侯 瑾,楊 凱,薛 冰,張大虎,陸世海*
(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 山東省科學(xué)院菏澤分院 山東省生物工程技術(shù)創(chuàng)新中心,山東菏澤 274000;2.聊城市檢驗(yàn)檢測中心,山東聊城 252000;3.山東大樹達(dá)孚特膳食品有限公司,山東菏澤 274000)
新鮮牛奶中的營養(yǎng)物質(zhì)極其豐富,總?cè)楣腆w平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.0%,有全價食品之譽(yù)[1]。乳汁中的碳水化合物主要是乳糖,占總碳水化合物的99.8%以上[2-3]。乳糖酶,又叫β-半乳糖苷酶,催化乳糖中的糖苷鍵,產(chǎn)生單體糖d-葡萄糖和d-半乳糖,還可轉(zhuǎn)移半乳糖苷生成功能性低聚半乳糖[4]。乳糖在腸道中需要通過乳糖酶水解成單糖,才能被人體吸收[5]。對多數(shù)人來說,從母乳斷奶期開始,乳糖酶的活性表達(dá)下降到無法檢測到的水平[6]。缺少乳糖分解酶的人群在攝入乳糖后,未被消化的乳糖直接進(jìn)入大腸,在細(xì)菌的作用下,乳糖被酵解生成短鏈脂肪酸、二氧化碳、氫氣和甲烷,引發(fā)腹脹、腹痛、水樣酸性腹瀉等胃腸癥狀,減少腸道對無機(jī)鹽和蛋白質(zhì)的營養(yǎng)吸收,這就是乳糖不耐癥現(xiàn)象[7-8]。乳糖不耐癥人群的骨骼比正常人群差,影響對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收,繼而導(dǎo)致貧血、骨質(zhì)疏松等疾病的發(fā)生[9-10]。同時,乳糖不耐癥較大程度地限制了我國乳品業(yè)的發(fā)展。食用低乳糖乳制品是解決乳糖不耐癥人群的主要方法。而低乳糖乳制品加工生產(chǎn)中加入外源性乳糖酶將乳糖水解成易被人體吸收的單糖,是目前使用較好的方法,此法水解條件溫和、口感好,不會破壞乳品中的多種營養(yǎng)成分,并能增加奶的香味、甜度、改善口感,提高對礦物元素的吸收利用[11]。開發(fā)高效高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)乳糖酶產(chǎn)品和改良優(yōu)化乳糖酶水解工藝,對開拓低乳糖乳品市場,推動我國乳品工業(yè)的發(fā)展具有重大意義。
乳糖酶是一種無毒副作用的生物酶制劑,種類較多,來源十分豐富,包括多種植物、動物(哺乳動物)和微生物。杏、李、桃和咖啡豆等是植物中乳糖酶的主要來源,腦器官、腸和皮膚組織是動物中乳糖酶的主要來源。乳糖酶的微生物來源包括細(xì)菌、霉菌、酵母菌、真菌和放線菌,其中細(xì)菌主要包括乳酸菌、大腸桿菌、嗜熱鏈球菌、產(chǎn)氣腸細(xì)菌和環(huán)狀芽孢桿菌等,霉菌主要包括米曲霉、黃青霉、黑曲霉、炭色曲霉和硫球曲霉等,酵母有脆壁克魯維酵母、乳酸克魯維酵母和熱帶假絲酵母等,放線菌包括天藍(lán)色鏈菌霉。
由于微生物生長速度快,代謝效率高,用微生物制備出的乳糖酶在工業(yè)上有很高的應(yīng)用價值。利用微生物制備乳糖酶現(xiàn)已是工業(yè)化酶制劑的主要來源[12]。此方法具有產(chǎn)量高、周期短、酶源豐富和生產(chǎn)成本低,且季節(jié)、地理位置等因素對其生長無影響等優(yōu)點(diǎn)。微生物的種類不同,制備出的乳糖酶性質(zhì)也存在較大的差別,詳見表1。
表1 不同來源的乳糖酶特性
此酶的分子量是201 000,最適溫度為40~45 ℃,最適pH值為6.0~7.0,在高于55 ℃下基本失活。天然新鮮牛乳中含有較多的脆壁克魯維酵母菌,由其制備出的乳糖酶活性很高,最適pH值為6.6~6.8,接近于天然牛乳,是中性乳糖酶,主要適用于工業(yè)化加工處理牛乳和甜乳清,且該乳糖酶在4 ℃時仍具備一定活力[13]。在低溫條件下,腐敗菌的生長基本上停止,但是牛乳和乳清可在4~5 ℃低溫條件下過夜加工且無腐敗現(xiàn)象發(fā)生,因此對于牛奶和乳清中的乳糖,可用制備出的乳糖酶在低溫下進(jìn)行分解,此法在乳品加工中可有效避免雜菌污染,在工業(yè)應(yīng)用上十分重要。脆壁克魯維酵母產(chǎn)出的乳糖酶量較多,且被認(rèn)為是安全菌株,因此這種菌株在工業(yè)上被廣泛應(yīng)用于乳糖酶的生產(chǎn)。
由黑曲霉制備出的乳糖酶分子量相對較小,為100 000~130 000,溫度最適為60~65 ℃,最適pH值為3.5~4.0,在此條件下大部分常見的腐敗細(xì)菌生長都能被抑制。黑曲酶制備的乳糖酶主要用于加工酸乳、酸性乳清和干酪,因酶分子量小,無需相關(guān)金屬離子穩(wěn)定與激活的參與,因此在食品加工中使用較方便。
由米曲霉制備出的乳糖酶的最適pH值為4.0~5.0,最適溫度為50~55 ℃。乳糖酶在70 ℃下持續(xù)加熱2 h后活性幾乎完全喪失。由米曲霉制備出的乳糖酶主要用于牛乳或酸乳的加工應(yīng)用。因此,在具體的牛乳工業(yè)生產(chǎn)中,不同的酶對應(yīng)不同的最適溫度,各有各的優(yōu)點(diǎn),要根據(jù)需求進(jìn)行選擇。孫國慶等[14]研究了來源于米曲酶、黑曲酶和酵母菌制備的乳糖酶的水解效果,發(fā)現(xiàn)由酵母菌制備出的乳糖酶水解率最高,因此酵母菌乳糖酶最適合低乳糖牛乳的生產(chǎn)。
經(jīng)過多年的發(fā)展,低乳糖牛奶的生產(chǎn)技術(shù)不斷提升,最簡單方便的工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)是使用乳糖酶水解技術(shù),且此項(xiàng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于全球范圍內(nèi)。工業(yè)化生產(chǎn)低乳糖牛奶大多使用游離乳糖酶,較少使用固定化乳糖酶[15]。乳糖酶水解技術(shù)根據(jù)添加方式的差異,分為分批次水解技術(shù)和包裝內(nèi)無菌添加技術(shù)[16]。目前,乳糖酶產(chǎn)品隨著低乳糖乳制品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展日益提升,質(zhì)量和純度也越來越高。但商業(yè)化乳糖酶制劑有蛋白水解酶活性,牛奶里的蛋白質(zhì)可以在其作用下被水解成肽和游離氨基酸等小分子,導(dǎo)致非酶褐變和異味,對低乳糖乳制品在保藏期內(nèi)的品質(zhì)產(chǎn)生一定影響。
牛奶經(jīng)過巴氏殺菌,冷卻到合適的溫度,然后直接加中性乳糖酶后充分混合,在4~8 ℃的低溫條件下進(jìn)行水解,直到達(dá)到所需的乳糖水解度后,進(jìn)行滅酶和超高溫瞬時滅菌或巴氏殺菌處理,冷卻后灌裝。此技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是不需要添加專門的設(shè)備。
牛奶經(jīng)過超高溫瞬時滅菌處理后,使用專門的無菌添加設(shè)備向其添加無菌乳糖酶進(jìn)行水解,然后進(jìn)行灌裝。乳糖酶在牛奶貯存的過程中可最大程度地水解乳糖。此法有酶使用量少,水解時間充足且水解率高,產(chǎn)品的褐變低等優(yōu)點(diǎn)。目前市場上的“新養(yǎng)道”和“營養(yǎng)舒化奶”都使用了此項(xiàng)技術(shù)。
TROISE等[17]采用兩種技術(shù)對意大利市場的6種低乳糖牛奶的質(zhì)量進(jìn)行研究,條件是在室溫(22±3)℃下儲存180 d,結(jié)果顯示分批次添加乳糖酶對貨架期內(nèi)的牛奶品質(zhì)不會產(chǎn)生影響,而對無菌添加技術(shù)而言,商業(yè)乳糖酶制劑內(nèi)的蛋白水解酶活性會影響在貨架期內(nèi)低乳糖牛奶的感官特性和營養(yǎng)價值。TOSSAVAINEN等[18]采用包裝內(nèi)無菌添加技術(shù)和分批次添加技術(shù)這2種工藝(10 ℃水解20 h)生產(chǎn)出超高溫瞬時滅菌牛乳,同時,生產(chǎn)出未經(jīng)乳糖水解的超高溫瞬時滅菌牛乳,并對這些牛乳在貯存過程中蛋白質(zhì)的水解情況進(jìn)行對比,結(jié)果表明使用2種乳糖酶水解技術(shù)生產(chǎn)出的牛乳在儲存過程中,蛋白質(zhì)的水解程度均較大,但無顯著差異。然而將其放置在5 ℃下貯存時,牛乳中的蛋白質(zhì)幾乎不水解。
在乳制品的加工生產(chǎn)中,利用乳糖酶生產(chǎn)低乳糖制品或口服乳糖酶制劑,可使“乳糖不耐癥”問題得到有效解決。同時,通過乳糖酶的催化轉(zhuǎn)移作用,可以生產(chǎn)乳清糖漿和功能性低聚半乳糖。利用乳糖酶生產(chǎn)的許多乳產(chǎn)品在國外已經(jīng)上市,如低乳糖奶、奶酪冰淇淋、乳糖水解奶等,包括生產(chǎn)干酪和奶粉,牛奶經(jīng)過乳糖酶水解以后有很多優(yōu)點(diǎn),滋味和奶香味增加,口感得到改善等。本文從以下5個方面詳細(xì)介紹其在低乳糖乳制品中的應(yīng)用。
工業(yè)上一般用乳糖酶對牛奶或其他乳制品中的乳糖進(jìn)行預(yù)處理來生產(chǎn)低乳糖食品。牛奶中的乳糖水解率達(dá)到70%,就能避免乳糖不耐癥的發(fā)生[19]。牛奶或其他乳制品中的乳糖甜度很低,只有蔗糖的20%,而乳糖被乳糖酶分解得到的葡萄糖和半乳糖,其甜度與蔗糖相當(dāng),這兩種單糖被腸道吸收進(jìn)入血液,使乳制品的甜度明顯增強(qiáng)而不增加熱量。由此可見,飲用低乳糖乳制品不僅能有效解決乳糖不耐癥患者的難題,還能作為一種低熱量的健康食品,滿足孕婦、手術(shù)后病人、中老年人和減肥人群的需要。INGE等[20]研究了人飲用低乳糖脫脂奶對血漿胰島素和血糖的影響,結(jié)果顯示,低乳糖脫脂奶對糖尿病人也非常適合。
乳糖酶水解后得到的低乳糖奶,可采用噴霧干燥技術(shù)得到低乳糖奶粉,有較多優(yōu)點(diǎn),如風(fēng)味濃郁、口感和沖調(diào)性較好、用途多以及人群適用廣等[21]。缺點(diǎn)是這種低乳糖奶粉吸濕性更強(qiáng),存在干粉粘附塔壁的問題,引起焦粉或者塔落。此外,經(jīng)乳糖酶水解后單糖還原性增加,奶粉在高溫加工過程中更容易出現(xiàn)美拉德反應(yīng),產(chǎn)生異味。因此,應(yīng)在低溫下收集低乳糖奶粉,但低溫又會影響殺菌問題,這些問題還需要進(jìn)一步研究。
FERREIRA等[22]用5種不同的乳糖水解率研究對奶粉的影響,結(jié)果顯示奶粉與設(shè)備的黏附力隨著乳糖水解率的增加而增大。同時,褐變程度也變大,顆粒團(tuán)聚程度變高,但復(fù)水能力有所降低。SHRESTHA等[23]將經(jīng)乳糖酶水解后的脫脂奶進(jìn)行噴霧干燥制備成脫脂奶粉,在設(shè)備干燥器內(nèi)壁上粘附了大量乳粉,旋風(fēng)分離器中僅得到25%的回收率。
乳糖的溶解度很低,與蔗糖相比,只有其1/10。把乳制品進(jìn)行冷凍濃縮可以有效保存牛奶的風(fēng)味和品質(zhì)。牛奶在濃縮和冷凍的過程中,冷凍乳中一部分鈣鹽與呈溶解狀態(tài)的乳糖發(fā)生結(jié)合,當(dāng)乳糖結(jié)晶時,鈣鹽作用于乳蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)有沉淀現(xiàn)象發(fā)生。原因是乳糖水合物的生成會導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生脫水作用,其膠粒的穩(wěn)定性遭到破壞,且乳糖極易析出晶體。冷凍乳糖結(jié)晶現(xiàn)象在乳制品或冷凍制品中會使產(chǎn)品出現(xiàn)砂狀組織的現(xiàn)象,在食用這些產(chǎn)品時口中有沙樣感,直接對產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生不利影響。在冰淇淋或其他乳制品的加工過程中,添加20%~30%乳糖酶,乳糖經(jīng)乳糖酶水解后,不僅可以避免沙狀口感的產(chǎn)生及蛋白質(zhì)的聚集,還會增加甜度和奶香味,減少蔗糖的用量,使冰淇淋的冰點(diǎn)降低。在低溫條件下,冰淇淋的抗融化性提升,蛋白的穩(wěn)定性增加[24]。因此,利用乳糖水解牛奶生產(chǎn)出的冰激凌冰點(diǎn)更低、無砂質(zhì)、質(zhì)地更軟。
ABBASI等[25]使用不同乳糖水解率的巴氏殺菌低乳糖奶生產(chǎn)冰激凌,結(jié)果顯示,冰激凌的甜度、表觀黏度及融化率隨著乳糖水解率的增加而提高。而沙度、冰點(diǎn)、硬度呈下降趨勢。SUEBSIRI等[26]研究結(jié)果表明,無乳糖冰激凌融化速率比普通冰激凌快,而硬度卻明顯降低。王貴芳[27]研究得出在冰淇淋的制作過程中,部分或全部的牛乳固形物可以使用水解后的脫鹽乳清粉代替,不僅能使返沙現(xiàn)象減少,還能降低成本,并且不影響產(chǎn)品的融化性、膨脹率和風(fēng)味,使冰淇淋的硬度大大降低。
在乳清中,超過99.8%的碳水化合物是乳糖。乳清主要在食品生產(chǎn)中應(yīng)用,例如制備各種各樣的糖果和點(diǎn)心等,不足之處是利用率還達(dá)不到50%,剩余的乳清里生化需氧量(Biochemical Oxygen Demand,BOD)高達(dá)4 500 g/L,一般是制備成附加值不高的產(chǎn)品或被當(dāng)成污染物來處理[28]。若用乳糖酶水解乳清中的乳糖來生產(chǎn)葡萄糖和半乳糖,甜度大幅度提升,可達(dá)到蔗糖甜度的65%~80%,溶解度更是增大了3~4倍,這種狀態(tài)下乳清變成乳清糖漿。乳糖在蛋糕、面包、月餅的加工中可替代蔗糖和卵蛋白,在生產(chǎn)牛乳軟糖中還可代替加糖濃縮牛乳,不會有沙包、紋理、焦糖和乳糖結(jié)晶現(xiàn)象的發(fā)生,極大地改善了產(chǎn)品的外觀質(zhì)量和風(fēng)味。乳清糖漿還能夠生產(chǎn)乳清飲料和乳清酒等。在葡萄糖異構(gòu)酶的作用下,乳清糖漿可以將葡萄糖異構(gòu)為果糖,甜度相當(dāng)于同等濃度的蔗糖,可以作為各種點(diǎn)心、飲料、罐頭食品的甜味劑取代蔗糖,起到很好的效果[29]。
乳糖酶能夠催化乳糖中的半乳糖苷鍵水解,除生成單糖外,還有半乳糖苷,其在半乳糖苷的作用下會轉(zhuǎn)移至乳糖分子中生成低聚糖(GOS),包括異乳糖、低聚半乳糖等。低聚糖分子量小,不黏稠,不能被小腸消化吸收,屬于一種水溶性膳食纖維,有防腹瀉、潤腸通便等功效,由于甜度和熱量很低,口腔酶液不能將其分解,也不能被鏈球菌利用,所以食用后基本上不會使血糖血脂升高,也不會引起齲齒。低聚糖比一般的膳食纖維多出很多優(yōu)點(diǎn),如較強(qiáng)的耐酸性、耐熱性,良好的保濕性,口感清爽,金屬離子不被束縛等,常被添加到加工溫度較高的產(chǎn)品如焙烤食品、酸性食品和飲料中,還能和其他酶一起使用,實(shí)現(xiàn)對干酪、冰淇淋等制品中乳糖含量的快速檢測[30]。隨著人們對健康的重視,低聚半乳糖生產(chǎn)和應(yīng)用也越來越廣泛,低聚半乳糖在未來市場上將會有很大的發(fā)展前景。
近幾年,越來越多的學(xué)者開始研究乳糖酶制備低聚半乳糖,如HSU等[31]在溫度為45 ℃、pH值為6.8的反應(yīng)條件下,采用40%的乳糖為底物,在雙歧桿菌乳糖酶的作用下,生產(chǎn)低聚半乳糖,高達(dá)32.5%的產(chǎn)率。PARK等[32]對高溫乳糖酶進(jìn)行了研究發(fā)現(xiàn),在溫度為80 ℃、pH值為6.0,反應(yīng)時間是56 h的條件下,來自硫化葉菌的耐高溫乳糖酶以乳糖為底物,制備的低聚半乳糖產(chǎn)率高達(dá)52.2%。許牡丹等[33]在pH值為6.0、反應(yīng)溫度55 ℃的條件下,研究了用米曲霉乳糖酶以40%乳糖為底物,并反應(yīng)32 h后,得到的低聚半乳糖的產(chǎn)率為32.4%。
生產(chǎn)發(fā)酵乳的過程中,牛乳中的乳糖在乳酸菌的作用下降解生成乳酸。普通乳酸中含有的乳糖為2%~4%,不能滿足對于乳糖不耐癥嚴(yán)重患者的需求[34]。在發(fā)酵前或發(fā)酵中可以加入乳糖酶來生產(chǎn)無乳糖酸乳,能使反應(yīng)速率加快,水解生成的單糖發(fā)酵潛力比乳糖大,能夠加快產(chǎn)酸速度。乳酸菌的菌數(shù)增多,可延長乳制品的貨架期,有較大的黏度。在褐色發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)中,褐變處理后、發(fā)酵前添加乳糖酶,能縮短發(fā)酵時間,形成特有的乳香風(fēng)味[35]。同時,用乳糖酶水解牛乳生產(chǎn)酸乳、速凍酸奶酪這種含有活的乳酸菌時,能縮短15%~20%牛乳凝固時間。乳糖酶分解乳糖后增加了酸乳的甜度,可節(jié)省蔗糖的用量,對酸乳的口感和風(fēng)味起到改善作用,用乳糖酶制備水果酸乳時,會增強(qiáng)水果的風(fēng)味。在奶酪生產(chǎn)中,采用水解程度為50%的乳糖酶乳制備干酪時,可縮短凝乳時間,且脫水收縮較好,凝塊堅(jiān)實(shí),減少排除乳清時造成的損失,凝乳破碎或細(xì)屑較少,干酪形成快且能增加10%的產(chǎn)量,提高了干酪回收率[36]。
NAGARAJ等[37]以牛乳為原料,分別用50%和70%的乳糖水解率生產(chǎn)酸乳,風(fēng)味和口感相比普通酸乳更優(yōu),但是采用90%的乳糖水解率生產(chǎn)出的低乳糖酸乳,甜度很高而黏度降低。SCHMIDT等[38]研究表明使用水解牛乳制備低乳糖酸奶,會提高胞外多糖合成量,使產(chǎn)品的口感和風(fēng)味得到改善。徐愛才等[39]在70%乳糖水解率的牛乳中接入發(fā)酵劑,來制作低乳糖酸奶,與普通酸奶相比,乳酸菌發(fā)酵速度更快,在貯藏的過程中,后酸化的速度較慢,產(chǎn)品黏度增加,活菌數(shù)增多,風(fēng)味物質(zhì)的含量增多,品質(zhì)提升。
我國的乳品行業(yè)目前正處于蓬勃發(fā)展的時期,隨著人們對乳制品營養(yǎng)作用認(rèn)識的提高,乳糖酶在乳制品領(lǐng)域的應(yīng)用會逐步地被深入研究,使乳糖不耐癥難題在根本上得到改善。在低乳糖乳制品生產(chǎn)中使用乳糖酶水解技術(shù)有較多的優(yōu)勢,同時也存在一些不足[40]。目前國內(nèi)外大型低乳糖乳制品加工生產(chǎn)中使用的乳糖酶全部依賴進(jìn)口,價格昂貴,乳糖酶不能回收和重復(fù)利用,生產(chǎn)成本較高,技術(shù)難度大,導(dǎo)致我國低乳糖奶的生產(chǎn)規(guī)模都比較小且分散,阻礙了低乳糖奶的推廣[41]。因此,在未來,應(yīng)不斷創(chuàng)新研發(fā)工藝和提高生產(chǎn)技術(shù),以研制低價、高純度、高質(zhì)量的乳糖酶為重心,以國內(nèi)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)乳糖酶為目的,實(shí)現(xiàn)乳糖酶生產(chǎn)低成本。乳糖酶的循環(huán)利用可以通過對其固定化來實(shí)現(xiàn),然而,此法在低乳糖乳制品工業(yè)生產(chǎn)上極易引起微生物污染,因此現(xiàn)階段還在對該方法進(jìn)行不斷的試驗(yàn)與研究。在未來,乳糖酶的固定化在一定范圍內(nèi)將部分代替游離酶法[42]。
由于乳糖水解為單糖,其甜度會增加3~4倍,使人不喜。單糖增加還會在熱處理及儲存過程中更易發(fā)生美拉德反應(yīng),導(dǎo)致乳制品褐變,從而影響產(chǎn)品的感官質(zhì)量。因此,降低產(chǎn)品的甜度也是低乳糖奶今后研究的一個重要內(nèi)容。在低乳糖乳制品生產(chǎn)中,減緩美拉德褐變可在水解后控制殺菌的溫度和時間,在包裝中充入氮?dú)獾确椒?。未來還需持續(xù)加大研發(fā)投入,突破各環(huán)節(jié)技術(shù)難題,對低乳糖乳制品的生產(chǎn)成本和控制褐變方面需不斷研究合適有效的方法,使低乳糖乳制品價格和風(fēng)味能夠迎合更多的消費(fèi)者。
低乳糖乳制品在國內(nèi)的品種類型不夠豐富,較單一,主要是超高溫瞬時滅菌牛乳占大部分,乳品企業(yè)應(yīng)不斷提高生產(chǎn)工藝,利用乳糖酶水解技術(shù)向甜牛乳、花色乳、巴氏殺菌牛乳等眾多領(lǐng)域開拓創(chuàng)新,不斷研究出對于我國消費(fèi)者而言較適合的低乳糖乳制品種類,使低乳糖乳制品因其優(yōu)質(zhì)品質(zhì)和良好口感能被更多的消費(fèi)者所認(rèn)可,擴(kuò)大我國低乳糖乳制品的市場占有率。隨著牛乳工業(yè)中乳糖酶的進(jìn)一步研究,已不僅僅是局限在解決乳糖不耐癥問題,如開發(fā)功能性乳制品等。而隨著乳糖酶的應(yīng)用越來越廣泛,乳糖酶還會在醫(yī)藥、環(huán)保、基因治療等多個領(lǐng)域起到重要作用,具有廣闊的市場前景。