kV/-3.0 kV；鞘氣壓力：6 L/min；輔助氣體壓力：10 L/min；毛細(xì)管溫度：300 ℃；加熱器溫度：450 ℃；S-Lens：50。質(zhì)譜掃描參數(shù)：掃描范圍m/z100 ～1 500；全質(zhì)量分辨率（軌道阱分辨率）：70 000，MS/MS分辨率：17 500；碰撞能量：歸一化碰撞能量：20、40、60。使用Xcalibur 4.3和Compound Discoverer 3.2化學(xué)工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 左歸降糖舒心方水煎液的化學(xué)成分分析

本實(shí)驗(yàn)利用Compound Discoverer 軟件檢索本地標(biāo)準(zhǔn)品自建二級(jí)質(zhì)譜庫(kù)，及網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)mzCloud、Chemspider和GNPS等對(duì)未知物進(jìn)行鑒定，結(jié)合一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜及數(shù)據(jù)庫(kù)匹配，從左歸降糖舒心方水煎液中共鑒定出290種化學(xué)成分。圖1為樣品在正、負(fù)離子模式下的總離子流圖。其中224個(gè)為已知的化學(xué)成分，包括黃酮類68 個(gè)、苯丙素類31 個(gè)、酚類26 個(gè)、皂苷類23 個(gè)、有機(jī)酸類20 個(gè)、生物堿類15 個(gè)、核苷類13 個(gè)、環(huán)烯醚萜類11 個(gè)、寡糖類4 個(gè)及13 個(gè)其它類型組分；66 個(gè)化合物為新發(fā)現(xiàn)的成分，主要為氨基酸/小肽類。所鑒定化學(xué)成分的保留時(shí)間、分子式、高分辨質(zhì)譜母離子、碎片離子信息、成分類別、藥材來(lái)源如表1所示。

圖1 左歸降糖舒心方在正（A）、負(fù)（B）離子模式下的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of Zuogui Jiangtang Shuxin formula in the positive（A）and negative（B）ion modes

表1 左歸降糖舒心方化學(xué)成分的鑒定結(jié)果Table 1 Results of the chemical components of Zuogui Jiangtang Shuxin formula

（續(xù)表1）

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（續(xù)表1）

2.2 質(zhì)譜分析

2.2.1 黃酮類 在左歸降糖舒心方水煎液中鑒定出的黃酮類化合物數(shù)量最多，共68 種，主要來(lái)源于組方中的黃芪、葛根、山茱萸、丹參、山楂，包含黃酮、異黃酮、黃酮醇、二氫黃酮類、查爾酮等不同結(jié)構(gòu)類型。以化合物148為例，從一級(jí)質(zhì)譜圖可見(jiàn)該成分的準(zhǔn)分子離子峰為［M+H］+m/z417.117 7，擬合元素組成可知其分子式為C21H20O9；二級(jí)質(zhì)譜圖中可見(jiàn)丟失葡萄糖所得［M + H-C6H10O5］+m/z255.065 26 的特征碎片離子，此黃酮苷元進(jìn)一步碎裂得到m/z199.075 42、181.064 76、137.023 44。該化合物鑒定為黃豆苷，為異黃酮類結(jié)構(gòu)類型。

化合物177 從一級(jí)質(zhì)譜圖可見(jiàn)準(zhǔn)分子離子峰為［M+H］+m/z465.102 8，擬合元素組成可知其分子式為C21H20O12；二級(jí)質(zhì)譜圖中可見(jiàn)丟失葡萄糖所得［M+H-C6H10O5］+m/z303.050 02 的特征碎片離子，此黃酮苷元進(jìn)一步碎裂C2H2O3所得的碎裂離子m/z229.049 64，及C環(huán)RDA碎裂所得的m/z153.018 20。該化合物鑒定為槲皮素3-O-葡萄糖苷，為黃酮醇類結(jié)構(gòu)類型。

化合物222 從一級(jí)質(zhì)譜圖可見(jiàn)準(zhǔn)分子離子峰為［M+H］+m/z257.080 9，擬合元素組成可知其分子式為C15H12O4；二級(jí)質(zhì)譜圖中可見(jiàn)碎裂C6H6O2所得m/z147.044 05，碎裂C8H8O 所得m/z137.023 38，以及此兩個(gè)碎片離子進(jìn)一步碎裂C2O2分別所得的碎裂離子m/z91.054 24及81.033 54。該化合物鑒定為異甘草素，為查爾酮類結(jié)構(gòu)類型。

2.2.2 氨基酸/小肽類 在左歸降糖舒心方水煎液中共鑒定出66種氨基酸/小肽類化合物，小肽類物質(zhì)可見(jiàn)逐步碎裂不同數(shù)目氨基酸的過(guò)程，最終可見(jiàn)氨基酸碎裂CO2和NH3的過(guò)程。以化合物5為例，其保留時(shí)間為0.931 min，從一級(jí)質(zhì)譜圖可見(jiàn)準(zhǔn)分子離子峰為［M+H］+m/z175.119 1，擬合元素組成可知其分子式為C6H14N4O2；二級(jí)質(zhì)譜圖中可見(jiàn)丟失CH3ON 所得m/z130.097 56 的碎片離子，丟失CH5N3所得m/z116.070 62的碎片離子，以及進(jìn)一步碎裂所得的碎片離子m/z60.055 93和70.065 22。該化合物鑒定為DL-精氨酸。

2.2.3 苯丙素類 在左歸降糖舒心方水煎液中共鑒定出31種苯丙素類化合物，主要來(lái)源于組方中的丹參、山楂。苯丙素類物質(zhì)可見(jiàn)丟失不同數(shù)目的丹參素過(guò)程，低質(zhì)量端可見(jiàn)特征碎片離子C6H6O2的結(jié)構(gòu)單元。以化合物216 為例，其保留時(shí)間為12.709 min，從一級(jí)質(zhì)譜圖可見(jiàn)準(zhǔn)分子離子峰為［M-H］-m/z717.146 4，擬合元素組成可知其分子式為C36H30O16；二級(jí)質(zhì)譜圖中可見(jiàn)丟失1分子丹參素所得［M-HC9H10O5］-m/z519.093 44，及進(jìn)一步丟失1分子丹參素所得［M-H-2C9H10O5］-m/z321.040 53的特征碎片離子，及［C6H6O2-H］-m/z109.029 46碎片離子。該化合物鑒定為丹酚酸B，碎裂機(jī)理如圖2所示。

圖2 丹酚酸B的質(zhì)譜裂解途徑Fig.2 The mass fragmentation pathways proposed for salvianolic acid B

2.2.4 酚類 在左歸降糖舒心方水煎液中共鑒定出26 種酚類化合物，主要來(lái)源于組方中的丹參、黃芪、葛根。酚類物質(zhì)主要經(jīng)歷碎裂脫水的過(guò)程，以化合物48 為例，其保留時(shí)間為2.764 min，從一級(jí)質(zhì)譜圖可見(jiàn)準(zhǔn)分子離子峰為［M-H］-m/z315.072 3，擬合元素組成可知其分子式為C13H16O9；二級(jí)質(zhì)譜圖中可見(jiàn)丟失1 分子葡萄糖所得［M-H-C6H11O5］-m/z152.011 47，及進(jìn)一步丟失1 分子CO2所得［MH-C6H11O5-CO2］-m/z108.021 65的特征碎片離子。該化合物鑒定為龍膽酸-5-O-葡萄糖苷。

2.2.5 皂苷類 在左歸降糖舒心方水煎液中共鑒定出23種皂苷類，主要來(lái)源于組方中的人參、黃芪。皂苷類物質(zhì)主要經(jīng)歷不同數(shù)目糖碎裂的過(guò)程，高碰撞能量下苷元可發(fā)生進(jìn)一步裂解。人參中皂苷類成分鑒定以峰262為例，其保留時(shí)間為18.803 min，從一級(jí)質(zhì)譜圖可見(jiàn)該成分的準(zhǔn)分子離子峰為［M+H］+m/z947.556 3，擬合元素組成可知其分子式為C48H82O18；二級(jí)質(zhì)譜圖中可見(jiàn)丟失糖所得的苷元母核相關(guān)碎片離子m/z443.388 28、425.378 30、407.367 58，低質(zhì)量端可見(jiàn)雙糖的碎片離子C12H21O+10m/z325.113 37，及單糖的碎片離子C6H11O+5m/z163.060 21。此化合物鑒定為人參皂苷Rd，碎裂機(jī)理如圖3所示。黃芪中皂苷類成分鑒定以峰259 為例，其保留時(shí)間為18.208 min，從一級(jí)質(zhì)譜圖可見(jiàn)準(zhǔn)分子離子峰為［M+H］+m/z785.467 8，擬合元素組成可知其分子式為C41H68O14；二級(jí)質(zhì)譜圖中可見(jiàn)丟失糖及水所得的苷元母核相關(guān)碎片離子m/z569.383 24，進(jìn)一步脫糖所得的碎片離子m/z437.342 10，此外低質(zhì)量端可見(jiàn)特征碎片離子m/z143.106 74。此化合物鑒定為黃芪甲苷。

圖3 人參皂苷Rd的質(zhì)譜裂解途徑Fig.3 The mass fragmentation pathways proposed for ginsenoside Rd

2.2.6 丹參酮類 在左歸降糖舒心方水煎液共鑒定出6 種丹參酮類化合物，來(lái)源于組方中的丹參藥材。以化合物285 為例，其保留時(shí)間為24.250 min，從一級(jí)質(zhì)譜圖可見(jiàn)準(zhǔn)分子離子峰為［M + H］+m/z297.148 5，擬合元素組成可知其分子式為C19H20O3；二級(jí)質(zhì)譜圖中可見(jiàn)丟失CH3所得m/z282.125 18 的碎片離子，丟失H2O 所得m/z279.137 94 的碎片離子，以及進(jìn)一步碎裂CO 分別所得的碎片離子m/z254.093 86和251.143 04。該化合物鑒定為隱丹參酮。

2.2.7 有機(jī)酸類 在左歸降糖舒心方水煎液中共鑒定出20 種有機(jī)酸類成分，主要來(lái)源于組方中的山楂、山茱萸、人參。有機(jī)酸類物質(zhì)主要是碎裂CO2和H2O 的過(guò)程，以化合物25 為例，其保留時(shí)間為1.243 min，從一級(jí)質(zhì)譜圖可見(jiàn)準(zhǔn)分子離子峰為［M-H］-m/z117.019 3，擬合元素組成可知其分子式為C4H6O4；二級(jí)質(zhì)譜圖中可見(jiàn)丟失H2O 所得［M-H-H2O］-m/z99.008 74，及丟失1 分子CO2所得［MH-CO2］-m/z73.029 49的特征碎片離子。該化合物鑒定為琥珀酸。

2.2.8 生物堿類 在左歸降糖舒心方水煎液中共鑒定出15 種生物堿類成分，主要來(lái)源于組方中的黃連，生物堿類物質(zhì)主要碎裂不同數(shù)目的CH4和CO，以及母核進(jìn)一步碎裂。以成分214 為例，其保留時(shí)間為12.529 min，從一級(jí)質(zhì)譜圖可見(jiàn)準(zhǔn)分子離子峰為M+m/z336.122 7，擬合元素組成可知其分子式為C20H17NO4；二級(jí)質(zhì)譜圖中可見(jiàn)脫甲烷所得［M-CH4］+m/z320.091 92，進(jìn)一步脫CO 所得［M-CH4-CO］+m/z292.096 92，及進(jìn)一步碎裂CH2所得［M-CH4-CO-CH2］+m/z278.081 33。此化合物鑒定為小檗堿，碎裂機(jī)理如圖4所示。

圖4 小檗堿的質(zhì)譜裂解途徑Fig.4 The mass fragmentation pathways proposed for berberine

2.2.9 核苷類 在左歸降糖舒心方水煎液中共鑒定出13種核苷類成分，主要來(lái)源于組方中的生地。核苷類物質(zhì)主要經(jīng)歷糖碎裂的過(guò)程，以及堿基母核的進(jìn)一步裂解，以化合物21為例，其保留時(shí)間為1.223 min，從一級(jí)質(zhì)譜圖可見(jiàn)準(zhǔn)分子離子峰為［M+H］+m/z268.104 2，擬合元素組成可知其分子式為C10H13N5O4；二級(jí)質(zhì)譜圖中可見(jiàn)丟失糖所得m/z136.061 75的碎片離子，進(jìn)一步丟失NH3所得m/z119.035 20的碎片離子。該化合物鑒定為腺苷。

2.2.10 環(huán)烯醚萜類 在左歸降糖舒心方水煎液中共鑒定出11種環(huán)烯醚萜類成分。該類物質(zhì)主要經(jīng)歷糖碎裂的過(guò)程，以及母核碎裂CO2和H2O 的過(guò)程。以化合物94為例，其保留時(shí)間為6.149 min，從一級(jí)質(zhì)譜圖可見(jiàn)準(zhǔn)分子離子峰為［M-H］-m/z375.129 5，擬合元素組成可知其分子式為C16H24O10；二級(jí)質(zhì)譜圖中可見(jiàn)丟失1 分子葡萄糖所得［M-H-C6H10O5］-m/z213.077 00，及進(jìn)一步丟失1 分子CO2所得［MH-C6H10O5-CO2］-m/z169.087 11的特征碎片離子。該化合物鑒定為馬錢酸。

2.2.11 寡糖類 在左歸降糖舒心方水煎液中共鑒定出4 種寡糖類成分，該類物質(zhì)會(huì)發(fā)生不同數(shù)目的糖依次碎裂，最終單個(gè)糖環(huán)發(fā)生裂解。以化合物38 為例，其保留時(shí)間為2.137 min，從一級(jí)質(zhì)譜圖可見(jiàn)準(zhǔn)分子離子峰為［M-H］-m/z341.108 7，擬合元素組成可知其分子式為C12H22O11；二級(jí)質(zhì)譜圖中可見(jiàn)碎裂1 分子糖所得［M-H-C6H10O5］-m/z179.056 21，進(jìn)一步丟失H2O 所得m/z161.045 64 的碎片離子，及環(huán)碎裂所得的m/z89.024 44。該化合物鑒定為海藻糖。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)UHPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS 技術(shù)，共鑒定出左歸降糖舒心方中290 個(gè)化學(xué)成分，并對(duì)化合物的成分類別和來(lái)源進(jìn)行歸屬。有24個(gè)化合物來(lái)源于黃芪，主要為黃酮類；15個(gè)來(lái)源于人參，主要為皂苷類；29個(gè)來(lái)源于生地，主要為核苷類；29個(gè)來(lái)源于葛根，主要為黃酮類；27個(gè)來(lái)源于山茱萸，主要為黃酮類；49個(gè)來(lái)源于丹參，主要為苯丙素類、黃酮類；16個(gè)來(lái)源于黃連，主要為生物堿類；7 個(gè)來(lái)源于麥冬，主要為皂苷類；45 個(gè)來(lái)源于山楂，主要為苯丙素類、黃酮類、有機(jī)酸類。在鑒定出的成分中，以黃酮類化合物數(shù)量最多，是左歸降糖舒心方發(fā)揮療效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃酮類化合物具有廣泛的生物和藥理活性，包括抗炎、抗氧化、抗糖尿病和保護(hù)心腦血管等作用，對(duì)治療糖尿病并發(fā)癥非常有益［3］。

參考與人參、黃芪、生地、葛根、山茱萸、丹參、黃連、麥冬、山楂相關(guān)的文獻(xiàn)［4-21］，結(jié)合氨基酸/小肽類的特征性裂解途徑，本實(shí)驗(yàn)新發(fā)現(xiàn)了66 種氨基酸/小肽類化合物。小肽類化合物被認(rèn)為是新一代生物活性調(diào)節(jié)劑，可防止細(xì)胞的氧化和炎癥，預(yù)防糖尿病的發(fā)展［22］。

3 結(jié) 論

中藥復(fù)方通常含有多種藥材，成分非常復(fù)雜，其療效來(lái)源于多種成分的綜合作用。一種快速、高效、精確的化學(xué)成分鑒定方法對(duì)于復(fù)雜的中藥復(fù)方非常重要。本研究結(jié)果表明，采用UHPLC-QExactive-Orbitrap-MS 技術(shù)可以快速并系統(tǒng)全面地對(duì)左歸降糖舒心方中的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，在一定程度上彌補(bǔ)了現(xiàn)階段對(duì)左歸降糖舒心方成分研究的不足，為左歸降糖舒心方的質(zhì)量控制及今后相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。